一種含迷迭香酸的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?015104204159的分案申請(qǐng)，申請(qǐng)日為2015-07-16,申請(qǐng)名稱 為"一種凝血試劑用抗氧化劑"。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及一種含迷迭香酸的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑。
【背景技術(shù)】
[0003] 凝血測(cè)試屬于血栓性疾病檢查，其中，凝血酶時(shí)間（TT)為凝血功能檢查的一個(gè)重 要指標(biāo)，用于檢查血漿纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白能力。
[0004] 凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑的核心組份為凝血酶。凝血酶是一種多功能絲氨酸蛋白酶， 具有與胰凝乳蛋白酶相似的序列與結(jié)構(gòu)，含A、B兩條多肽鏈，由一個(gè)鏈間二硫鍵相連。B鏈 為功能鏈，具有典型的絲氨酸蛋白水解酶折疊結(jié)構(gòu)，含有1個(gè)位于兩個(gè)β折疊桶之間的活 性中心，2個(gè)外結(jié)合位點(diǎn)（ExositeI、ExositeII)。凝血酶功能團(tuán)和三維結(jié)構(gòu)，會(huì)因?yàn)槲?理和化學(xué)條件的變化而遭受破壞。
[0005] 凝血酶時(shí)間檢驗(yàn)是在手動(dòng)、半自動(dòng)或全自動(dòng)凝血儀上進(jìn)行的，它將診斷試劑與待 測(cè)血漿混合，以測(cè)定凝血時(shí)間。目前，凝血酶時(shí)間診斷試劑以干粉制劑為主，因?yàn)槔鋬龈稍?是保護(hù)凝血酶蛋白活性的一種有效方法。一般情況下，干粉試劑需要添加定量的復(fù)溶液或 去離子水使其復(fù)溶，恢復(fù)到凍干前的溶液狀態(tài)，但是，復(fù)溶過(guò)程耗時(shí)，同時(shí)，凝血酶的濃度與 凍干前會(huì)有差異，如果操作不當(dāng)，會(huì)引起凝血酶變性，導(dǎo)致凝血酶濃度值降低，凝血時(shí)間延 長(zhǎng)。
[0006] 與干粉狀凝血試劑相比，液態(tài)凝血酶試劑可克服復(fù)溶過(guò)程或凍干過(guò)程帶來(lái)的缺 陷，為用戶帶來(lái)使用的便捷，同時(shí)也提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和精確性，但是，液體試劑也 給研發(fā)者帶來(lái)了諸多挑戰(zhàn)性問(wèn)題。凝血酶屬于生物大分子，它的活性依賴于其自身的精細(xì) 空間結(jié)構(gòu)的維系。在液態(tài)狀態(tài)下，蛋白質(zhì)或酶的結(jié)構(gòu)比較脆弱，酸、堿、溫度、離子強(qiáng)度以及 其它某些化合物（包括重價(jià)金屬離子）的少量存在，都會(huì)引起這種空間結(jié)構(gòu)的改變，局部結(jié) 構(gòu)的微小變化也會(huì)引起蛋白質(zhì)或酶活性的喪失。凝血酶的變性或活性的降低，部分是由外 界因素引起的，但在一定條件下，蛋白質(zhì)或酶也會(huì)自分解，導(dǎo)致整體活性下降。因此，需要盡 量消除可能促使蛋白質(zhì)或酶發(fā)生自分解的條件。
[0007] 氧化是導(dǎo)致凝血酶失活或活性降低的重要原因之一，即某些特定的氨基酸殘基發(fā) 生反應(yīng)，導(dǎo)致凝血酶功能與結(jié)構(gòu)上變化，對(duì)氧化物的親和力增強(qiáng)，易于聚合、交聯(lián)而導(dǎo)致其 功能失活。
[0008] 蛋白質(zhì)類組織中的反應(yīng)性氧系包括羥基自由基，一般蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化都是由 自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引起，涉及去氫、電子傳遞、加成、斷裂和重排、二聚、歧化和取代，與脂肪氧 化一樣，同樣包括起始、傳遞與終止三個(gè)階段。因此，合適的抗氧化劑的加入，可保持液態(tài)凝 血酶試劑的穩(wěn)定性。
[0009] 在制備含抗氧化劑的凝血試劑方面，專利EP942284A2、US5506146、US5314695和 US8729022B2,提出加入氨基酸（主要是甘氨酸）作為抗氧化劑。
[0010] 根據(jù)查詢的文獻(xiàn)資料，凝血試劑中添加的抗氧化劑大概包括3類，一是氨基酸及 其衍生物，以甘氨酸為主要表現(xiàn)形式；二是酸性己糖衍生物，包括抗壞血酸；三是包括丁基 羥基茴香醚和丁基羥基甲苯在內(nèi)的其它抗氧化劑。
[0011] 在液態(tài)凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑中，根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究文獻(xiàn)檢索，大多采用多醇或多糖 類或鹽酸鹽作為凝血酶的穩(wěn)定劑，同時(shí)添加疊氮酸鈉作為抗菌劑或穩(wěn)定劑，這些穩(wěn)定劑的 選擇，基本上遵循了干粉凝血試劑的生產(chǎn)思路，在穩(wěn)定液態(tài)凝血試劑方面，效果并不盡如 意。如前所述，多醇或多糖類物質(zhì)，能夠提升凝血酶的穩(wěn)定性，但這類物質(zhì)的過(guò)量加入，會(huì)增 加混合液的粘度，從而降低采用光學(xué)法測(cè)定的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑的準(zhǔn)確度，而過(guò)量氯酸 鹽的加入，會(huì)提高溶液相的離子強(qiáng)度。疊氮酸鈉具有較好的抗菌性能，但是它的毒性較大。
[0012] 在實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在優(yōu)化傳統(tǒng)穩(wěn)定劑的基礎(chǔ)上，添加迷迭香 酸，并合理控制它的加入濃度，會(huì)很好地提升液態(tài)環(huán)境中凝血酶的穩(wěn)定性。它的加入，會(huì)蟄 合溶液相中不利于凝血酶穩(wěn)定的金屬離子，從而降低了二價(jià)金屬離子對(duì)凝血酶氧化反應(yīng)的 催化作用；同時(shí)，也會(huì)與過(guò)氧自由基發(fā)生反應(yīng)，終止蛋白質(zhì)過(guò)氧化鏈反應(yīng)，從而進(jìn)一步提升 了試劑的穩(wěn)定性能。
[0013] 在上述研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明基于抗氧化性的差異和濃度對(duì)產(chǎn)物的影響，提出以 含有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)和相對(duì)較小分子量的酚酸作為液態(tài)凝血酶試劑的抗氧化劑。更特別的， 選擇迷迭香酸作為不同凝血試劑的抗氧化劑，以提升不同凝血試劑的抗氧化性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的，是在常規(guī)凝血試劑的基礎(chǔ)上，提出一種高效、無(wú)毒的抗氧化劑，它 可以防止凝血試劑中蛋白質(zhì)的氧化，消除一般抗氧化劑抗氧化性能不足的問(wèn)題，為凝血試 劑（TT)帶來(lái)更好的抗氧化性。
[0015] 本發(fā)明提出的迷迭香酸屬于酚類的一類，按WBSSH的分類，大多數(shù)酚類都具有不 同程度的抗氧化性，但并不是所有的酚類都可以用于凝血試劑的抗氧化劑。有研究發(fā)現(xiàn)，蛋 白質(zhì)可以與酚類相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀[1] [2]，另一方面，Asano等[3] [4]認(rèn)為，含有 脯氨酸殘基的蛋白質(zhì)在與酚類類化合物絡(luò)合時(shí)容易產(chǎn)生沉淀，因?yàn)楦彼釟埢蚱渌杷?性氨基酸含量高的蛋白質(zhì)對(duì)酚類的親和力比較強(qiáng)。因此，并不是所有的酚類都可以用于凝 血試劑，尤其是TT測(cè)定試劑的抗氧化劑。
[0016] TT測(cè)定試劑的主要組成為凝血酶。為了驗(yàn)證酚類對(duì)凝血酶活性的影響，本發(fā) 明將一定濃度的凝血酶與不同類型的酚類混合，采用發(fā)光基物濃度的變化，確定不同類 型的酚類對(duì)凝血酶活性的影響。具體地，用Sonder等人[5]提出的方法，測(cè)定發(fā)光基物 D-Phe-Pip-Arg-pNA的水解程度，以確定人凝血酶的活性，S卩用96孔酶標(biāo)儀測(cè)定415nm處的 吸光度值，每孔中加入發(fā)光基物，同時(shí)加入與酚類預(yù)培養(yǎng)后的人凝血酶。確定各吸光曲線中 最大反應(yīng)值，并根據(jù)曲線估算IC50值，即凝血酶酰胺分解活性抑制50%時(shí)對(duì)應(yīng)的酚類的濃 度。
[0017]結(jié)果表明，在選擇的酚類中，不同的酚類對(duì)凝血酶的活性影響不同，添加表兒茶酸 和兒茶酸時(shí)，導(dǎo)致人凝血酶活性減少50%時(shí)對(duì)應(yīng)的添加濃度較高，介于130-150mM之間；添 加單寧酸時(shí)，即使較低的濃度（1. 42mM)，也將使人凝血酶的濃度減少50%。丹酚酸或迷迭 香酸對(duì)凝血酶活性的影響，受加入濃度的影響，當(dāng)加入濃度介于0. 01-2mM時(shí)，基本不影響 凝血酶的活性，同時(shí)提升試劑穩(wěn)定效果。同時(shí)，黃酮類酚類對(duì)人凝血酶具有最大的抑制效 果，這與Jedinak[6]和Mozzicafreddo[7]等人的研究結(jié)果是吻合的。這一結(jié)論，也可以根 據(jù)Liu[8]、Li[9]和Shi[10]等人從分子對(duì)接方面的研究結(jié)果得到驗(yàn)證，他們的研究表明， 在黃酮結(jié)構(gòu)的B環(huán)中，-OH基越多，對(duì)凝血酶的抑制就越大；黃酮結(jié)構(gòu)的B環(huán)與C環(huán)，會(huì)分別 與凝血酶結(jié)構(gòu)中的S1鏈袋和S2鏈袋反應(yīng)，A環(huán)會(huì)部分地與凝血酶S3鏈袋反應(yīng)，而B環(huán)中 的3' -羥基與4' -羥基官能團(tuán)，以及C環(huán)上的其它3' -羥基團(tuán)，都會(huì)抑制凝血酶的活性。
[0018] 本發(fā)明在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步說(shuō)明，雖然酚類都具有不同程度的抗氧化性， 但并非所有的酚類都可以用于凝血試劑的抗氧化劑或穩(wěn)定劑。
[0019] 在實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，從抗氧化性相對(duì)強(qiáng)弱出發(fā)，提出以迷迭香酸作為凝血試劑 的抗氧化劑。
[0020] 本發(fā)明的凝血試劑用抗氧化劑，為酚酸，具體為迷迭香酸。
[0021] 本發(fā)明所述的迷迭香酸，含有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，鄰苯二酚結(jié)構(gòu)具有如下的優(yōu)勢(shì)：
[0022] 1)鄰苯二酚結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的金屬離子蟄合能力，從而降低了二價(jià)金屬離子對(duì)氧化 反應(yīng)的催化作用，特別地，在制備凝血試劑的過(guò)程中，所用原料中的少量重金屬離子，會(huì)破 壞組織因子或凝血酶的穩(wěn)定。因此，它起到Η)ΤΑ鈉鹽或鉀鹽及部分氨基酸對(duì)金屬離子的螯 合作用。
[0023] 2)鄰苯二酚結(jié)構(gòu)能夠與過(guò)氧自由基發(fā)生反應(yīng)，從而終止蛋白質(zhì)氧化或脂質(zhì)過(guò)氧化 鏈反應(yīng)，這一點(diǎn)對(duì)含有凝血酶的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑更為重要。
[0024] 另一方面，當(dāng)酚酸的分子量較大時(shí)，會(huì)含有較多的酚羥基，這樣可以增加酚酸與蛋 白質(zhì)之間的反應(yīng)機(jī)率，易于形成酚酸（或酚類）_蛋白質(zhì)的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不穩(wěn) 定。因此，本發(fā)明在選擇酚酸類時(shí)，盡量選擇分子量較小的含有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的酚酸類。同 時(shí)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究，優(yōu)選迷迭香酸。
[0025] 本發(fā)明優(yōu)選的迷迭香酸，分子式為C1SH160S，分子量為360。作為天然抗氧化劑，迷 迭香酸具有極強(qiáng)的清除自由基的活性，其抗氧化性強(qiáng)于咖啡酸、綠原酸、葉酸等。西北輕工 業(yè)學(xué)食品工程系進(jìn)行的評(píng)價(jià)試驗(yàn)證明，迷迭香酸抗氧化劑具有比丁基羥基甲苯更強(qiáng)的抗氧 化作用[11]。根據(jù)鄒坤[12]等人的研究，迷迭香酸抗氧化作用機(jī)理包括直接與活潑自由基 反應(yīng)，即阻斷自由基鏈的傳鏈過(guò)程，從而阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；與誘導(dǎo)氧化的過(guò)渡金屬離子 (包括二價(jià)鐵離子）絡(luò)合，達(dá)到抗氧化效果。
[0026] 在本發(fā)明中，所述迷迭香酸在TT測(cè)定試劑中的濃度為0.01_2mM。
[0027] 本發(fā)明的目的，是提供一種采用迷迭香酸作為抗氧化劑的TT凝血試劑，由含有 25U/ml人凝血酶、2 %牛血清白蛋白、1. 5mM迷迭香酸、0. 05 %的疊氮酸鈉、3. 5 %蛋氨酸、 1. 5%PEG、3%甘露醇、2. 5%麥芽糖和10mM氯化鈣的Tris-HCl緩沖液組成，其中的百分比 均為質(zhì)量體積比，pH為7. 4。
[0028] 上述含迷迭香酸的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑的制備方法，步驟如下：配制Tris濃 度50mM、pH7. 4的緩沖液，向該緩沖液中，加入終濃度分別為2%的BSA、1. 5mM迷迭香酸、 0. 05 %的疊氮酸鈉、3. 5 %的蛋氨酸、1. 5 %的PEG、3 %的甘露醇、2. 5 %的麥芽糖、10mM的氯 化鈣，其中除氯化鈣外，其余均為質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)；將上述混合液用0. 22微米濾膜過(guò)濾，在濾 液中加入人凝血酶凍干制劑，使終濾液中人凝血酶的濃度為25U/ml，得到TT測(cè)定試劑。
[0029]本發(fā)明所述迷迭香酸，可以配合其它抗氧化劑共同使用，以進(jìn)一步提升凝血試劑 的抗氧化能力，改善凝血試劑的穩(wěn)定性能。所述的其它抗氧化劑包括酸類抗氧化劑如抗壞 血酸，氨基酸類抗氧化劑如甘氨酸、蛋氨酸，這類添加劑的加入量，可按一般凝血試劑中的 加入量添加。
[0030] 由于酚類能夠抑制包括絲氨酸蛋白酶在內(nèi)的許多酶的活性[13]，且酚類和蛋白質(zhì) 能相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀，因此，目前少有將酚類物質(zhì)用作凝血試劑穩(wěn)定劑的報(bào)道。而本 發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在凝血試劑中加入一種或多種酚類，可顯著提升混合液的穩(wěn)定性。本發(fā)明通過(guò)抗 自由基活性分析，確定了適合的酚類類型為迷迭香酸；同時(shí)，對(duì)酚類和凝血酶之間的反應(yīng)作 了分析，并在此基礎(chǔ)上，提出了制備凝血酶時(shí)間試劑中迷迭香酸的加入的濃度值。本發(fā)明 通過(guò)對(duì)酚類種類及濃度