Psa測(cè)定方法及其試劑的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/JP2012/058056,國(guó)際申請(qǐng)日為2012年3月28日，中國(guó) 申請(qǐng)?zhí)枮?01280014696. 2,發(fā)明名稱為"PSA測(cè)定方法及其試劑"的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及抗原測(cè)定方法以及試劑，其使得能夠通過免疫凝集測(cè)量游離抗原和樣 品中游離抗原與共存物質(zhì)的復(fù)合物，以獲得等摩爾反應(yīng)。特別地，本發(fā)明涉及前列腺特異性 抗原的測(cè)定方法，及其試劑。
【背景技術(shù)】
[0003] 前列腺癌是見于男性的一種惡性疾病。在美國(guó)和歐洲，大量患者受到前列腺癌的 折磨。近年來，在日本，患前列腺癌的患者的數(shù)量迅速增加。由于前列腺癌發(fā)展緩慢，可以 有效地通過放射療法或抗雄性激素療法治療，因此重要的是在早期階段發(fā)現(xiàn)前列腺癌。
[0004] 前列腺特異性抗原（以下可稱作"PSA"）是由前列腺上皮細(xì)胞分泌的糖蛋白（絲 氨酸蛋白酶），分子量為33, 000-34,OOODa。由于患前列腺疾病的人與健康人相比表現(xiàn)出 血液中PSA水平的增加，所以PSA對(duì)于前列腺疾病（特別是前列腺癌）的早期檢測(cè)是有用 的。PSA分為與血液中蛋白酶抑制劑相結(jié)合的復(fù)合物類型的PSA和游離PSA(以下可稱為 "fPSA"）。血液中的大部分PSA是復(fù)合物類型的PSA，以PSA與α1-抗胰凝乳蛋白酶的復(fù) 合物（以下可稱為"PSA-ACT"）、PSA與α2-巨球蛋白的復(fù)合物等的形式存在。fPSA和 PSA-ACT可以通過免疫測(cè)定法進(jìn)行測(cè)量。
[0005] 利用乳膠等的基于凝集反應(yīng)的測(cè)定（免疫凝集測(cè)定）被用作免疫測(cè)定。然而，由 于抗PSA單克隆抗體與fPSA和PSA-ACT具有不同的反應(yīng)性，所以可能難以準(zhǔn)確測(cè)量PSA總 水平。
[0006] 為了解決上述問題，PTL1提出了一種免疫凝集測(cè)定試劑及使用其進(jìn)行的測(cè)定，其 中免疫凝集測(cè)定試劑包括：（1)包括其上固定化了第一單克隆抗體的第一不溶載體顆粒的 第一顆粒懸浮液，所述第一單克隆抗體能夠結(jié)合游離測(cè)量目標(biāo)物質(zhì)和游離測(cè)量目標(biāo)物質(zhì)與 相應(yīng)結(jié)合分子的復(fù)合物，（2)包括其上固定化了第二單克隆抗體的第二不溶載體顆粒的第 二顆粒懸浮液，所述第二單克隆抗體能夠結(jié)合游離測(cè)量目標(biāo)物質(zhì)和游離測(cè)量目標(biāo)物質(zhì)與相 應(yīng)結(jié)合分子的復(fù)合物，但不與第一單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)，以及（3)包括其上固定化了第三單克 隆抗體的第三不溶載體顆粒的第三顆粒懸浮液，所述第三單克隆抗體不識(shí)別游離測(cè)量目標(biāo) 物質(zhì)，但識(shí)別游離測(cè)量目標(biāo)物質(zhì)與相應(yīng)結(jié)合分子的復(fù)合物。
[0007] PTL 2提出了一種測(cè)定試劑及使用其進(jìn)行的測(cè)定，其中所述測(cè)定試劑如下調(diào)節(jié)與 游離抗原和復(fù)合物類型的抗原的反應(yīng)性：使用在兩種或更多種類型的粒度不同的載體中具 有較小粒度并且其上固定化了至少一種單克隆抗體的載體，所述至少一種單克隆抗體是三 種與游離抗原和復(fù)合物類型的抗原具有反應(yīng)性但識(shí)別位點(diǎn)不同的單克隆抗體中的單克隆 抗體；并且使用其上固定化了其余的單克隆抗體的所述兩種或更多種載體中具有較大粒度 的載體。
[0008]PTL3提出了一種兩步反應(yīng)的免疫測(cè)定法，包括（1)使包括游離測(cè)量目標(biāo)物質(zhì)和 復(fù)合物類型的測(cè)量目標(biāo)物質(zhì)的樣品與其上固定有針對(duì)測(cè)量目標(biāo)物質(zhì)的單克隆抗體1的乳 膠1接觸，獲得反應(yīng)產(chǎn)物1，以及（2)使反應(yīng)產(chǎn)物1與其上固定有與單克隆抗體1識(shí)別位點(diǎn) 不同的單克隆抗體2的乳膠2接觸，獲得反應(yīng)產(chǎn)物2。
[0009]PTL4提出了一種前列腺特異性抗原免疫測(cè)定試劑及使用其進(jìn)行的測(cè)定，其中免 疫測(cè)定試劑包括其上固定有與游離PSA和PSA復(fù)合物有反應(yīng)性的單克隆抗體1的乳膠1， 以及其上固定有與游離PSA和PSA復(fù)合物有反應(yīng)性的單克隆抗體2的乳膠2,單克隆抗體2 與單克隆抗體1的識(shí)別位點(diǎn)不同，并且乳膠2與乳膠1的平均粒度不同。
[0010] 引證文件列表
[0011] 專利文獻(xiàn)
[0012] PTL 1JP-A-2001-108681
[0013] PTL 2：W02006/068206
[0014] PTL 3 JP-A-2007-163319
[0015]PTL 4:日本專利No. 4241301
[0016] 發(fā)明概述
[0017] 技術(shù)問題
[0018] 然而，當(dāng)使用PTL1公開的方法時(shí)，當(dāng)PSA-ACT的混合比增加的時(shí)候，觀察到相對(duì) 測(cè)定值下降（參見將具有〇. 78μπι的平均粒度且其上固定化了抗PSA的單克隆抗體的聚 苯乙烯乳膠、fPSA和PSA-ACT以不同比例混合時(shí)的測(cè)定結(jié)果）。特別地，當(dāng)僅使用PSA-ACT 時(shí)，游離PSA的相對(duì)測(cè)定值為81. 43%且沒有獲得等摩爾反應(yīng)。PTL2公開的方法的問題是 需要聯(lián)合使用不同粒度的乳膠，PTL3公開的方法的問題是需要實(shí)施兩步反應(yīng)，其中在第一 單克隆抗體反應(yīng)后使第二單克隆抗體反應(yīng)。PTL4公開的方法也有需要聯(lián)合使用不同粒度 的乳膠的問題。PTL4公開了比較例，其中使用了具有相同平均粒度（0.22μπι)的乳膠。但 是，沒有使用凝集促進(jìn)劑，且沒有獲得等摩爾反應(yīng)。
[0019] 鑒于上述情況，期望開發(fā)能夠更容易并更準(zhǔn)確測(cè)定PSA總水平（即能通過免疫測(cè) 定測(cè)量的fPSA和PSA-ACT的總和）的方法。
[0020] 特別地，本發(fā)明的目的是提供通過一步反應(yīng)且不使用具有不同平均粒度的載體來 容易并準(zhǔn)確地測(cè)量PSA的測(cè)定方法，以及使用的試劑。請(qǐng)注意本文中使用的表述"PSA的測(cè) 量"或"PSA的測(cè)定"指PSA總水平的測(cè)量或測(cè)定，除非另有說明。
[0021] 問題的解決方案
[0022] 實(shí)現(xiàn)上述目的的本發(fā)明的幾個(gè)方面包括下述方面。
[0023] (1) -種PSA測(cè)定方法，所述測(cè)定方法包括：使用其上固定化了兩種類型的抗PSA 單克隆抗體的不溶載體，使該不溶載體在存在凝集促進(jìn)劑的條件下與樣品接觸，其中所述 兩種類型的抗PSA單克隆抗體能夠與游離PSA和游離PSA與α1-抗胰凝乳蛋白酶的復(fù)合 物（PSA-ACT)二者均反應(yīng)且識(shí)別不同的表位，而且所述不溶載體具有大于0.20μπι且等于 或小于0. 40μm的相同的平均粒度。
[0024] (2)根據(jù)⑴的PSA測(cè)定方法，其中所述凝集促進(jìn)劑是選自聚乙二醇、多糖、聚乙烯 吡咯烷酮、聚氯乙烯、聚-γ-谷氨酸和聚（2-甲基丙烯?；趸一姿崮憠A）的一種或 多種凝集促進(jìn)劑。
[0025] (3)根據(jù)⑴的PSA測(cè)定方法，其中所述不溶載體是選自包含衍生于以下的物質(zhì)的 顆粒的一種或多種類型的不溶載體：合成聚合物的乳膠顆粒、二氧化硅、氧化鋁、炭黑、金屬 化合物、金屬、陶瓷、和/或磁性體。
[0026] (4)根據(jù)（1)的PSA測(cè)定方法，其中調(diào)節(jié)所述凝集促進(jìn)劑的濃度以獲得對(duì)于游離 PSA和游離PSA與α1-抗胰凝乳蛋白酶的復(fù)合物（PSA-ACT)的等摩爾反應(yīng)。
[0027] (5)根據(jù)（2)的PSA測(cè)定方法，其中所述多糖是選自右旋糖酐、普魯蘭、和包括甲基 纖維素和乙基纖維素的烷基化多糖的一種或多種多糖。
[0028] (6)根據(jù)⑶的PSA測(cè)定方法，其中所述合成聚合物是選自聚苯乙稀、苯乙烯-磺 酸共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸 酯共聚物、和乙酸乙烯酯-丙烯酸酯共聚物的一種或多種合成聚合物。
[0029] (7)根據(jù)⑴至（6)任一項(xiàng)的PSA測(cè)定方法，其中所述兩種類型的抗PSA單克隆抗 體對(duì)游離PSA的解離常數(shù)（fKd)與對(duì)游離PSA和α1-抗胰凝乳蛋白酶的復(fù)合物（PSA-ACT) 的解離常數(shù)（cKd)的比值（fKd/cKd)為大于0. 1且等于或小于2. 0,并且對(duì)游離PSA的解離 常數(shù)（fKd)為10nM或更小。
[0030] (8)包含至少1)和2)的PSA測(cè)定試劑：
[0031] 1)通過使用其上固定化了兩種類型的抗PSA單克隆抗體的不溶載體制備的抗體 固定化（antibody-immobilized)載體，其中所述兩種類型的抗PSA單克隆抗體能夠與游離 PSA和游離PSA與α1-抗胰凝乳蛋白酶的復(fù)合物（PSA-ACT)二者均反應(yīng)且識(shí)別不同的表 位，而且所述不溶載體具有大于0. 20μm且等于或小于0. 40μm的相同的平均粒度；
[0032] 2)選自聚乙二醇、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、聚-γ-谷氨酸、和聚（2-甲基 丙烯?；趸一姿崮憠A）的一種或多種凝集促進(jìn)劑。
[0033] (9)根據(jù)⑴的PSA測(cè)定方法，其中所述兩種類型的抗PSA單克隆抗體對(duì)游離 PSA的解離常數(shù)（fKd)與對(duì)游離PSA和α1-抗胰凝乳蛋白酶的復(fù)合物（PSA-ACT)的解離 常數(shù)（cKd)的比值（fKd/cKd)為大于0. 1且等于或小于2. 0,并且對(duì)游離PSA的解離常數(shù) (fKd)為10nM或更小，所述凝集促進(jìn)劑是選自聚乙二醇、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、 聚-γ-谷氨酸、和聚（2-甲基丙烯?；趸一姿崮憠A）的一種或多種凝集促進(jìn)劑，并 且調(diào)節(jié)所述凝集促進(jìn)劑的量以獲得對(duì)游離PSA和游離PSA與α1-抗胰凝乳蛋白酶的復(fù)合 物（PSA-ACT)的等摩爾反應(yīng)。
[0034] 發(fā)明的有益效果
[0035] 根據(jù)本發(fā)明的所述方面的測(cè)定方法可以通過一步反應(yīng)且不使用具有不同平均粒 度的載體而容易并準(zhǔn)確地測(cè)量PSA。因此，能夠使用通用的自動(dòng)分析儀進(jìn)行高精度的測(cè)定， 而無需特殊設(shè)備。 具體實(shí)施方案
[0036](測(cè)量目標(biāo)物質(zhì)）
[0037] 本發(fā)明的實(shí)施方案的目標(biāo)為前列腺特異性抗原（PSA)(即測(cè)量目標(biāo)物質(zhì)）?？?