專利名稱：膽汁酸測定試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物診斷試劑，具體涉及一種膽汁酸測定試劑。
背景技術(shù)：
1974年挪威科明公司采用純制的3α-羥類固醇脫氫酶(3α-HSD)成功地生產(chǎn)出第一代酶法膽汁酸試劑，使膽汁酸的測定真正進(jìn)入到臨床領(lǐng)域?？偰懼釡y定方法較快，到目前為止已經(jīng)發(fā)展到第五代。
肝細(xì)胞損傷、肝流血量減少，和肝內(nèi)外門脈分流等，皆影響肝臟對膽汁酸的清除作用，從而使周圍中膽汁酸鹽含量增加膽管梗阻和膽汁淤滯時，膽汁酸鹽反流入血，使膽汁酸鹽濃度顯著升高。隱私，檢查血、尿中膽汁酸鹽能反映肝臟德攝取，合成及排泄功能。很多證據(jù)表明，膽汁酸的生成和代謝與肝臟有十分密切的關(guān)系，血清膽汁酸水平是反映肝實(shí)際損傷的一個重要指標(biāo)。
膽酸是在肝臟從膽固醇生成的24-碳類固醇化合物。在體液中被發(fā)現(xiàn)的以下四個膽酸形式占99％以上，四種膽酸形式分別為脫氧膽酸、石膽酸、鵝去氧膽酸、甘氨膽酸，其中甘氨膽酸又是膽酸主要的存在形式。檢測甘氨膽酸又具有十分重要的臨床意義，如肝細(xì)胞損傷程度，急性肝炎的病情觀察，判斷肝硬化等(詳見張宋英、候振江、王英文“甘氨膽酸診斷肝病的價值”《新消化病學(xué)雜志》1996.4(7)395-396)已有詳細(xì)報道。
目前，臨床上應(yīng)用的是第五代酶法測定膽汁酸試劑，該第五代酶法測定與原有的方法相比具有靈敏度高、對分析儀器污染弱等特點(diǎn)，但其試劑的穩(wěn)定性較差，測臨床低值樣本不夠準(zhǔn)確等，同時對血清中甘氨膽酸的反應(yīng)也不夠靈敏。因而，在應(yīng)用上存在一定局限.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，設(shè)計一種新的膽汁酸測定試劑，提高檢測中的靈敏度和試劑穩(wěn)定性。
本發(fā)明提供了一種膽汁酸測定試劑，該試劑包括兩個試劑組份試劑1甘氨酸 1.5g/L～3.75g/LThio-NAD 0.95g/LNaN31g/LTriton X-100 1ml/L丙酮酸鈉 0.1g/L～150g/L亞鐵氰化鉀 0.1g/L～100g/L試劑2二乙醇胺 6.0g/L～16.2g/L苯或烷基二醇 10ml/L～100ml/L硼氫化物 0.8g/L～10g/L3αHSD 12.5ku/LNaN31g/LTritoNX-100 1ml/Lα-糊精 5g/L～20g/LNADH 6g/L
本發(fā)明提供的膽汁酸測定試劑是發(fā)明人通過改進(jìn)試劑組份而實(shí)現(xiàn)了克服已有技術(shù)存在的缺陷。本發(fā)明人為提高試劑對甘氨酸的親和能力，在試劑1的組份中，添加了丙酮酸鈉和亞鐵氰化鉀；為提高試劑的穩(wěn)定性，在試劑2的組份中，添加了硼氫化物和烷基或苯基二醇作為穩(wěn)定劑，保護(hù)NADH的穩(wěn)定；為提高試劑對測低值標(biāo)本的準(zhǔn)確性，同時在試劑2的組份中，增加了α-糊精，有效地提高了試劑對樣本反應(yīng)的靈敏度。
上述添加試劑的濃度范圍為烷基二醇或苯二醇0.01％-10％硼氫化物0.01％-25％丙酮酸鈉0.01％-15％亞鐵氰化鉀0.01％-10％α-糊精0.01％-10％本發(fā)明人對本發(fā)明試劑的靈敏度、穩(wěn)定性和對甘氨膽酸的親和能力分別進(jìn)行了檢測，其結(jié)果如下一、提高試劑的靈敏度配制試劑1含有甘氨酸1.5g/L，Thio-NAD 0.95g/L，NaN31g/L，TritonX-100 1ml/L，丙酮酸鈉10g/L，亞鐵氰化鉀10g/L配制試劑2含有二乙醇胺16.2g/L，苯二醇10ml/L，硼氫化鈉10g/L，3αHSD 12.5ku/L，NaN31g/L，Triton X-100 1ml/L，NADH 6.0g/L


膽汁酸濃度(umol/L)＝ΔA樣本管/ΔA標(biāo)準(zhǔn)管*標(biāo)準(zhǔn)濃度按圖1測50μmol/l樣本，測得ΔA＝0.0500A/min在試劑2中添加α-糊精(分子量5000)18g/l后，按圖1測50μmol/l樣本，測得ΔA＝0.2000A/min靈敏度提高了300％，這樣對測低值樣本時更具有準(zhǔn)確性。
結(jié)果表明在試劑中添加α-糊精能有效提高試劑對樣本反應(yīng)的靈敏度。
二、檢測試劑的穩(wěn)定性配制試劑二乙醇胺16.2g/L，3αHSD 12.5ku/L，NaN31g/L，Triton X-1001ml/L，α-糊精(分子量5000)18g/L，NADH 6.0g得A溶液在405nm處檢測溶液A的吸光度，得下列結(jié)果

在A溶液基礎(chǔ)上添加苯二醇10ml/L和硼氫化鈉10gL后，在405nm處檢測試劑A的吸光度，得下列結(jié)果

試劑穩(wěn)定效果明顯結(jié)果顯示在試劑中添加了苯二醇和硼氫化鈉，使試劑穩(wěn)定性明顯得到了提高。
三、試劑對甘氨膽酸的親和能力的檢測配制試劑1甘氨酸15g/L，Thio-NAD 0.95g/L，NaN31g/L，TritoN X-1001ml/L配制試劑2二乙醇胺16.2g/L，苯二醇10ml/L，硼氫化鈉10g/L，3αHSD12.5ku/L，NaN31g/L，TritoN X-100 1ml/L，NADH 6.0g/L按圖1分別檢測40μmol/l的脫氧膽酸，石膽酸，鵝去氧膽酸，甘氨膽酸的樣本，得下列結(jié)果

在試劑1中添加入亞鐵氰化鉀10g/L和丙酮酸鈉10g/L后，依上法分別檢測40μmol/l的脫氧膽酸，石膽酸，鵝去氧膽酸，甘氨膽酸的樣本，得下列結(jié)果

通過實(shí)驗(yàn)表示，在試劑1中添加亞鐵氰化鉀和丙酮酸鈉，能使試劑對甘氨膽酸的結(jié)合能力得到明顯提高。
本發(fā)明所述的試劑中，硼氫化物可以為硼氫化鈉或硼氫化鉀；烷基或苯基二醇可以為乙二醇、丙二醇、丁二醇或苯二醇；α-糊精的分子量為1000～2000。
本發(fā)明試劑與酶循環(huán)法測定試劑同時對30例臨床樣本進(jìn)行了檢測，說明本發(fā)明的試劑是符合臨床檢測要求，與日本產(chǎn)品相符。
本發(fā)明提供的膽汁酸測定試劑具有穩(wěn)定性好，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，并增加了試劑對甘氨膽酸的親和能力強(qiáng)，因此，在臨床上有較好的應(yīng)用前景。


圖1本發(fā)明試劑與日本第一化學(xué)株式會社制的試劑對30例臨床樣本檢測應(yīng)。其中X橫座標(biāo)表示日本試劑Y縱座標(biāo)表示本發(fā)明試劑回歸方程Y＝1.001X+0.680；相關(guān)系數(shù)r＝0.998
具體實(shí)施例方式實(shí)例例1試劑1甘氨酸 1.5g/LThio-NAD0.95g/LNaN31g/LTriton X-1001ml/L丙酮酸鈉10g/L亞鐵氰化鉀 10g/L試劑2二乙醇胺16.2g/L苯二醇 10ml/L硼氫化鈉10g/L3αHSD 12.5ku/LNaN31g/LTriton X-1001ml/Lα-糊精(分子量5000) 18g/LNADH6.0g/L例2試劑1甘氨酸 3.75g/LThio-NAD0.95g/LNaN31g/L
Triton X-100 1ml/L丙酮酸鈉 5.7g/L亞鐵氰化鉀 105g/L試劑2二乙醇胺6g/L乙二醇 10ml/L硼氫化鉀5g/L3αHSD 12.5ku/LNaN31g/L吐溫20 0.5g/Lα-糊精(分子量3000) 20g/LNADH6.0g/L例3試劑1甘氨酸 1.5g/LThio-NAD0.95g/LNaN31g/LTriton X-1001ml/L丙酮酸鈉1g/L亞鐵氰化鉀 1g/L試劑2
二乙醇胺 16.2g/L丙二醇 50ml/L硼氫化鈉 1g/L3αHSD 12.5ku/LNaN31g/LTriton X-100 1ml/Lα-糊精(分子量20000) 18g/LNADH 6.0g/L例4試劑1甘氨酸 3.75g/LThio-NSD 0.95g/LNaN31g/LTriton X-100 1ml/L丙酮酸鈉 60g/L亞鐵氰化鉀 15g/LNacl 1g/L試劑2二乙醇胺 6.0g/L丁二醇 100ml/l硼氫化鉀 0.8g/L3αHSD 12.5ku/L
NaN31g/L吐溫200.5g/Lα-糊精(分子量1000) 5g/LNADH 6.0g/L
權(quán)利要求
1.一種膽汁酸測定試劑，其特征在于該試劑包括下列兩個試劑組份試劑1甘氨酸1.5g/L～3.75g/LThio-NAD 0.95g/LNaN31g/LTriton X-100 1ml/L丙酮酸鈉 0.1g/L～150g/L亞鐵氰化鉀0.1g/L～100g/L試劑2二乙醇胺 6.0g/L～16.2g/L苯基或烷基二醇10ml/L～100ml/L硼氫化物 0.8g/L～10g/L3αHSD12.5ku/LTritoNX-100 1ml/Lα-糊精 5g/L～20NADH 6g/L
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膽汁酸測定試劑，其特征在于其中所述試劑2中的硼氫化物為硼氫化鈉或硼氫化鉀；烷基或苯基二醇為乙二醇、丙二醇、丁二醇或苯二醇；α-糊精的分子量為1000～20000。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膽汁酸測定試劑，其特征在于所述下列組份在試劑中的添加范圍為烷基或苯二醇為0.01％～10％；硼氫化物為0.01％～25％；丙酮酸鈉為0.01％～15％；亞鐵氰化鉀為0.01％～10％；α-糊精為0.01％～10％。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種膽汁酸測定試劑。本發(fā)明的測定試劑包括試劑1和試劑2兩個組成部分，在本發(fā)明的試劑中添加了丙酮酸鈉和亞鐵氰化鉀等試劑，提高了試劑的穩(wěn)定性和靈敏度，并增加了試劑對甘氨酸的親和能力。
文檔編號G01N33/50GK1632578SQ20041009355
公開日2005年6月29日 申請日期2004年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月24日
發(fā)明者孫衛(wèi)兵 申請人:上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司