專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于檢測(cè)血清中甘膽酸含量的試劑盒(膠乳增強(qiáng)免疫比濁法)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定人血清中甘膽酸(CG)含量的試劑盒。
背景技術(shù)：
血清甘膽酸(CG)是膽酸與甘氨酸結(jié)合二次的結(jié)合型膽酸之一，在肝細(xì)胞內(nèi)，膽固醇經(jīng)過(guò)極其復(fù)雜的酶促反應(yīng)，轉(zhuǎn)變成初級(jí)膽汁酸。其中有膽酸(CA)和鵝去氧膽酸(CD-CA)。膽酸的類(lèi)固醇核上有三個(gè)羥基(C3、C7、C12)，側(cè)鏈末端的羥基以肽鍵與甘氨酸結(jié)合，分子量為 462U。CG正常代謝途徑為腸一肝循環(huán)，CG由肝細(xì)胞合成，經(jīng)毛細(xì)膽管、膽管排入膽囊，隨同膽汁進(jìn)入十二指腸，幫助食物消化。95%膽酸在回腸末端重吸收，經(jīng)門(mén)靜脈再回肝臟，由肝細(xì)胞攝取再利用。在血清中主要以蛋白結(jié)合形式存在，溢入體循環(huán)的總量小于1%。在正常情況下，外周血中膽酸含量甚微，正常成人無(wú)論空腹或餐后，其血清CG濃度穩(wěn)定在低水平。甘膽酸是肝臟分泌到膽汁中最大量的有機(jī)酸，進(jìn)入腸腔幫助脂肪消化吸收，在回腸和結(jié)腸大部分被重吸收，經(jīng)門(mén)靜脈入肝臟。肝細(xì)胞能高效能地從門(mén)靜脈攝取大量的甘膽酸，以致血液中的甘膽酸量小于I. 9g/ml。重吸收的甘膽酸又進(jìn)入肝腸循環(huán)，通過(guò)這種機(jī)制，機(jī)體能充分利用甘膽酸。一旦肝細(xì)胞病變，血中的甘膽酸濃度升高，其中急性肝炎、慢性肝炎輕度升高，肝硬變，肝癌病人顯著升高。當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，肝細(xì)胞攝取CG能力下降，致使血中CG含量增高；膽汁郁滯時(shí)，肝臟排泄膽酸發(fā)生障礙，而返流血液循環(huán)的CG含量增高，也使血CG含量增高。因此，測(cè)定血清甘膽酸(CG)是評(píng)價(jià)肝細(xì)胞功能及其肝膽系物質(zhì)循環(huán)功能的敏感指標(biāo)之一。目前已知的甘膽酸測(cè)定方法有放射免疫法(RIA)、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法等，
放射免疫分析步驟繁瑣，試劑價(jià)格昂貴，需使用配套的儀器且存在放射性污染。酶聯(lián)免疫吸附法存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜、重復(fù)性差、不適于急診和臨床病人及時(shí)診斷的需要。膠乳增強(qiáng)免疫比濁法操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，可適用于自動(dòng)化分析儀等優(yōu)點(diǎn)，適合于臨床樣本批量檢測(cè)，將為臨床肝病的診斷及診斷提供強(qiáng)有力的支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定人血清中甘膽酸含量的試劑盒，所述甘膽酸檢測(cè)試劑盒包括(I)甘膽酸Rl試劑；(2)甘膽酸R2試劑；(3)甘膽酸校準(zhǔn)品。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺點(diǎn)，提供一種具有高靈敏度和寬線(xiàn)性范圍的甘膽酸含量檢測(cè)試劑盒，同時(shí)具有準(zhǔn)確、自動(dòng)化檢測(cè)，適于臨床樣本大量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。所述甘膽酸檢測(cè)試劑盒包括試劑R1、試劑R2和校準(zhǔn)品，其中試劑R1，提供了試劑的反應(yīng)環(huán)境、控制反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)的時(shí)間和速率，為了保證試劑的穩(wěn)定性和反應(yīng)活性及使抗原位點(diǎn)充分暴露，試劑中包含電解質(zhì)、促凝劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑及緩沖液。試劑R2是一種含有抗甘膽酸的多克隆抗體包被膠乳顆粒的均一的乳白色液體，包含抗人甘膽酸多克隆抗體包被膠乳顆粒、電解質(zhì)、穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑及緩沖液。其中乳膠顆粒直徑為60-300nm。甘膽酸校準(zhǔn)品，用于與樣本比較進(jìn)行結(jié)果計(jì)算，包括防腐劑、電解質(zhì)、穩(wěn)定劑、甘膽酸抗原及緩沖液。本發(fā)明所述試劑盒的試劑Rl是一種使樣本中甘膽酸特異地抗原位點(diǎn)充分暴露，有利于與抗甘膽酸抗體充分結(jié)合的試劑。其中包括防腐劑O. 5-lg/L、穩(wěn)定劑O. 5_2g/L、表面活性劑l_5g/L、反應(yīng)促進(jìn)劑O. l_5g/L、電解質(zhì)O. 3-2g/L、其余為pH7. 0-8. O的50mmol/L緩沖液。本說(shuō)明所述試劑盒的試劑R2包含有兔抗人甘膽酸多克隆抗體的致敏膠乳顆粒，可特異性識(shí)別并結(jié)合血清中甘膽酸抗原，其中包括0. 2-3g/L的60-300nm膠乳顆粒、O. 5-lg/L防腐劑、O. 5-2g/L的穩(wěn)定劑、l_5g/L的表面活性劑、O. 3_2g/L的電解質(zhì)、ρΗ6· 5-7. 5 的 IOOmmoI/L 的緩沖液。本發(fā)明所述的甘膽酸校準(zhǔn)品，用來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，對(duì)測(cè)定結(jié)果計(jì)算，包括O. 5-lg/L防腐劑、O. 5-2g/L穩(wěn)定劑、l_5g/L的表面活性劑、O. 3-2g/L的電解質(zhì)，使用時(shí)用生理鹽水稀釋成多個(gè)不同濃度梯度作為參考校準(zhǔn)品。本發(fā)明所使用的兔抗人甘膽酸多克隆抗體，通過(guò)外購(gòu)獲得。本發(fā)明所述試劑盒的試劑R2中膠乳顆粒與抗甘膽酸多克隆抗體結(jié)合通過(guò)化學(xué)交聯(lián)法制備，穩(wěn)定性好，在2-8度可以保存12個(gè)月。而采用物理吸附法的膠乳抗體試劑，批間差異太大，而且穩(wěn)定性不好。本發(fā)明中所使用的反應(yīng)促進(jìn)劑可以使聚乙二醇2000、溴化乙二甲胺等。本發(fā)明中所使用的電解質(zhì)為鈉離子或鉀離子。本發(fā)明中所使用的緩沖液可以是甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液，優(yōu)選Tris緩沖液。本發(fā)明中所使用的防腐劑選自疊氮鈉、疊氮鋰、苯甲酸鈉、亞硝酸鈉中的一種或幾種。本發(fā)明中所使用的表面活性劑為非離子型表面活性劑,可以是Tween20、Tween40、Span40、Span80、TritonX-IOO 中的一種或幾種。本發(fā)明中所使用的穩(wěn)定劑選自蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽、金屬絡(luò)合劑、抗氧化劑中的一種或幾種。所述的蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白。所述的無(wú)機(jī)鹽選自氯化鈉或氯化鉀，所述的絡(luò)合劑為EDTA ;所述的助懸劑選自乙二醇、丙三醇、蔗糖、麥芽糖中的一種或幾種；所述抗氧化劑選自2，6_ 二叔丁基對(duì)甲酚、叔丁基羥基茴香醚、沒(méi)食子酸丙酯中的一種或幾種。本發(fā)明采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法，開(kāi)發(fā)出可檢測(cè)血清中甘膽酸的試劑。膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的反應(yīng)原理是包被了高特異性抗體的膠乳顆粒，與樣本中相應(yīng)的甘膽酸抗原發(fā)生特異性結(jié)合，形成不溶性的抗原-抗體-膠乳顆粒復(fù)合物，產(chǎn)生一定的濁度，其濁度的高低與樣本中的甘膽酸濃度成正比，在一定波長(zhǎng)下進(jìn)行濁度測(cè)定，即可測(cè)定樣本中被檢測(cè)甘膽酸的含量。本發(fā)明中，選取的檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm。采用本發(fā)明所述的試劑盒測(cè)定血清中的甘膽酸時(shí)，先將樣本與Rl混勻后37°C孵育5分鐘，然后加入試劑R2，混勻I分鐘后讀取吸光度A1, 5分鐘后讀取各管吸光度A2,計(jì)算吸光度差值，根據(jù)校準(zhǔn)曲線(xiàn)得到樣本中甘膽酸的含量。本發(fā)明采用數(shù)學(xué)模型Logit-Iog(4p)或Spline計(jì)算模式,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。本發(fā)明試劑盒與市售的甘膽酸檢測(cè)試劑盒相比，檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異，檢測(cè)結(jié)果可靠，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，適于臨床批量檢測(cè)。本發(fā)明所述的試劑盒，用于測(cè)定血清或尿液中抗體，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、線(xiàn)性范圍寬、適用于全自動(dòng)生化分析儀等優(yōu)點(diǎn)。


圖I所示是本發(fā)明試劑盒與對(duì)照試劑盒檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性比較。圖2所示是本發(fā)明試劑盒線(xiàn)性范圍實(shí)驗(yàn)，回歸方程。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定血清中甘膽酸的試劑盒試劑盒主要成分及濃度如下
試劑Rl
SOmmo I /T, pH7. 2O. 8g/LI. 5g/L2g/L0. 5g/L
0.8g/L
Tris緩沖液疊氮鈉
牛血清白蛋白TritonX-IOO聚乙二醇2000Nacl試劑R2
Tris緩沖液疊氮鈉
牛血清白蛋白Tween20溴化乙二甲胺Nacl
100mmol/L ρΗ7· 5O. 5g/L
2g/L
I.5g/L0. 8g/L
lg/L
包被有兔抗人甘膽酸多克隆致敏的膠乳顆粒，膠乳粒徑200nm，膠乳濃度O. 5%甘膽酸校準(zhǔn)品
30mmol/L pH7.0O. 4g/LO. 5g/L
0. 6g/L
Tris緩沖液疊氮鈉
牛血清白蛋白Nacl按照需要的甘膽酸參考校準(zhǔn)品濃度將相應(yīng)的甘膽酸純品分別加入上述緩沖液，制備得濃度為0. 5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L 的多濃度甘膽酸校準(zhǔn)品。二、試劑盒測(cè)定方法分析方法兩點(diǎn)終點(diǎn)法反應(yīng)方向上升反應(yīng)
校準(zhǔn)方式logit-log(4p)
測(cè)定波長(zhǎng)450nm測(cè)定溫度37°C
樣本R1 :R2= 5 :200 :50(ul)
操作步驟將200ul試劑Rl加入5ul樣本，37°C孵育5分鐘后加入50ul試劑R2，I分鐘后讀取吸光度Al，3分鐘后讀取吸光度A2。采用6點(diǎn)定標(biāo)法，用日立7020全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)，校準(zhǔn)品濃度分別為O. 5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L
實(shí)施例2
膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定血清中甘膽酸的試劑盒
一、試劑盒主要成分及濃度如下試劑Rl
Tris緩沖液疊氮鈉
牛血清白蛋白Span80
聚乙二醇2000Nacl試劑R2
Tris緩沖液疊氮鈉
牛血清白蛋白Span80
溴化乙二甲胺Nacl
SOmmoI /I,I. 2g/L2. Og/L2g/LO. 5g/L
I. 5g/
lOOmmol/L
0.5g/L
lg/L
1.2g/L0. 8g/L
lg/L
pH8. 0
pH7.
包被有兔抗人甘膽酸多克隆致敏的膠乳顆粒，膠乳粒徑200nm，膠乳濃度O. 5%
甘膽酸校準(zhǔn)品
30mmol/L pH7.0O. 4g/L
O.5g/L
0.6g/L
按照需要的甘膽酸參考校準(zhǔn)品濃度將相應(yīng)的甘膽酸純品分別加入上述緩沖液，制備得濃度為0mg/L、4mg/L、8mg/L、Im6g/L、32mg/L、64mg/L 的多濃度甘膽酸校準(zhǔn)品。二、試劑盒測(cè)定方法
Tris緩沖液疊氮鈉
牛血清白蛋白Nacl分析方法兩點(diǎn)終點(diǎn)法反應(yīng)方向上升反應(yīng)校準(zhǔn)方式logit-log(4p)
測(cè)定波長(zhǎng)450nm測(cè)定溫度37°C
樣本R1 :R2= 5 :200 :50(ul)
操作步驟將200ul試劑Rl加入5ul樣本，37°C孵育5分鐘后加入50ul試劑R2，I分鐘后讀取吸光度Al，3分鐘后讀取吸光度A2。采用6點(diǎn)定標(biāo)法，用日立7020全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)，校準(zhǔn)品濃度分別為0mg/L、4mg/L 、8mg/L、16mg/L、32mg/L、64mg/L
實(shí)施例3 :甘膽酸試劑盒性能評(píng)價(jià)
一、線(xiàn)性相關(guān)性
將實(shí)施例I配制的本發(fā)明是試劑盒與市售甘膽酸ELISA檢測(cè)試劑盒A，同時(shí)檢測(cè)46份血清樣本，比較本發(fā)明試劑盒與市售ELSIA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性。(結(jié)果見(jiàn)圖1，X，Y軸均為測(cè)定值，單位mg/L。)相關(guān)系數(shù)r=0. 9946，線(xiàn)性回歸方程為y=0. 9854x+0. 0623，結(jié)果表明發(fā)明試劑與酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性較好。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表I所示，回歸方程見(jiàn)附圖I。表I
權(quán)利要求
1.一種采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定血清中甘膽酸含量的試劑盒，其特征在于包含試劑Rl，R2以及校準(zhǔn)品，其中所述甘膽酸試劑Rl包含電解質(zhì)、促凝劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑及緩沖液；所述甘膽酸試劑R2包含甘膽酸多克隆抗體包被膠乳顆粒、電解質(zhì)、穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑及緩沖液；所述甘膽酸校準(zhǔn)品包含防腐劑、電解質(zhì)、穩(wěn)定劑、甘膽酸純品及緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，該試劑盒包括甘膽酸Rl試劑、甘膽酸R2試劑盒和甘膽酸校準(zhǔn)品，其中所述甘膽酸Rl試劑包含防腐劑O. 5-lg/L、穩(wěn)定劑O. 5-2g/L、表面活性劑l_5g/L、反應(yīng)促進(jìn)劑O. l_5g/L、電解質(zhì)O. 3-2g/L、其余為pH7. 0-8. O的50mmol/L緩沖液；所述R2試劑包含抗人甘膽酸的多克隆抗體包被膠乳顆粒，其中包括0. 2-3g/L的60-300nm膠乳顆粒、O. 5-lg/L防腐劑、O. 5_2g/L的穩(wěn)定劑、l_5g/L的表面活性劑、O. 3_2g/L的電解質(zhì)、PH6. 5-7. 5的lOOmmol/L的緩沖液；所述甘膽酸校準(zhǔn)品為甘膽酸純品，其中包括O. 5-lg/L防腐劑、O. 5-2g/L穩(wěn)定劑、l_5g/L的表面活性劑、O. 3_2g/L的電解質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述試劑盒，其特征在于所述膠乳顆粒直徑為60-300nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述試劑盒，其特征在于所述抗甘膽酸多克隆抗體為兔抗人甘膽酸多克隆抗體或羊抗人甘膽酸多克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述緩沖液選自甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述試劑盒，其特征在于所述的穩(wěn)定劑選自蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽、金屬絡(luò)合劑、抗氧化劑中的一種或幾種。
7.根據(jù)權(quán)利要1-2任一項(xiàng)所述試劑盒，其特征在于所述的表面活性劑為非離子表面活性劑，選自 Tween20、Tween40、Span40、Span80、TritonX-IOO 中的一種或幾種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述的電解質(zhì)為鈉離子或鉀離子。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的反應(yīng)促進(jìn)劑選自聚乙二醇2000、溴化乙二甲胺等。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的防腐劑選自疊氮鈉、疊氮鋰、苯甲酸鈉、亞硝酸鈉中的一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明涉及膠乳增強(qiáng)免疫比濁法用于測(cè)定人血清中甘膽酸含量的試劑盒，具體地，提供的甘膽酸檢測(cè)試劑盒包括試劑R1、試劑R2和校準(zhǔn)品，其中試劑R1包含反應(yīng)促進(jìn)劑、防腐劑、表明活性劑、穩(wěn)定劑、電解質(zhì)及緩沖液；試劑R2包含結(jié)合有抗甘膽酸抗體的膠乳顆粒、防腐劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、電解質(zhì)及緩沖液；校準(zhǔn)品包含防腐劑、電解質(zhì)、穩(wěn)定劑、甘膽酸純品及緩沖液。本發(fā)明采用多克隆抗體包被膠乳顆粒的方法保證了試劑盒的高靈敏度和寬線(xiàn)性范圍，同時(shí)還具有準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床常用的全自動(dòng)生化分析儀。
文檔編號(hào)G01N33/536GK102944673SQ201210498639
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者孟琛 申請(qǐng)人:北京華宇億康生物工程技術(shù)有限公司