一種液相凝血酶時間測定試劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種液相凝血酶時間測定試劑，包括以下組分：5?100U/mL的凝血酶和穩(wěn)定劑，所述的穩(wěn)定劑為0.001?0.27％的4’,5,7?三羥基二氫黃酮。該試劑的制備方法為：配制50mM的Tris緩沖液，調(diào)節(jié)pH至7.2?7.5，向該緩沖液中加入0.001?0.27％的4’,5,7?三羥基二氫黃酮，混合均勻后，添加5?100U/mL的凝血酶，混勻并過濾即得液相凝血酶時間測定試劑。本發(fā)明克服了現(xiàn)有液相凝血酶時間測定試劑的不足，制備出了性能穩(wěn)定的液相凝血酶時間測定試劑，相比于現(xiàn)有試劑，其穩(wěn)定性大大提高。
【專利說明】
一種液相凝血酶時間測定試劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種液相凝血酶時間測定試劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]凝血功能是指血漿中的可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)變不溶性的纖維蛋白的過程，是在凝血酶的參與下完成的。凝血酶是凝血酶原經(jīng)激活后產(chǎn)生的蛋白水解酶，其中，人體內(nèi)酶原的激活是在凝血因子Xa的催化下，在血小板表面進行的，需要因子Va、Ca2+的參與。在激活過程中，凝血酶原在Arg273與Thr274之間，Arg322與Ile323之間的肽鍵水解后，轉(zhuǎn)變成有活性的α型凝血酶。如果α型凝血酶自我催化水解Arg384-Arg395肽鍵，會轉(zhuǎn)變?yōu)棣滦湍?。β型凝血酶進一步自我催化水解Arg454-Lys476肽鍵，會轉(zhuǎn)變?yōu)棣媚浮?br>[0003]凝血酶時間(TT)測定試劑，目前基本上為干粉試劑。干粉便于運輸，保質(zhì)期也比較長，但干粉試劑有很多缺陷，首先，需要冷凍工序;需要復(fù)溶液(廠家提供)或去離子水復(fù)溶，以恢復(fù)到凍干前的溶液狀態(tài)。相比之下，液態(tài)試劑能夠克服干粉試劑復(fù)溶過程或凍干過程帶來的缺陷，可保證所有成份構(gòu)成均一的懸浮溶液，灌裝時不會使成份或濃度發(fā)生變化，液態(tài)凝血試劑只有裝量誤差，試劑有效成份的濃度完全相同，不存在瓶間或批內(nèi)差問題，因而提高了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。另一方面，在干粉TT制劑中，凝血酶比較穩(wěn)定，但是，在液相環(huán)境中，凝血酶很容易失去活性，從而導(dǎo)致蛋白活性的喪失。為了穩(wěn)定液相環(huán)境中的凝血酶，行業(yè)內(nèi)已經(jīng)有很多專利文獻的報導(dǎo)(Helmut Liii ,ffielenbach ,Knut Bartl, Stabilizedthrombin preparat1n,US patent 4409334；Masahiro Okuda,NorihiroKikukawa,Meansfor stabilizat1n of thrombin and composit1ns,US patent 2006/0246052A1；ShanJiang ,Richard 1.Senderoff,Thrombin composit1n ,US patent 2007/0104705A1;奧田昌宏，菊川紀(jì)弘，卜口安定化手段掃上邙組成物，TO 01/23536 Al)。包括上述專利文獻在內(nèi)的研究，采用的穩(wěn)定劑包括無機鹽、氨基酸、多羥基化合物、表面活性劑和包括疊氮酸鈉在內(nèi)的防腐劑等。上述穩(wěn)定劑，能夠提升液相環(huán)境中凝血酶的穩(wěn)定性，但是，也有一些缺陷，譬如，溶液中無機鹽加入量增加時，溶液相的離子強度增大、氨基酸容易氧化、表面活性劑會增加溶液相的粘度，而某些防腐劑，特別是疊氮酸鈉，具有毒性，增大了制劑生產(chǎn)過程中的難度。因此，液相環(huán)境中穩(wěn)定凝血酶的一些嘗試，例如，在液相凝血酶中添加高濃度甘油、多元醇(蔗糖、甘露醇、山梨糖醇等)，或添加糖、氨基酸等，是有一定的穩(wěn)定效果，但也有很多局限性，特別的，這些物質(zhì)的加入，特別是多糖類物質(zhì)的加入，增加了液相環(huán)境的粘度，而過量的無機鹽的加入，會增加液相的離子強度，從而影響檢測結(jié)果。
[0004]有研究表明，在含有凝血酶的體系中加入黃酮，凝血酶的活性會受到抑制(HugoA.Guglielmone,Anticoagulant effect and act1n mechanism of sulphatedflavonoids from Flaveriabidentis,Thrombosis Research,2002,2:183-188；Liu LjMaHjYang N，A series of natural flavonoids as thrombin inhibitors:structure-activity relat1nships.Thrombosis Researsh，2010，126:365-378)。同時，某些黃酮可抑制血小板聚集(鄢丹，李果，楊梅素抗血小板聚集的作用機理研究，中國藥理通訊，2005(3):43-43)。另一方面，我們的研究發(fā)現(xiàn)，盡管有些黃酮能抑制凝血酶的活性或血小板的聚集，但某些黃酮的加入，譬如添加4’，5，7_三羥基二氫黃酮，能明顯提升液相環(huán)境中凝血酶的穩(wěn)定性，特別是與嗎啉一乙烷基丙磺酸結(jié)合使用時，顯示出了很好的穩(wěn)定效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有的液相凝血酶時間測定試劑由于采用的穩(wěn)定劑不足而造成的試劑穩(wěn)定性不佳及生產(chǎn)過程困難，本發(fā)明在凝血酶時間測定試劑中增加新的穩(wěn)定劑，以得到一種穩(wěn)定性更好的液相凝血酶時間測定試劑。
[0006]—種液相凝血酶時間測定試劑，包括以下組分:5-200U/mL的凝血酶和穩(wěn)定劑，所述的穩(wěn)定劑為質(zhì)量體積百分比0.001-0.27%的4’，5，7-三羥基二氫黃酮。
[0007]進一步地，所述的穩(wěn)定劑為0.001-0.27%的4’，5，7_三羥基二氫黃酮和0.41-4.19%的3-(N-嗎啉)-乙烷基丙磺酸，其中的百分比均為質(zhì)量體積百分比。
[0008]進一步地，所述凝血酶為人凝血酶或牛凝血酶或其它動物來源的凝血酶，優(yōu)選加入量為:15U/mL。
[0009]進一步地，所述4’，5，7-三羥基二氫黃酮的優(yōu)選加入量為0.027-0.136%,最優(yōu)選為0.081 % ;所述3-( N-嗎啉)-乙烷基丙磺酸的優(yōu)選加入量為1.05-3.14%,最優(yōu)選為2.1 %。
[0010]進一步地，上述液相凝血酶時間測定試劑中還可以包括其它穩(wěn)定劑，包括:牛血清白蛋白、氯化鈣、甘露醇、麥芽糖、山梨酸鉀中的一種或幾種。
[0011]進一步地，所述其它穩(wěn)定劑的加入量為牛血清白蛋白0.1-5 %、氯化I丐0.06-
0.17%、甘露醇2-6%、麥芽糖2-6%、山梨酸鉀0.05-0.1%，其中的百分比均為質(zhì)量體積百分比。
[0012]更進一步地，穩(wěn)定劑的優(yōu)選加入量為:牛血清白蛋白0.5 %、氯化I丐0.1 %、甘露醇4%、麥芽糖3%、山梨酸鉀0.1 %。
[0013]進一步地，所述的液相凝血酶時間測定試劑的pH為7.2-7.5，優(yōu)選pH為7.3。
[0014]上述液相凝血酶時間測定試劑的制備方法，步驟如下:配制50mM的Tris緩沖液，調(diào)節(jié)pH至7.2-7.5，向該緩沖液中加入0.001-0.27 %的4 ’，5，7-三羥基二氫黃酮，混合均勻后，添加5-200U/mL的凝血酶，混勻并過濾即得液相凝血酶時間測定試劑。
[0015]進一步地，在加入4’，5，7_三羥基二氫黃酮的同時，加入3-(N_嗎啉)_乙烷基丙磺酸0.41-4.19 %、牛血清白蛋白0.1-5 %、氯化鈣0.06-0.17%,甘露醇2_6 %、麥芽糖2_6 %或山梨酸鉀0.05-0.1 %中的一種或幾種。
[0016]所述過濾的操作為:以0.45-0.22μπι的過濾膜過濾，以去除大分子量的影響試劑穩(wěn)定性的雜質(zhì)。
[0017]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在一般的液相凝血酶時間測定試劑中，添加4’，5，7_三羥基二氫黃酮后，試劑的穩(wěn)定性提升，在輔助加入3-(Ν-嗎啉)-乙烷基丙磺酸之后，試劑的穩(wěn)定性趨于增強。
[0018]本發(fā)明克服了現(xiàn)有凝血酶穩(wěn)定劑的不足，采用4’，5，7_三羥基二氫黃酮作為穩(wěn)定劑，制備出了性能穩(wěn)定的液相凝血酶時間測定試劑。雖然現(xiàn)有研究表明在凝血酶的體系中加入黃酮，凝血酶的活性會受到抑制。但本發(fā)明卻證實當(dāng)加入4’，5，7_三羥基二氫黃酮時，非但沒有抑制凝血酶的活性，反而使液相凝血酶時間測定試劑的穩(wěn)定性大大提高，而在輔助加入3-(N-嗎啉)-乙烷基丙磺酸之后，試劑的穩(wěn)定性進一步改善。
【附圖說明】
[0019]圖1對比例I及實施例1-2液相凝血酶時間測定試劑的凝血酶時間；
[0020]圖2對比例2及實施例3-4液相凝血酶時間測定試劑的凝血酶時間；
[0021 ]圖3對比例3及實施例5-6液相凝血酶時間測定試劑的凝血酶時間；
[0022 ]圖4對比例4及實施例7-8液相凝血酶時間測定試劑的凝血酶時間。
[0023]圖1-4中，橫坐標(biāo)為取樣的月份，縱坐標(biāo)為測得的凝血酶時間(單位:s)。
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0025]對比例I
[0026]標(biāo)準(zhǔn)凝血酶時間試劑I的配制:
[0027]制備50mM的Tris緩沖液，調(diào)節(jié)pH至7.3，向該緩沖液中加入氯化鈉，使終溶液中氯化鈉的濃度為10mM，同時，加入牛血清白蛋白0.5 %、氯化鈣0.1 %、甘露醇4 %、麥芽糖3 %和山梨酸鉀0.1 %。最后加入凝血酶干粉，使溶液中凝血酶的濃度為15U/mL，混勻并以0.45μm的濾膜過濾即得液相凝血酶時間測定試劑。
[0028]實施例1
[0029]加入新穩(wěn)定劑的凝血酶時間試劑的配制:
[0030]向?qū)Ρ壤齀的試劑中，添加0.081 %的4 ’，5，7_三羥基二氫黃酮，其余與對比例I相同。
[0031]實施例2
[0032]加入新穩(wěn)定劑的凝血酶時間試劑的配制:
[0033]向?qū)Ρ壤齀的試劑中，添加0.081 %的4 ’，5，7_三羥基二氫黃酮和2.1 %的3_(N_嗎啉)_乙烷基丙磺酸，其余與對比例I相同。
[0034]對比例2
[0035]標(biāo)準(zhǔn)凝血酶時間試劑2的配制:
[0036]制備50mM的Tris緩沖液，調(diào)節(jié)pH至7.2，向該緩沖液中加入氯化鈉，使終溶液中氯化鈉的濃度為10mM，同時，加入牛血清白蛋白2.5%、氯化鈣0.17%、甘露醇2%和麥芽糖6%。最后加入凝血酶干粉，使溶液中凝血酶的濃度為100U/mL，混勻并以0.45μπι的濾膜過濾即得液相凝血酶時間測定試劑。
[0037]實施例3
[0038]加入新穩(wěn)定劑的凝血酶時間試劑的配制:
[0039]向?qū)Ρ壤?的試劑中，添加0.15%的4’，5，7_三羥基二氫黃酮，其余與對比例2相同。
[0040]實施例4
[0041 ]加入新穩(wěn)定劑的凝血酶時間試劑的配制:
[0042]向?qū)Ρ壤?的試劑中，添加0.15%的4’，5，7_三羥基二氫黃酮和4.1 %的3_(Ν_嗎啉)_乙烷基丙磺酸，其余與對比例2相同。
[0043]對比例3
[0044]標(biāo)準(zhǔn)凝血酶時間試劑3的配制:
[0045]$1」備50mM的Tris緩沖液，調(diào)節(jié)pH至7.5，向該緩沖液中加入氯化鈉，使終溶液中氯化鈉的濃度為10mM，同時，加入牛血清白蛋白5 %、氯化鈣0.08 %、麥芽糖2%和山梨酸鉀
0.05%。最后加入凝血酶干粉，使溶液中凝血酶的濃度為200U/mL，混勻并以0.45μπι的濾膜過濾即得液相凝血酶時間測定試劑。
[0046]實施例5
[0047]加入新穩(wěn)定劑的凝血酶時間試劑的配制:
[0048]向?qū)Ρ壤?的試劑中，添加0.27%的4’，5，7_三羥基二氫黃酮，其余與對比例3相同。
[0049]實施例6
[0050]加入新穩(wěn)定劑的凝血酶時間試劑的配制:
[0051 ] 向?qū)Ρ壤?的試劑中，添加0.27%的4’，5，7_三羥基二氫黃酮和0.5 %的3_(Ν_嗎啉)_乙烷基丙磺酸，其余與對比例3相同。
[0052]對比例4
[0053]標(biāo)準(zhǔn)凝血酶時間試劑4的配制:
[0054]制備50mM的Tris緩沖液，調(diào)節(jié)pH至7.5，向該緩沖液中加入氯化鈉，使終溶液中氯化鈉的濃度為I OOmM，加入凝血酶干粉，使溶液中凝血酶的濃度為15U/mL，混勻并以0.45ym的濾膜過濾即得液相凝血酶時間測定試劑。
[0055]實施例7
[0056]加入新穩(wěn)定劑的凝血酶時間試劑的配制:
[0057]向?qū)Ρ壤?的試劑中，添加0.081%的4’，5，7_三羥基二氫黃酮，其余與對比例4相同。
[0058]實施例8
[0059]加入新穩(wěn)定劑的凝血酶時間試劑的配制:
[0060]向?qū)Ρ壤?的試劑中，添加0.081 %的4 ’，5，7_三羥基二氫黃酮和2.1 %的3_(Ν_嗎啉)_乙烷基丙磺酸，其余與對比例4相同。
[0061]將對比例1-4及實施例1-8配制好的12種凝血酶時間試劑置于2_8°C條件下密封保存，并測試2-8°C存儲條件下凝血酶時間試劑的穩(wěn)定性。
[0062]為了確定4’，5，7_三羥基二氫黃酮和3-(N_嗎啉)_乙烷基丙磺酸對凝血酶時間試劑的穩(wěn)定效果，采用標(biāo)準(zhǔn)凝血酶時間試劑作為對照，測定正常血漿的凝血酶時間。
[0063]凝血酶時間是凝血功能檢測的凝血4項指標(biāo)之一，它的檢測原理是:在待測血漿中加入標(biāo)定的凝血酶溶液，使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，測定凝固所需的時間，即為待測血漿的凝血酶時間。檢測過程用的分析儀為CAl500，由Sysmex公司生產(chǎn)。
[0064]Sysmex的CA1500采用散色光比濁，監(jiān)測血漿完全凝固的散射光強度的變化。具體的操作為:
[0065]將對比例1-4及實施例1-8制備的液相凝血酶時間測定試劑放在CA1500凝血儀指定位置；
[0066]將正常血漿放到CA1500的樣本架上，樣本架放到自動進樣器上；
[0067]在屏幕上進入Worklist菜單，設(shè)好ID號，選擇凝血酶時間檢測項目。準(zhǔn)備好之后，按Start開始檢測。
[0068]將2_8°C條件下存放的對比例1-4及實施例1-8配制的液相凝血酶時間測定試劑，每月定時取樣一次，連取12個月，用正常血漿和CA1500凝血儀檢測12組試劑對應(yīng)的正常血漿的凝血酶時間，結(jié)果分別見圖1-4。
[0069]圖1結(jié)果表明，在2-80C的存儲條件下，標(biāo)準(zhǔn)凝血酶時間試劑中加入0.081%的4 ’，5，7-三羥基二氫黃酮，凝血酶時間的CV值由8.2 %降低到3.2 %，添加2.1 %的3-(N-嗎啉)-乙烷基丙磺酸之后，CV值進一步減少到2.8%。
[0070]圖2結(jié)果表明，在2-80C的存儲條件下，標(biāo)準(zhǔn)凝血酶時間試劑中加入0.15 %的4 ’，5，7-三羥基二氫黃酮，凝血酶時間的CV值由8.2 %降低到4.1%,添加4.1 %的3_(N_嗎啉)-乙烷基丙磺酸之后，CV值進一步減少到3.8%。
[0071 ]圖3結(jié)果表明，在2-80C的存儲條件下，標(biāo)準(zhǔn)凝血酶時間試劑中加入0.27 %的4 ’，5，7-三羥基二氫黃酮，凝血酶時間的CV值由8.2 %降低到3.9 %，添加0.5 %的3_(N_嗎啉)-乙烷基丙磺酸之后，CV值進一步減少到3.2%。
[0072]圖4結(jié)果表明，在2-80C的存儲條件下，標(biāo)準(zhǔn)凝血酶時間試劑中加入0.081%的4 ’，5，7-三羥基二氫黃酮，凝血酶時間的CV值由42.2%降低到5.4%，添加2.1 %的3-(N-嗎啉)-乙烷基丙磺酸之后，CV值進一步減少到4.3%。
[0073]凝血酶時間診斷試劑的穩(wěn)定性，是通過維持凝血酶的蛋白活性來體現(xiàn)的，凝血酶時間CV值降低，表明凝血酶的蛋白活性降低幅度小。因此，在凝血酶時間測定試劑中，添加4’，5，7_三羥基二氫黃酮，可提升凝血酶的蛋白活性穩(wěn)定度，添加3-(N_嗎啉)_乙烷基丙磺酸之后，穩(wěn)定度進一步提升。
【主權(quán)項】
1.一種液相凝血酶時間測定試劑，其特征在于，包括以下組分:5-200U/mL的凝血酶和穩(wěn)定劑，所述的穩(wěn)定劑為質(zhì)量體積百分比0.001-0.27%的4’，5，7-三羥基二氫黃酮。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液相凝血酶時間測定試劑，其特征在于，所述的穩(wěn)定劑為0.001-0.27%的4’，5,7-三羥基二氫黃酮和0.41-4.19%的3-(N-嗎啉)-乙烷基丙磺酸，其中的百分比均為質(zhì)量體積百分比。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的液相凝血酶時間測定試劑，其特征在于，所述凝血酶為人凝血酶或牛凝血酶或其它動物來源的凝血酶，加入量為15U/mL。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的液相凝血酶時間測定試劑，其特征在于，所述4’，5，7-三羥基二氫黃酮的加入量為0.027-0.136%;所述3-(N-嗎啉)-乙烷基丙磺酸的加入量為1.05-3.14%。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的液相凝血酶時間測定試劑，其特征在于，所述液相凝血酶時間測定試劑中還包括其它穩(wěn)定劑，包括:牛血清白蛋白、氯化鈣、甘露醇、麥芽糖、山梨酸鉀中的一種或幾種。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的液相凝血酶時間測定試劑，其特征在于，所述其它穩(wěn)定劑的加入量為牛血清白蛋白0.1-5 %、氯化鈣0.06-0.17%,甘露醇2-6 %、麥芽糖2_6 %、山梨酸鉀0.05-0.1 %，其中的百分比均為質(zhì)量體積百分比。7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或6所述的液相凝血酶時間測定試劑，其特征在于，所述的液相凝血酶時間測定試劑的pH為7.2-7.5。8.一種液相凝血酶時間測定試劑的制備方法，其特征在于，步驟如下:配制50mM的Tris緩沖液，調(diào)節(jié)pH至7.2-7.5，向該緩沖液中加入0.001-0.27%的4’，5，7-三羥基二氫黃酮，混合均勻后，添加5-200U/mL的凝血酶，混勻并過濾即得液相凝血酶時間測定試劑。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的液相凝血酶時間測定試劑的制備方法，其特征在于，在加入4’，5，7-三羥基二氫黃酮的同時，加入3-(N-嗎啉)-乙烷基丙磺酸0.41-4.19%,牛血清白蛋白0.1-5%、氯化鈣0.06-0.17%、甘露醇2-6%、麥芽糖2-6%或山梨酸鉀0.05-0.1%中的一種或幾種。10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的液相凝血酶時間測定試劑的制備方法，其特征在于，所述過濾的操作為:用0.45-0.22μηι的過濾膜過濾。
【文檔編號】G01N33/86GK105866445SQ201610415856
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月14日
【發(fā)明人】胡小偉, 黃翔宇, 王 華
【申請人】青島古高生物科技有限公司