專利名稱：板藍(lán)根浸出物在免疫佐劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥板藍(lán)根浸出物，尤其是中藥板藍(lán)根浸出物作為主要有效成分用于免疫佐劑。
(2)背景技術(shù)為了提高免疫效果，人們先后發(fā)明了各種各樣的佐劑，如20世紀(jì)70年代的細(xì)菌衍生物、脂質(zhì)體、聚核苷酸等。20世紀(jì)80年代又出現(xiàn)胞壁肽類，合成脂A相似物及抗原載體與佐劑的共價(jià)結(jié)合。隨著現(xiàn)代生物化學(xué)的發(fā)展，新的抗原分子小、純度高、定性充分，但是多為弱免疫原，因此迫切需要既安全又有強(qiáng)活性的佐劑來(lái)增強(qiáng)效力。目前人和動(dòng)物用的免疫佐劑主要是乳化的油-水和金屬鹽類佐劑。鹽類佐劑包括鋁和鈣的化合物。這些佐劑對(duì)于大分子蛋白質(zhì)、多糖等有很強(qiáng)的吸附能力，注射后抗原緩慢釋放，延長(zhǎng)抗原與巨噬細(xì)胞或其他抗原呈遞細(xì)胞的接觸，從而增強(qiáng)抗原的刺激作用。但其壽命較短，一般一個(gè)月后迅速下降。對(duì)于抗原性較弱的多肽和重組抗原等，佐劑效應(yīng)顯然不夠。完全福氏佐劑(IFA)和不完全福氏佐劑(CFA)在提高抗體的滴度和免疫持久性方面，遠(yuǎn)高于鋁佐劑。但由于副作用嚴(yán)重，注射后引起無(wú)菌化膿，而且有長(zhǎng)期的油滯留于組織中不能代謝，也容易引起過(guò)敏反應(yīng)，因此不容許用于人。這種佐劑的作用是迄今最強(qiáng)的，但是只能用于實(shí)驗(yàn)室中，用動(dòng)物制備高價(jià)抗體或制備獸用生物制品。
我國(guó)中草藥中有近200種中草藥具有免疫活性?，F(xiàn)已有一大類藥物用于調(diào)節(jié)、增強(qiáng)、興奮和恢復(fù)機(jī)體免疫能力，在臨床上主要用于感染性疾病。板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)的根，具有清熱解毒的功效，是公認(rèn)的有較好抗病毒效果的少數(shù)中藥之一，在臨床上用途較廣，是治療多種病毒感染性疾病如流感、腮腺炎、乙型腦炎、肝炎等的首選中藥。
(3)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種用于提高傳統(tǒng)滅活減毒疫苗、DNA疫苗和多肽疫苗免疫效果的免疫佐劑。
本發(fā)明將中藥板藍(lán)根浸出物作為主要有效成分用于免疫佐劑。特別是用于滅活減毒疫苗，DNA疫苗或多肽疫苗的免疫佐劑。
本發(fā)明所說(shuō)的中藥板藍(lán)根浸出物是十字花科植物菘藍(lán)的根，即板藍(lán)根的水溶性成分。
所說(shuō)的中藥板藍(lán)根浸出物的制備方法如下
稱取中藥板藍(lán)根，加蒸餾水，浸泡，然后慢火煮，去渣后的水溶物于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍保存。
中藥板藍(lán)根浸出物與幾種DNA、多肽疫苗聯(lián)用，其抗體的產(chǎn)生量高于使用福氏佐劑的對(duì)照組，T細(xì)胞增殖也明顯地高于福氏佐劑組。板藍(lán)根浸出物也被用于多肽疫苗的佐劑，與福氏佐劑相比，板藍(lán)根浸出物更能刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體。
以板藍(lán)根浸出物為主的佐劑可以直接或間接地激活活性細(xì)胞，明顯地提高肌體的免疫力；能增加抗原的表面積，延長(zhǎng)抗原在局部組織的存留時(shí)間，達(dá)到加強(qiáng)免疫效果；并且具有生產(chǎn)成本低，無(wú)毒性的特點(diǎn)。
(4)


圖1為口蹄疫DNA疫苗分別以板藍(lán)根浸出物、福氏佐劑為佐劑免疫小鼠的抗體產(chǎn)生情況。(在圖1中，縱坐標(biāo)為抗體滴度(Titre)，Group1對(duì)照未免疫小鼠；Group2以福氏佐劑為佐劑；Group3以板藍(lán)根浸出物為主的佐劑)圖2為口蹄疫DNA疫苗分別以板藍(lán)根浸出物、福氏佐劑為佐劑免疫小鼠的脾T細(xì)胞經(jīng)每孔20μg/μL抗原20μL刺激后的T-細(xì)胞增殖情況。(在圖2中，縱坐標(biāo)為刺激前后MTT顯色后增加的OD值(Increased OD value)，Group1對(duì)照未免疫小鼠；Group2以福氏佐劑為佐劑；Group3以板藍(lán)根浸出物為主的佐劑，刺激的抗原50μg)圖3為乙肝核心抗原基因工程多肽疫苗分別以板藍(lán)根浸出物、福氏佐劑為佐劑免疫小鼠的抗體產(chǎn)生情況。(在圖3中，縱坐標(biāo)為OD450nm值，Group1對(duì)照未免疫小鼠；Group2以福氏佐劑為佐劑；Group3以板藍(lán)根浸出物為主的佐劑)圖4為乙肝表面抗原基因工程多肽疫苗分別以板藍(lán)根浸出物、福氏佐劑為佐劑免疫小鼠的抗體產(chǎn)生情況。(在圖4中，縱坐標(biāo)為OD450nm值，Group1對(duì)照未免疫小鼠；Group2以鋁佐劑為佐劑；Group3以板藍(lán)根浸出物為主的佐劑)(5)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1稱取中藥板藍(lán)根500g，加2L的蒸餾水，浸泡3h，然后慢火煮3h，去渣后的水溶物于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至終體積為10mL。與口蹄疫病毒DNA疫苗按體積比1∶1充分混合均勻，即可用于動(dòng)物體的注射。每只小鼠注射DNA質(zhì)粒200μg，兩星期后加強(qiáng)免疫一次，一周后再免疫一次。第三針注射后10天取血進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)。并取脾臟，經(jīng)胰蛋白酶酶解后制成單細(xì)胞懸液，分別加經(jīng)濃度梯度稀釋的口蹄疫病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原刺激72h，加MTT顯色，用酶標(biāo)自動(dòng)讀數(shù)儀選擇測(cè)定波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm測(cè)定OD值。
同常規(guī)福氏佐劑相比，以板藍(lán)根浸出物為主的佐劑能明顯地提高抗體效價(jià)，而且也能明顯地促進(jìn)T細(xì)胞的增殖。參見(jiàn)圖1，2，兩者存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。
實(shí)施例2按實(shí)施例1的方法制作板藍(lán)根浸出物佐劑。乙肝病毒核心抗原(HBcAg)原核表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)純化后與以板藍(lán)根浸出物為主的佐劑按體積比為1∶1充分混合，按每只小鼠200μg免疫，兩周后加強(qiáng)一次，一周后再免疫一次。10天后采血，用HBcAg標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗體產(chǎn)生情況(參見(jiàn)圖3)。因?yàn)槭歉?jìng)爭(zhēng)性的ELISA檢測(cè)試劑盒，抗體的量與OD450nm值成反比。
實(shí)施例3將板藍(lán)根浸出物佐劑與商品化的口蹄疫滅活疫苗連用，能有效地促進(jìn)抗口蹄疫抗體的產(chǎn)生。
實(shí)施例4將以板藍(lán)根浸出物為主的佐劑和商品化的乙肝病毒表面抗原疫苗按體積比為1∶1充分混合，按每只小鼠3μg免疫，兩周后加強(qiáng)一次。10后采血，用商品化的乙肝病毒表面抗體診斷試劑盒測(cè)抗體產(chǎn)生情況(參見(jiàn)圖4)。
權(quán)利要求
1.中藥板藍(lán)根浸出物作為主要有效成分用于免疫佐劑。
2.如權(quán)利要求1所述的中藥板藍(lán)根浸出物，其特征在于作為主要有效成分用于滅活、減毒疫苗，DNA疫苗或多肽疫苗的免疫佐劑。
全文摘要
涉及一種中藥板藍(lán)根浸出物，尤其是中藥板藍(lán)根浸出物作為主要有效成分用于免疫佐劑。中藥板藍(lán)根浸出物與幾種DNA、多肽疫苗聯(lián)用，其抗體的產(chǎn)生量高于使用福氏佐劑的對(duì)照組，T細(xì)胞增殖也明顯地高于福氏佐劑組。板藍(lán)根浸出物也被用于多肽疫苗的佐劑，與福氏佐劑相比，板藍(lán)根浸出物更能刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體。以板藍(lán)根浸出物為主的佐劑可以直接或間接地激活活性細(xì)胞，明顯地提高肌體的免疫力；能增加抗原的表面積，延長(zhǎng)抗原在局部組織的存留時(shí)間，達(dá)到加強(qiáng)免疫效果；并且具有生產(chǎn)成本低，無(wú)毒性的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K39/39GK1470287SQ0314503
公開(kāi)日2004年1月28日 申請(qǐng)日期2003年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月18日
發(fā)明者陳亮, 邵寒娟, 林濤, 蘇勇波, 郭小玲, 陳 亮 申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué)