專利名稱：卵黃抗體凍干制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及卵黃抗體的凍干制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
卵黃抗體(Egg Yolk Immunoglobulins，IgY)指存在于禽蛋卵黃中的免疫球蛋白，其成分主要為IgG，具有與血清抗體相似的生物學(xué)活性。
卵黃抗體具有制備簡單、易于大量獲得、無污染、無毒副作用、使用后無殘留等優(yōu)點，同時禽類病原通常不感染哺乳動物，消除了卵黃抗體成為傳染源的潛在危險，可應(yīng)用于防治畜禽傳染病。國內(nèi)外研制的產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌卵黃抗體、豬流行性腹瀉病毒卵黃抗體等在臨床應(yīng)用中均取得明顯的治療效果。
現(xiàn)有技術(shù)使用卵黃抗體多采用收集高效價卵黃后直接注射的方法，使用過程存在諸多問題。因卵黃中脂類含量較高，非常粘稠，直接注射吸收困難，注射部位常形成干酪樣結(jié)節(jié)。若將卵黃抗體稀釋后注射，抗體效價又明顯下降。
直接使用卵黃抗體的另一問題是，卵黃為高蛋白物質(zhì)，極易腐敗變質(zhì)。因而提純卵黃抗體制成易于應(yīng)用和保存的劑型在使用過程中非常必要。目前卵黃抗體提純方法有多種，如氯仿去脂法，聚乙二醇沉淀法，酸化水處理法等，每種方法均有不同缺點。如氯仿去脂會造成較嚴(yán)重環(huán)境污染；聚乙二醇雖對卵黃抗體回收率較高，然而殘留聚乙二醇較難去除且成本較高；用酸化水處理方法，抗體回收后因稀釋度較高效價降低明顯。
綜上，研制從卵黃中簡便高效提純卵黃抗體的方法并制備易于使用與保存的劑型成為卵黃抗體應(yīng)用的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種易于使用與保存的卵黃抗體制劑，該制劑的制備方法應(yīng)該簡便、不造成較嚴(yán)重環(huán)境污染、抗體效價高且成本較低。
本發(fā)明制備了卵黃抗體的凍干制劑，包括二聯(lián)或多價卵黃抗體凍干制劑。
所述卵黃抗體凍干制劑的制備方法是制備細(xì)菌或病毒免疫原，用于免疫非免疫產(chǎn)蛋雞，收集該被免疫雞所產(chǎn)雞蛋，從其卵黃中提取出針對該免疫原的卵黃抗體；利用酸化蒸餾水去除上述卵黃中的脂類，再用少量氯仿去除殘余不溶性物質(zhì)，然后用超濾裝置濃縮卵黃抗體液，最后將濃縮卵黃抗體液按比例混合后在凍干機(jī)上凍干，制成二聯(lián)或多價卵黃抗體凍干制劑。
所述酸化蒸餾水為蒸餾水中加入少許鹽酸調(diào)節(jié)pH值為5.0。
本發(fā)明用上述方法制備了抗產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(ETEC)的三個菌型K88/K99/987P的多價卵黃抗體凍干制劑和抗豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)二聯(lián)卵黃抗體凍干制劑。這兩種卵黃抗體凍干制劑可用于治療因相應(yīng)病原所致的仔豬腹瀉。
本方法的優(yōu)點是既徹底去除了卵黃中的脂類，經(jīng)濃縮得到了高效價的抗體，而且制備的卵黃抗體凍干制劑易于保存和運(yùn)輸、使用方便。本發(fā)明提供的二聯(lián)或多價卵黃抗體凍干制劑適于臨床上及時對腹瀉仔豬治療和預(yù)防。
具實施方式實施例1產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌多價卵黃抗體凍干制劑1.材料1.1細(xì)菌和培養(yǎng)基 產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(ETEC)的3個菌型K88/K99/987P，購自中國獸藥監(jiān)察所；培養(yǎng)3個菌型K88/K99/987P的培養(yǎng)基TSA、Minca、Slanetz為實驗室自行配制。
1.2免疫用蛋雞120日齡待開產(chǎn)非免疫蛋雞，購自中國獸醫(yī)監(jiān)察所，按常規(guī)方法飼養(yǎng)。
1.3試劑由白油、司本80、硬脂酸鋁和吐溫80制備的油佐劑為本實驗室自配；免疫刺激劑“吸附百日咳菌苗、白喉、破傷風(fēng)類毒素混合制劑”購自醫(yī)院；酸化蒸餾水為鹽酸調(diào)節(jié)蒸餾水pH值為5.0而制備；氯仿為分析純，北京化工廠生產(chǎn)。
1.4實驗儀器高速離心機(jī)為Beckman Coulter Avanti J-25型并配JA-10型轉(zhuǎn)頭；超濾裝置為FILTRON中型盒式超濾系統(tǒng)，購自日本富士濾器公司；冷凍干燥機(jī)為Epsilon 2-60型小型凍干機(jī)。
2.方法2.1細(xì)菌免疫原制備 用少量滅菌生理鹽水將凍干菌種K88、K99、987P稀釋，用鉑金耳挑取少量分別在TSA、Minca、Slanetz固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，然后挑取K88、K99、987P典型單個菌落接種5ml相應(yīng)液體培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)過夜后加入1500ml液體培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)過夜。細(xì)菌培養(yǎng)物經(jīng)5000rpm×30min離心后收獲菌體，用0.01MPBS(pH7.4)配制成1.0×1010/ml的菌體濃度，菌液中加入0.5％甲醛，37℃滅活24～48小時，其間振搖數(shù)次，經(jīng)無菌檢驗合格后加入4％吐溫-80充分混勻作為水相；白油與司班-80(96∶4)混合后加入2％硬脂酸鋁，經(jīng)溶化高壓后作為油相與等量水相混合，充分乳化后制成菌體油乳劑滅活苗。
2.2免疫程序及方法初免前5天用“吸附百日咳菌苗、白喉、破傷風(fēng)類毒素混合制劑”對每只雞胸肌多點注射0.5mL，以刺激母雞免疫反應(yīng)。初免對每只雞胸肌注射4點，每點0.2mL，頸部皮下注射0.2mL。于初免后2周進(jìn)行二免，方法同初免，每點免疫劑量增加至0.3mL。二免后2周進(jìn)行三免，每點免疫劑量增加至0.4mL。
2.3卵黃抗體效價檢測 二免后1周開始，每周收集免疫蛋，分離出卵黃，采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抗體效價檢測。在0.01MPBS(pH7.4)的溶液中加入8％NaCl和1.5％瓊脂粉，加熱融化后倒入平皿內(nèi)，制成2～3mm厚的瓊脂板，室溫凝固后，4℃保存?zhèn)溆?。卵黃用PBS作倍比稀釋，稀釋度分別為2×、4×、8×、16×、32×、64×。用打孔器將瓊脂板打成七孔梅花型，酒精燈加熱封底，周圍孔加入不同稀釋度的卵黃抗體，中間孔加入K88、K99、987P檢測抗原，倒置平皿于37℃濕盒內(nèi)反應(yīng)24～72小時，直至沉淀線產(chǎn)生。以觀察到沉淀線的抗體最大稀釋倍數(shù)為檢測樣品的抗體效價。
2.4酸化蒸餾水處理取抗體效價≥1∶64的卵黃，加入10倍體積的酸化蒸餾水，充分勻漿后置4℃過夜，脂類物質(zhì)在酸化蒸餾水作用下相互凝聚，可溶性蛋白溶于水中，通過10000rpm×30min離心，收集上清液。
2.5氯仿處理在酸化蒸餾水處理后的上清液中加入2％氯仿，充分振蕩混勻后10000rpm×10min離心，可進(jìn)一步去除脂類和不溶性蛋白，使上清液更加澄清，取上清液備用。
2.6超濾濃縮經(jīng)酸化水和氯仿處理后收集的上清液在超濾裝置上進(jìn)行超濾濃縮，超濾裝置為日本富士濾器公司生產(chǎn)的FILTRON中型盒式超濾系統(tǒng)，選用截留分子量為3萬的低吸附超濾中型組合膜濃縮，起始頻率為20Hz，工作頻率為30Hz，濃縮后體積為原上清液體積的1/10，收集濃縮卵黃抗體液備用。
2.7多價卵黃抗體凍干制劑制備 將K88、K99、987P三種菌型相應(yīng)的超濾濃縮卵黃抗體液分別用瓊脂擴(kuò)散試驗測定抗體效價，然后用生理鹽水稀釋成1∶64的效價，最后將三種卵黃抗體液按1∶1∶1的比例配合混勻后分裝于青瓶內(nèi)，2.4ml/瓶，于凍干機(jī)上凍干，凍干過程溫度變化為凍干室內(nèi)溫度由室溫逐漸降低，2小時后降至最低-40℃，在此溫度下維持1小時，然后按每小時升高5℃的速度逐漸升溫，約需13小時升至室溫，凍干的同時抽真空，最后在室溫狀態(tài)下維持5小時并壓緊瓶塞，取出凍干樣品，整個凍干過程結(jié)束。凍干后青瓶內(nèi)為易溶于水的白色干粉，貯存于4℃?zhèn)溆谩?br> 實施例2豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)卵黃抗體凍干制劑1.材料1.1病毒豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)，來自中國獸藥監(jiān)察所；豬流行性腹瀉病毒(PEDV)，來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院。
1.2免疫用蛋雞同實施例1中1.2。
1.3試劑佐劑為弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，購自中國獸藥監(jiān)察所；其它試劑同實施例1中1.3。
1.4實驗儀器同實施例1中1.4。
2.方法2.1病毒免疫原制備1日齡未吃初乳仔豬，用牛奶人工哺乳，每兩小時喂1次，觀察1天后，分別取TGEV、PEDV病毒液口服攻毒，攻毒后12小時左右開始出現(xiàn)腹瀉癥狀，繼而出現(xiàn)嚴(yán)重的黃色水瀉，仔豬厭食和極度消瘦，至48小時剖殺病豬，取出全部小腸組織，用于提取和純化病毒。將小腸組織充分剪碎和研磨，加10倍體積0.01MPBS(pH7.4)稀釋，反復(fù)凍融三次，5000rpm×30min離心，取上清液加入6％PEG6000和2％NaCl，置4℃過夜，5000rpm×30min離心，沉淀重懸于1/5原液體積的PBS中，再置4℃過夜，重懸液經(jīng)12000rpm×30min離心后上清液即為純化病毒液。純化病毒液與等量弗氏完全佐劑充分乳化后制成初免用免疫原；與等量弗氏不完全佐劑充分乳化后作為二免及三免用免疫原。
2.2免疫程序及方法同實施例1中2.2。
2.3卵黃抗體效價檢測同實施例1中2.3，檢測抗原改為TGEV和PEDV。
2.4酸化蒸餾水處理同實施例1中2.4。
2.6超濾濃縮同實施例1中2.5。
2.7二聯(lián)卵黃抗體凍干制劑制備 將TGEV、PEDV相應(yīng)的超濾濃縮卵黃抗體液分別用瓊脂擴(kuò)散試驗測定抗體效價，然后用生理鹽水稀釋成1∶64的效價，最后將兩種卵黃抗體液按1∶1的比例配合混勻后分裝于青瓶內(nèi)，2.4ml/瓶，于凍干機(jī)上凍干，凍干過程同實施例1中2 7。
權(quán)利要求
1.卵黃抗體凍干制劑。
2.權(quán)利要求1所述的卵黃抗體凍干制劑是抗產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(ETEC)的三個菌型K88/K99/987P的多價卵黃抗體凍干制劑。
3.權(quán)利要求1所述的卵黃抗體凍干制劑是抗豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)二聯(lián)卵黃抗體凍干制劑。
4.權(quán)利要求1-3中任一項權(quán)利要求所述的卵黃抗體凍干制劑的制備方法是制備免疫原，用于免疫非免疫產(chǎn)蛋雞，收集該被免疫雞所產(chǎn)雞蛋，從其卵黃中提取出針對該免疫原的卵黃抗體；利用酸化蒸餾水去除上述卵黃中的脂類，再用少量氯仿去除殘余不溶性物質(zhì)，然后用超濾裝置濃縮卵黃抗體液，最后將濃縮卵黃抗體液按比例混合后在凍干機(jī)上凍干，制成二聯(lián)或多價卵黃抗體凍干制劑。
5.權(quán)利要求4所述的卵黃抗體凍干制劑的制備方法，所述酸化蒸餾水為蒸餾水中加入少許鹽酸調(diào)節(jié)pH值為5.0。
全文摘要
本發(fā)明提供了卵黃抗體的凍干制劑，包括二聯(lián)或多價卵黃抗體凍干制劑。所述卵黃抗體凍干制劑的制備方法是制備細(xì)菌或病毒免疫原，用于免疫非免疫產(chǎn)蛋雞，收集該被免疫雞所產(chǎn)雞蛋，從其卵黃中提取出針對該免疫原的卵黃抗體；利用酸化蒸餾水去除上述卵黃中的脂類，再用少量氯仿去除殘余不溶性物質(zhì)，然后用超濾裝置濃縮卵黃抗體液，最后將濃縮卵黃抗體液按比例混合后在凍干機(jī)上凍干，制成二聯(lián)或多價卵黃抗體凍干制劑。本發(fā)明的方法徹底去除了卵黃中的脂類，經(jīng)濃縮得到了高效價的抗體。本發(fā)明提供的卵黃抗體凍干制劑易于保存和運(yùn)輸、使用方便。
文檔編號A61P1/12GK1509765SQ02156900
公開日2004年7月7日 申請日期2002年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月20日
發(fā)明者王金洛, 徐福洲, 宋維平, 楊兵 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所