一種采用陽離子多糖制備高生物活性卵黃抗體的方法
【技術領域】
[0001]一種采用陽離子多糖制備高生物活性卵黃抗體的方法，屬于生物制品和工業(yè)化分離技術領域。
【背景技術】
[0002]雞卵黃中富含卵黃抗體、高磷蛋白等生物活性蛋白，并被認為是活性抗體含量與活性最高，也是最廉價的資源。但迄今為止，還沒有如人們所期望的那樣得到工業(yè)化利用。其主要原因是因為卵黃中含有豐富的脂肪、蛋白質、膽固醇、卵磷脂等多種物質，對卵黃抗體的工業(yè)化分離造成了嚴重的困難。目前分離蛋黃抗體的方法主要有以下幾種:(I)采用乙醇、聚乙二醇、丙酮等有機試劑分離的方法，雖然分離效果較好，但因為卵黃抗體主要是用于功能食品添加劑、生物醫(yī)藥等領域，因此如采用上述辦法則有以下幾個方面的問題。一是成本較高(試劑耗量大，如目前普遍采用的PEG-6000的用量最高達到12%的高濃度)；二是工藝復雜，操作條件難以掌握，且易造成卵黃抗體活性損失，三是產(chǎn)品最終有化學有害物質殘留，產(chǎn)品的安全性達不到要求。(2)采用離子交換、金屬螯合色譜、親和色譜分離的方法，雖然純度較高，但生產(chǎn)規(guī)模只以克計，而成本更可高達每克上百元。(3)采用CMC、海藻酸鈉等大分子膠的水相抽提法，由于直接將大分子膠加入蛋黃體系，因此抽提效率較低，并在蛋黃中仍然含有較多的雜質及CMC、海藻酸鈉等殘留膠體大分子，直接影響了下一步超濾分離濃縮工藝，迄今尚未解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種采用陽離子多糖高效澄清技術，結合低溫超濾濃縮分離新工藝，徹底解決了在分離過程中蛋黃液中殘留高分子膠體的缺點，有利于卵黃抗體的分離提取，同時又使得蛋黃液可以得到進一步的應用。采用本發(fā)明能夠以年產(chǎn)10噸以上的規(guī)模生產(chǎn)高生物活性蛋黃抗體產(chǎn)品。同時剩余蛋黃粉經(jīng)加工后，還可得到剩余蛋黃粉、蛋黃油或蛋黃卵磷脂等副產(chǎn)品。使得蛋黃的加工深度得到了極大的提高，產(chǎn)品附加值也大增加。而成本則遠低于以前的方法。
[0004]本發(fā)明的內(nèi)容為:生產(chǎn)工藝流程框圖如圖1所示。主要技術特征有如下幾點:(I)采用陽離子多糖高效澄清技術，結合工業(yè)化超濾濃縮分離技術，從蛋黃中分離提取活性蛋黃抗體，使蛋黃活性抗體的低成本、工業(yè)化分離得以實現(xiàn)，可達到年產(chǎn)10噸以上蛋黃抗體產(chǎn)品的生產(chǎn)規(guī)模。(2)采用PP膜精密過濾結合0.22 μm聚醚砜膜微濾對濃縮液進行冷除菌，產(chǎn)品可達到無菌級別。(4)微濾液中按比例加入甘油或吐溫-20等保護劑，可在-30~0°C低溫保存，可有效地保護產(chǎn)品生物活性。(5)整個工藝流程都在低溫下(O?12°C)進行，確保了產(chǎn)品的高生物活性。
[0005]本發(fā)明的工藝為:
(I)將原料新鮮雞蛋經(jīng)檢查消毒后，采用手工或機械方式分離蛋清和蛋黃。蛋清可直接經(jīng)噴霧干燥制得副產(chǎn)品蛋白粉，或經(jīng)發(fā)酵后噴霧干燥制得脫糖蛋白粉。將蛋黃經(jīng)高純水稀釋、攪拌、沉淀分離后，得蛋黃抽提液，技術條件為:蛋黃:高純水=1:6?20 (w/w)，直接攪拌5?25分鐘，采用自然沉降4?16小時后分離。上清液中為蛋黃抗體粗提液。沉淀物(剩余蛋黃)經(jīng)噴霧干燥后制得副產(chǎn)品蛋黃粉或采用超臨界提取方法分離得到蛋黃卵磷脂、蛋黃油和剩余蛋黃粉等副產(chǎn)品。
[0006](2)將蛋黃抗體粗提液，按比例加入陽離子多糖，分別經(jīng)攪拌、離心分離或板框過濾后得到澄清液，視料液情況而稍有不同，一般的范圍為0.01?5.1% (w/w)，攪拌5?30min，然后靜置1min?40min后，經(jīng)管式離心或板框過濾后去除沉淀物，管式離心機5000?10000r/min分離或加入0.03?1.5%(w/w)娃藻土進行板框過濾，沉淀物等雜質棄去。
[0007](3)澄清液進行低溫連續(xù)超濾膜分離，得到濃縮截留液。超濾溫度為4?12°C，超濾膜的截留分子量為50，000?150，000，采用聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)、改性聚砜膜(PS膜)或聚醚砜膜(POS)。膜總面積可達10M2以上。
[0008](4)超濾透過液主要是一些低分子物質，可棄去。最后將濃縮截留液進行低溫微濾除菌，微濾膜材料為改性聚砜膜(PS膜)或陶瓷膜等，孔徑為0.1-0.5 um。
[0009](5)微濾透過液按比例加入5~20%甘油或吐溫-20，無菌分裝，得到主產(chǎn)品一卵黃活性抗體。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點:
(I)該工藝采用陽離子多糖澄清方法，大大降低了后道工序中超濾膜的污染，使得工業(yè)化超濾生產(chǎn)得以實現(xiàn)。
[0011](2)超濾工藝具有無相態(tài)變化，不存在高溫或化學因素破壞的優(yōu)點，從根本上攻克了蛋黃抗體在加工過程中容易失活的難關，可最大程度地保留產(chǎn)品的活性。
[0012](3)微濾除菌既能夠去除包括活菌體和死菌體在內(nèi)的細菌體，其產(chǎn)品可實現(xiàn)無菌，而其他方法(如巴氏熱殺菌或輻照低溫殺菌)都會使蛋黃抗體的效價大大降低，從而大大降低產(chǎn)品的生物活性。
[0013](4)由于該工藝在水相提取蛋黃抗體及澄清時，只使用了高純水，不必調(diào)節(jié)pH，從而使得對副產(chǎn)品蛋黃粉或全蛋粉的影響比其他工藝要小得多。而且采用了膜分離等高新技術后，可保證蛋黃抗體產(chǎn)品中不含任何有害物質，不含激素，高效安全。
[0014](5)提高了資源利用度，在生產(chǎn)過程中避免使用有機溶劑等有害物質，減少污染，保護了環(huán)境。
[0015](6)自動化程度較高，操作條件容易掌握，生產(chǎn)效率高，生產(chǎn)成本可大幅降低。
[0016]具體實施案例:
將2噸新鮮雞蛋經(jīng)消毒、打蛋、分蛋，所得蛋黃約0.60噸加入4一 12噸水，攪拌15分鐘，低溫保溫沉淀12 —15小時，離心分離。沉淀物為剩余蛋黃，經(jīng)噴霧干燥制得副產(chǎn)品蛋黃粉，約240公斤左右。上清液為蛋黃抗體抽提液，按配比加入陽離子多糖，攪拌15分鐘，經(jīng)板框過濾后將沉淀物棄去。澄清液經(jīng)POS膜超濾，4?12°C，膜面積100m2。濃縮截留液經(jīng)0.22um聚醚砜膜微濾膜除菌后，按比例加入甘油或者吐溫-20，得到主產(chǎn)品卵黃抗體液體，約為100~150公斤。
[0017]應用舉例:
本產(chǎn)品可用于各種消毒噴霧劑、濕巾、牙膏、免洗洗手液等；在制備免疫檢測試劑中的應用，具體包括:免疫電泳、ELISA、免疫沉淀、免疫印跡、抗體芯片、時間分辨熒光免疫分析和免疫細胞學等一系列免疫診斷技術，用以檢測相應的抗原?？商砑雍包S活性抗體的嬰兒、老年人及免疫功能低下人群的功能食品中，如嬰兒仿母乳產(chǎn)品、老年奶粉。
【主權項】
1.一種采用陽離子多糖制備高生物活性卵黃抗體的方法，本發(fā)明的特征是采用陽離子多糖提取技術，結合超濾技術，分離活性卵黃抗體，其工藝為: (1)將原料新鮮雞蛋經(jīng)消毒、分蛋后，將蛋黃經(jīng)水稀釋、攪拌、沉淀分離后，得到蛋黃抽提液，技術條件為:蛋黃:水=1:6?20 (w/w)，在O?12°C下自然沉降4?16小時； (2)卵黃抗體粗提液中加入陽離子多糖，經(jīng)攪拌、離心分離或板框過濾后，得澄清液，技術條件為:陽離子多糖總用量為抽提液的0.01?5.1% (w/w);陽離子多糖為殼聚糖、陽離子瓜爾豆膠或陽離子的羥乙基纖維素(HEC);攪拌5?30min，管式離心機5000?8000r/min分離，或加入0.03?1.5%(w/w)娃藻土進行板框過濾； (3)將澄清液進行連續(xù)超濾膜分離，得到濃縮截留液，技術條件為:超濾溫度4?12°C，超濾膜的截留分子量為50，000?100，000，膜材料為聚偏氟乙烯或改性聚砜； (4)將濃縮截留液先采用PP膜進行低溫精密過濾，除去懸浮雜質，然后再采用聚醚砜膜微濾膜除菌，微濾膜孔徑為0.22um ; (5)將得到的無菌微濾透過液加入5~20%的甘油或吐溫-20等保護劑，添加量5~20%，在-30°C ~0°C保存，得主產(chǎn)品卵黃活性抗體。2.按權利要求1所述的方法，其特征為采用陽離子多糖為殼聚糖、陽離子瓜爾豆膠或陽離子的羥乙基纖維素(HEC)。3.按權利要求1所述的方法，其特征為采用微濾技術對超濾濃縮液進行冷除菌，主產(chǎn)品的微生物指標可以達到無菌級別。4.按權利要求1所述的方法，其特征為實現(xiàn)了年產(chǎn)10噸以上的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)高生物活性的卵黃抗體。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種采用陽離子多糖制備高生物活性卵黃抗體的方法，屬于生物制品和工業(yè)化分離技術領域。本發(fā)明采用陽離子多糖高效提取技術，結合超濾濃縮分離，微濾除菌過濾，添加保護劑，實現(xiàn)了工業(yè)化規(guī)模從蛋黃中分離提取高生物活性無菌卵黃抗體，年產(chǎn)10噸以上。本發(fā)明采用了生物免疫、膜分離等高新技術，具有技術含量高，資源利用度高，自動化程度高的特點，是清潔工藝生產(chǎn)綠色生物活性食品的典型代表。
【IPC分類】C07K16/02
【公開號】CN105218666
【申請?zhí)枴緾N201510770940
【發(fā)明人】盧曉露, 鄭輝, 楊嚴俊
【申請人】廣東京豪醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年11月12日