抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體制備方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體及其制備方法、效價(jià)檢測方法和應(yīng)用，特點(diǎn)是采用弗氏檸檬酸桿菌為抗原免疫蛋雞，收集高免疫雞蛋，將免疫雞蛋卵黃進(jìn)行分離和純化得到抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體，包括制備弗氏檸檬酸桿菌抗原并滅活步驟；將蛋雞進(jìn)行1次基礎(chǔ)免疫和3～4次加強(qiáng)免疫并收集雞蛋的步驟；最后通過離心分離、鹽析和透析得到產(chǎn)品的步驟；并采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的效價(jià)，該弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體可用于由弗氏檸檬酸桿菌引起的疾病的預(yù)防和治療上，并可用于開發(fā)弗氏檸檬酸桿菌檢測試劑盒和免疫學(xué)上的免疫反應(yīng)及診斷，優(yōu)點(diǎn)是該卵黃抗體純度較高，且對(duì)弗氏檸檬酸桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)高免卵黃的獲取廉價(jià)、方便，低成本、便于大批量生，其制備方法簡便易行。
【專利說明】
抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體制備方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物制品制備技術(shù)及應(yīng)用領(lǐng)域，尤其是涉及一種抗弗氏檸檬酸桿菌卵 黃抗體及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 弗氏梓檬酸桿菌（Citrobacter freundii)是一種條件致病菌，廣泛分布于自然界 中，為人和動(dòng)物腸道的正常菌群，和大腸菌群一樣，可視作糞便污染的衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)。在一定 的條件下，弗氏檸檬酸桿菌是一種"人-蓄"共患病病原菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)，可引起腹 瀉、尿路感染、創(chuàng)面感染、關(guān)節(jié)炎和敗血癥等；弗氏檸檬酸桿菌也可存在于食物中導(dǎo)致食物 中毒；同時(shí)，弗氏檸檬酸桿菌也是一種流行性很廣的水產(chǎn)動(dòng)物病原菌，對(duì)海水、淡水動(dòng)物均 能致病，常年來給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的損失。據(jù)報(bào)道，弗氏檸檬酸桿菌對(duì)中華絨螯蟹，紅螯 螯蝦，中華鱉，三疣梭子蟹，草魚，斑馬魚，大鯢，鯽魚等都有致病性，每年由于弗氏檸檬酸桿 菌引起的水產(chǎn)類疾病給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失，因此，若能對(duì)弗氏檸檬酸桿菌進(jìn)行及時(shí)的 防治，勢必能給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)減少損失。
[0003] 目前對(duì)于弗氏檸檬酸桿菌引起的疾病的防治手段最要有以下幾種：抗生素、中草 藥、滅活疫苗、單克隆抗體等。抗生素和化學(xué)藥物易引起應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)生物有不同程度的毒 性，且反復(fù)使用容易產(chǎn)生耐藥性，存在藥物殘留，在倡導(dǎo)綠色農(nóng)業(yè)的今天必將退出歷史舞 臺(tái)；中草藥的藥效持久，但卻很難迅速起效，且各地區(qū)中草藥藥性差別較大，使用不易控制， 多用于疾病預(yù)防；疫苗接種是防治細(xì)菌性疾病最直接有效的方法，國外已經(jīng)有多種商品化 疫苗出售，但我國水產(chǎn)疫苗研制起步晚，到目前為止僅有草魚出血病疫苗獲得了商品化生 產(chǎn)批準(zhǔn)，疫苗的研發(fā)、生產(chǎn)、銷售及廣泛使用都需要相當(dāng)長一段時(shí)間。
[0004] 雞卵黃抗體即卵黃中的免疫球蛋白（immunoglobulin of yolk，IgY)，是針對(duì)特定 抗原的，具有持續(xù)效價(jià)的高親和力抗體，它具有產(chǎn)率高、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是一種 易于生產(chǎn)、廉價(jià)的抗體，免疫1只雞所收集到的僅1個(gè)雞蛋中含有的特異性IgY的量（約 200mg)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于免疫1只兔所收集到的全部血清中的抗體量。IgY具有較強(qiáng)的耐酸、耐堿、 耐熱能力。卵黃抗體是一種無副作用無殘留對(duì)環(huán)境和人體溫和的蛋白質(zhì)，高效卵黃抗體可 以通過注射、拌餌投喂、浸泡等方式對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物起到保護(hù)劑疾病治療作用，還可用于免疫學(xué) 檢測等領(lǐng)域。目前，卵黃抗體在畜牧業(yè)上已經(jīng)得到較廣泛的關(guān)注和應(yīng)用，但在水產(chǎn)行業(yè)的研 究開發(fā)還處于基礎(chǔ)階段，目前在水產(chǎn)方面申請(qǐng)公開和授權(quán)的專利有抗對(duì)蝦病毒病、抗貝氏 隱孢子蟲病、抗副溶血弧菌病、抗鰻弧菌以及抗嗜水氣單胞菌的卵黃抗體，但是，目前還沒 有關(guān)于抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體及其制備方法和應(yīng)用的相關(guān)研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供提供一種抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體及其制 備方法、效價(jià)檢測方法和應(yīng)用，該卵黃抗體純度較高，且對(duì)弗氏檸檬酸桿菌有較強(qiáng)的抑制作 用，同時(shí)高免卵黃的獲取方便、廉價(jià)、低成本，便于大批量生，其制備方法簡便易行，可用于 由弗氏檸檬酸桿菌引起的疾病的預(yù)防和治療上及開發(fā)弗氏檸檬酸桿菌檢測試劑盒和免疫 學(xué)上的免疫反應(yīng)及診斷。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗 體，采用弗氏檸檬酸桿菌為抗原免疫蛋雞，收集高免疫雞蛋，將免疫雞蛋卵黃進(jìn)行分離和純 化得到抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體。
[0007] -種抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的制備方法，包括以下步驟：
[0008] (1)制備弗氏檸檬酸桿菌抗原并滅活
[0009] 接種弗氏檸檬酸桿菌于牛肉膏固體瓊脂培養(yǎng)基，30°C倒置培24h后，挑取單菌 落接種于牛肉膏液體培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm的條件下，搖床振蕩培養(yǎng)18h后，調(diào)節(jié)牛 肉膏液體培養(yǎng)基中的弗氏檸檬酸桿菌菌量為2X10 9CFU/ml，然后離心分離得到含有弗氏 檸檬酸桿菌的沉淀物和上清液，將沉淀物與無菌生理鹽水混合得到弗氏檸檬酸桿菌量為 2X10 9CFU/ml的菌懸液，加入甲醛使甲醛體積終濃度達(dá)0.5%，然后37°C恒溫水浴滅活 24h，即得到滅活的弗氏檸檬酸桿菌抗原，放4°C冰箱備用；
[0010] (2)免疫蛋雞并收集雞蛋
[0011] 將初產(chǎn)蛋的母雞進(jìn)行1次基礎(chǔ)免疫和3~4次加強(qiáng)免疫，所述的基礎(chǔ)免疫為在步 驟（1)得到的弗氏檸檬酸桿菌抗原中加入等量的弗氏完全佐劑，充分乳化后對(duì)蛋雞進(jìn)行注 射免疫，所述的加強(qiáng)免疫為在步驟（1)得到的弗氏檸檬酸桿菌抗原中加入等量的弗氏不完 全佐劑，充分乳化后對(duì)蛋雞進(jìn)行注射免疫，每次免疫間隔15天，完成免疫后10天，開始收集 雞蛋，于4°C冰箱保存；
[0012] (3)卵黃抗體分離和純化
[0013] 將步驟（2)得到的免疫雞蛋用酒精擦拭蛋殼并分離卵黃，然后在卵黃中加入卵黃 體積9倍的乙酸-乙酸鈉緩沖液，混勻后于4°C冰箱靜置10h，然后在4°C，10000g條件下離 心20min，得到初提純液，將初提純液進(jìn)行鹽析，將鹽析得到的沉淀用與卵黃等體積的濃度 為0. 01mol/L的pH為7. 2的PBS緩沖液重懸，最后用截留量為100KD的透析袋透析除鹽得 到抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體。
[0014] 步驟（3)中所述的鹽析過程為：首先向初提純液中加入終飽和度為40%的飽和 (NH 4)2S04,4°C冰箱靜置10h后，4°C，10000g，離心20min得到一次沉淀；然后將一次沉淀用 140g/L的Na 2S0^懸浮，4°C冰箱靜置10h后，4°C，10000g，離心20min得到二次沉淀，所述 的二次沉淀即為鹽析得到的沉淀。
[0015] -種抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的效價(jià)檢測方法，采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢 測抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的效價(jià)，具體包括如下步驟：以l〇 9CFU/ml弗氏檸檬酸桿菌包 被酶標(biāo)板，4°C冰箱靜置過夜，次日傾去孔內(nèi)液體，將孔用PBST洗滌液洗滌3次后加入含1 % BSA的封閉液，室溫封閉lh，洗滌3次后加入倍比稀釋的抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體，每梯 度設(shè)1個(gè)平行，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照和陰性對(duì)照，37°C溫浴2h后，洗滌3次，加入辣根過氧化 酶標(biāo)記的羊抗雞二抗，37°C溫浴lh，洗滌5次后加入0PD顯色液顯色15min，H 2S0j#止反應(yīng) 后用酶標(biāo)儀讀取波長492nm吸光值，待測樣品與陰性對(duì)照吸光值大于2. 1判定為陽性，最大 陽性稀釋度為抗體效價(jià)。
[0016] PBST洗滌液為吐溫-20與PBS緩沖液按體積比1 : 2000的比例混合得到。
[0017] -種抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的應(yīng)用，該弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體可用于由弗 氏檸檬酸桿菌引起的疾病的預(yù)防和治療上，并可用于開發(fā)弗氏檸檬酸桿菌檢測試劑盒和免 疫學(xué)上的免疫反應(yīng)及診斷。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明公開了一種抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃 抗體及其制備方法、效價(jià)檢測方法和應(yīng)用，該方法制備得到的卵黃抗體純度較高，且對(duì)弗氏 檸檬酸桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)高免卵黃的獲取廉價(jià)、方便，低成本、便于大批量生產(chǎn)， 其制備方法簡便易行，最終獲得的高產(chǎn)、高效、高純度的卵黃抗體可用于由弗氏檸檬酸桿菌 引起的疾病的預(yù)防和治療上及開發(fā)弗氏檸檬酸桿菌檢測試劑盒和免疫學(xué)上的免疫反應(yīng)及 診斷，該效價(jià)檢測方法檢測效率高，操作過程簡便易行。本發(fā)明首次提出了抗弗氏檸檬酸桿 菌卵黃抗體及其制備方法、效價(jià)檢測方法和應(yīng)用，填補(bǔ)了抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體相關(guān) 研究的空白，并為以后的研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0019] 圖1為抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體體細(xì)胞吞噬調(diào)理作用效果圖，左圖為抗弗氏檸 檬酸桿菌卵黃抗體、雞血與菌液混合物長勢，右圖為普通卵黃液、雞血與菌液混合物長勢。
[0020] 圖2為抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體體外抑菌效果圖，左為抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃 抗體與菌液混合物長勢，右為普通卵黃液與菌液混合物長勢。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0022] 一、具體實(shí)施例
[0023] 本發(fā)明一種抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體，通過制備弗氏檸檬酸桿菌滅活抗原免疫 雞蛋，收集高免疫雞蛋進(jìn)行分離和純化，并進(jìn)行蛋白濃度測定和SDS-PAGE檢測蛋白條帶判 斷純度，用間接ELISA檢測抗體效價(jià)，并進(jìn)行細(xì)胞吞噬調(diào)理實(shí)驗(yàn)、體外抑菌及體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn) 來確定效果，最終獲得高產(chǎn)、高效、高純度的卵黃抗體，其制備過程具體如下：
[0024] (1)制備弗氏檸檬酸桿菌抗原并滅活
[0025] 接種弗氏檸檬酸桿菌于牛肉膏固體瓊脂培養(yǎng)基，30°C倒置培養(yǎng)24h后，挑取單菌 落接種于牛肉膏液體培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm的條件下，搖床振蕩培養(yǎng)18h后，調(diào)節(jié)牛 肉膏液體培養(yǎng)基中的弗氏檸檬酸桿菌菌量為2X10 9CFU/ml，然后離心分離得到含有弗氏 檸檬酸桿菌的沉淀物和上清液，將沉淀物與無菌生理鹽水混合得到弗氏檸檬酸桿菌菌量 為2X 109CFU/ml的菌懸液，加入甲醛使甲醛體積終濃度達(dá)0. 5%，然后37°C恒溫水浴滅活 24h，即得到滅活的弗氏檸檬酸桿菌抗原，放4°C冰箱備用；
[0026] (2)免疫蛋雞并收集雞蛋
[0027] 將初產(chǎn)蛋母雞進(jìn)行1次基礎(chǔ)免疫和3~4次加強(qiáng)免疫，所述的基礎(chǔ)免疫為在步驟 (1)得到的弗氏檸檬酸桿菌抗原中加入等量的弗氏完全佐劑，充分乳化后對(duì)蛋雞進(jìn)行注射 免疫，所述的加強(qiáng)免疫為在步驟（1)得到的弗氏檸檬酸桿菌抗原中加入等量的弗氏不完全 佐劑，充分乳化后對(duì)蛋雞進(jìn)行注射免疫，每次免疫間隔15天，完成免疫后10天，開始收集雞 蛋，于4°C冰箱保存；
[0028] (3)卵黃抗體分離和純化
[0029] 取高免雞蛋，以75 %酒精擦拭蛋殼，去除蛋清，分離卵黃，吸取卵黃液10mL并按 體積比1 : 9加入pH 5. 0的乙酸-乙酸鈉緩沖液，充分混勻后于4°C冰箱靜置10h，4°C， lOOOOg條件下離心20min，得到初提純液進(jìn)行兩次鹽析。首先，向初提純液中加入飽和 (NH4) 2S04-使其終飽和度為40 %，4 °C冰箱靜置1 Oh，取出后4 °C，1 OOOOg，離心20min，然 后沉淀用100mL140g/L的似2304重懸浮，4°C冰箱靜置10h后lOOOOg離心20min，沉淀用 10mlPBS(0. 01mol/L，pH 7. 2)重懸，最后用截留量100KD透析袋透析除鹽得到抗弗氏檸檬 酸桿菌卵黃抗體，透析液為0.0 lmol/L，pH 7. 2的PBS，期間更換透析液3-5次。
[0030] 二、抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的鑒定
[0031] (1)濃度測定和純度檢測
[0032] 透析后蛋白液共計(jì)13mL，稀釋10倍后，測定260nm和280nm波長下吸光值分 別為2. 554和2. 141，根據(jù)公式（1. 45 X 0D2SQ-0. 74 X 0D26。）X稀釋倍數(shù)計(jì)算蛋白濃度為 12. 145mg/mL，總蛋白量約160mg在正常范圍內(nèi)，取蛋白液15 μ L與等量2X loading Buffer 混勻后煮沸l(wèi)〇min，進(jìn)行12%還原性SDS-PAGE電泳，重鏈、輕鏈分別位于66KD、26KD處條帶 較亮，總分子量約180KD，雜帶少、弱，純度較高。
[0033] (2)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)檢測效價(jià)
[0034] 以109CFU/ml弗氏檸檬酸桿菌包被酶標(biāo)板，每孔100 μ L，4°C冰箱靜置過夜，次日傾 去孔內(nèi)液體，將孔用PBST (PBST為吐溫-20與PBS緩沖液按體積比1 : 2000的比例混合） 洗滌液洗滌3次除去未被包被上的抗原雜質(zhì)后，加入含1 % BSA的封閉液100 μ L，室溫封閉 lh，洗 3 次后加入按 1 : 100，1 : 200，1 : 400，1 : 800，1 : 1600，1 : 3200，1 : 6400， 1 : 12800,1 : 25600稀釋的IgY 100 yL，每梯度設(shè)1個(gè)平行，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照和陰性 對(duì)照，37°C溫浴2h后洗滌3次，加入1 : 10000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗雞二抗 100 yL，37°C溫浴lh，洗滌5次后加入0PD顯色液顯色15min，用50 yL、2M的H2S04終止反 應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取波長492nm吸光值，待測樣品與陰性樣品吸光值大于2. 1判定為陽性，最大 陽性稀釋度為抗體效價(jià)。本次制備的抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體效價(jià)為1 : 12800。
[0035] (3)細(xì)胞吞噬調(diào)理實(shí)驗(yàn)
[0036] 用一次性注射器從雞體內(nèi)抽取雞血，轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，加入肝素抗凝，待用。 將純培養(yǎng)的弗氏檸檬酸桿菌稀釋至2 X 104CFU/mL，分別取100 μ L抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗 體和普通卵黃蛋白液，加入100 μ L的新鮮雞血和100 μ L菌液混勻后置于30°C培養(yǎng)箱結(jié)合 15min，取100 μ L混合液涂布牛肉膏瓊脂平板，各設(shè)1重復(fù)，30°C倒置培養(yǎng)24h后拍照計(jì)數(shù) 觀察。如圖1所示，實(shí)驗(yàn)表明：加入抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的一組能明顯抑制弗氏檸檬 酸桿菌的生長，其菌量是加入普通卵黃蛋白液組的1/10,這說明在一定濃度范圍內(nèi)，卵黃抗 體能明顯協(xié)助細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬調(diào)理作用，其細(xì)菌吞噬率增加了 90%。
[0037] (4)體外抑菌實(shí)驗(yàn)
[0038] 將純培養(yǎng)的弗氏檸檬酸桿菌稀釋至2 X 104CFU/mL，分別取100 μ L抗弗氏檸檬酸桿 菌卵黃抗體和普通卵黃蛋白液，加入等量菌液混勻后置30°C培養(yǎng)箱結(jié)合15min，取100 μ L 涂布牛肉膏瓊脂平板，各設(shè)1重復(fù)，30°C倒置培養(yǎng)24h后拍照計(jì)數(shù)。如圖2所示，抑菌實(shí)驗(yàn) 表明：加入抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的一組能明顯抑制弗氏檸檬酸桿菌的生長，其抑菌 效果有效平均值達(dá)到75%。
[0039] 三、抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的應(yīng)用
[0040] 挑選健壯克氏原螯蝦60只隨機(jī)分成6組，每組10只，按如下分組于螯蝦第3腹節(jié) 進(jìn)行注射，每只〇.151111。組1:2\10妙1]/1111弗氏檸檬酸桿菌菌與0.9%無菌生理鹽水1:1 混合；組2 :2X 109CFU/ml弗氏檸檬酸桿菌與普通卵黃蛋白液1 : 1混合；組3 :2X 109CFU/ ml弗氏檸檬酸桿菌與抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體1 : 1混合。組4 :2X 109CFU/ml弗氏檸 檬酸桿菌菌與〇.9%無菌生理鹽水1:2混合；組5:2\1(^^1]/1111弗氏檸檬酸桿菌與普通 卵黃蛋白液1 : 2混合；組6 :2X 109CFU/ml弗氏檸檬酸桿菌與抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體 1 : 2混合。常規(guī)飼養(yǎng)，觀察死亡情況。結(jié)果表明：注射后7天內(nèi)組1、組2和組4、組5的螯 蝦全部死亡，而組3和組6在7天內(nèi)分別存活4尾和7尾，保護(hù)率分別為40%和70%。這 說明，在一定濃度范圍內(nèi)，增加卵黃抗體的劑量能明顯抑制弗氏檸檬酸桿菌增長，理論上應(yīng) 該能達(dá)到100 %的克氏原螯蝦存活率。表明按本發(fā)明制備的抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體，對(duì) 受高濃度弗氏檸檬酸桿菌攻擊的螯蝦有明顯的保護(hù)作用和延遲死亡的作用，能夠運(yùn)用于水 產(chǎn)動(dòng)物預(yù)防和治療由弗氏檸檬酸桿菌導(dǎo)致的疾病。
[0041] 表1抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)
[0042]
[0044] 當(dāng)然，上述說明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體，其特征在于：采用弗氏檸檬酸桿菌為抗原免疫蛋 雞，收集高免疫雞蛋，將免疫雞蛋卵黃進(jìn)行分離和純化得到抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體。2. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的制備方法，其特征在于包 括以下步驟： (1) 制備弗氏檸檬酸桿菌抗原并滅活 接種弗氏檸檬酸桿菌于牛肉膏固體瓊脂培養(yǎng)基，30°C倒置培養(yǎng)24h后，挑取單菌落 接種于牛肉膏液體培養(yǎng)基中，在30 °C，200rpm的條件下，搖床振蕩培養(yǎng)18h后，調(diào)節(jié)牛肉 膏液體培養(yǎng)基中的弗氏檸檬酸桿菌菌量為2X109CFU/ml，然后離心分離得到含有弗氏檸 檬酸桿菌的沉淀物和上清液，將沉淀物與無菌生理鹽水混合得到弗氏檸檬酸桿菌菌量為 2X IO9CFUAiI的菌懸液，加入甲醛使甲醛體積終濃度達(dá)0.5%，然后37°C恒溫水浴滅活 24h，即得到滅活的弗氏檸檬酸桿菌抗原，放4°C冰箱備用； (2) 免疫蛋雞并收集雞蛋 將初產(chǎn)蛋母雞進(jìn)行1次基礎(chǔ)免疫和3~4次加強(qiáng)免疫，所述的基礎(chǔ)免疫為在步驟（1)得 到的弗氏檸檬酸桿菌抗原中加入等量的弗氏完全佐劑，充分乳化后對(duì)蛋雞進(jìn)行注射免疫， 所述的加強(qiáng)免疫為在步驟（1)得到的弗氏檸檬酸桿菌抗原中加入等量的弗氏不完全佐劑， 充分乳化后對(duì)蛋雞進(jìn)行注射免疫，每次免疫間隔15天，完成免疫后10天，開始收集雞蛋，于 4 °C冰箱保存； (3) 卵黃抗體分離和純化 將步驟（2)得到的免疫雞蛋用酒精擦拭蛋殼并分離卵黃，然后在卵黃中加入卵黃體積 9倍的乙酸-乙酸鈉緩沖液，混勻后于4°C冰箱靜置10h，然后在4°C，1000 Og條件下離心 20min，得到初提純液，將初提純液進(jìn)行鹽析，將鹽析得到的沉淀用與卵黃等體積的濃度為 0.0 lmol/L的pH為7. 2的PBS緩沖液重懸，最后用截留量為100KD的透析袋透析除鹽得到 抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的制備方法，其特征在于步驟 ⑶中所述的鹽析過程為：首先向初提純液中加入終飽和度為40%的飽和（NH 4)2S04,4°C冰 箱靜置IOh后，4°C，10000g，離心20min得到一次沉淀；然后將一次沉淀用140g/LNa 2S0^ 懸浮，4°C冰箱靜置IOh后，4°C，10000g，離心20min得到二次沉淀，所述的二次沉淀即為鹽 析得到的沉淀。4. 一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的效價(jià)檢測方法，其特征 在于采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的效價(jià)，具體包括如下步 驟：以IO 9CFUAiI弗氏檸檬酸桿菌包被酶標(biāo)板，4°C冰箱靜置過夜，次日傾去孔內(nèi)液體，將孔 用PBST洗滌液洗滌3次后加入含1 % BSA的封閉液，室溫封閉lh，洗滌3次后加入倍比稀 釋的抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體，每梯度設(shè)1平行，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照和陰性對(duì)照，37°C溫 浴2h后，洗滌3次，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗雞二抗，37°C溫浴lh，洗滌5次后加入OPD 顯色液顯色15min，H2SOjI止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀讀取波長492nm吸光值，待測樣品與陰性對(duì)照 吸光值大于2. 1判定為陽性，最大陽性稀釋度為抗體效價(jià)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的效價(jià)檢測方法，其特征在于： PBST洗滌液為吐溫-20與PBS緩沖液按體積比1 : 2000的比例混合得到。6. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗弗氏檸檬酸桿菌卵黃抗體的應(yīng)用，其特征在于：該弗 氏檸檬酸桿菌卵黃抗體可用于由弗氏檸檬酸桿菌引起的疾病的預(yù)防和治療上，并可用于開 發(fā)弗氏檸檬酸桿菌檢測試劑盒和免疫學(xué)上的免疫反應(yīng)及診斷。
【文檔編號(hào)】A61K39/40GK105884890SQ201410653416
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年11月14日
【發(fā)明人】李登峰, 章禮平, 劉聯(lián)國
【申請(qǐng)人】寧波大學(xué)