專利名稱：用于檢測(cè)弗氏枸櫞酸桿菌的靶基因及檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及用于檢測(cè)弗氏枸櫞酸桿菌的靶基因以及檢測(cè)該基因的引物和探針，本發(fā)明還涉及利用該引物和探針進(jìn)行弗氏枸櫞酸桿菌檢測(cè)的試劑盒。
背景技術(shù)：
弗氏枸櫞酸桿菌(Citrobacter freundii)屬于枸櫞酸桿菌屬,腸桿菌科。革蘭氏陰性桿菌，兼性厭氧，周身鞭毛，菌毛，無芽胞，無莢膜。弗氏枸櫞酸桿菌廣泛存在自然界，是人類和動(dòng)物腸道的寄生菌。已有文獻(xiàn)報(bào)道它可引起原發(fā)和繼發(fā)的感染。弗氏枸櫞酸桿菌可以在正常人和動(dòng)物的糞便以及環(huán)境中分離到。然而，研究者逐漸認(rèn)識(shí)到弗氏枸櫞酸桿菌可以引起腹瀉和其他感染如尿道感染、腦膜炎、膿毒癥以及醫(yī)院獲得性感染。 與其他腸道病原菌如大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌等相比，弗氏枸櫞酸桿菌很少被報(bào)道引起腹瀉等腸胃炎。這可能與臨床樣本篩查中，很少將弗氏枸櫞酸桿菌作為常規(guī)篩查的菌株。但是，弗氏枸櫞酸桿菌也能引起一些偶發(fā)和爆發(fā)的病例。弗氏枸櫞酸桿菌也引起類似大腸桿菌引起的重癥腸胃炎。Tschape等報(bào)道弗氏枸櫞酸桿菌在德國(guó)的一家托兒所和幼兒園引起的暴發(fā)，造成腸胃炎152例，其中8例發(fā)展為HUS。Ibenyassine等對(duì)食品進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)食品中發(fā)現(xiàn)弗氏枸櫞酸桿菌的檢出率可達(dá)18. 7%，我國(guó)的多個(gè)研究中也表明食品中弗氏枸櫞酸桿菌也有較高的分離率。在我國(guó)，一些食物中毒或腹瀉病人的糞便標(biāo)本中，不能分離到常見的致病菌，卻能分離到弗氏枸櫞酸桿菌。弗氏枸櫞酸桿菌也可能是院內(nèi)感染最重要的致病菌之一，2002年在日本名古屋的一所醫(yī)院外科發(fā)生了耐三代頭孢的弗氏枸櫞酸桿菌感染的小型暴發(fā)。研究提示弗氏枸櫞酸桿菌可能是一種尚未被人們充分認(rèn)識(shí)的腸道病原菌。在感染性腹瀉病原菌檢測(cè)過程中，往往忽略對(duì)弗氏枸櫞酸桿菌的檢測(cè)，且目前沒有特異的弗氏枸櫞酸桿菌的篩選培養(yǎng)基。弗氏枸櫞酸桿菌很難和其他腸道菌區(qū)別，目前只能通過生化鑒定來進(jìn)行分開。然而生物鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不利于臨床對(duì)病原菌快速檢測(cè)的要求。近年來,實(shí)時(shí)突光TaqMan PCR技術(shù)(real time TaqMan PCR, TaqMan是羅氏公司的注冊(cè)商標(biāo))廣泛應(yīng)用于多種病原微生物的檢測(cè)，與普通PCR方法相比較，實(shí)時(shí)熒光TaqManPCR技術(shù)在普通PCR的基礎(chǔ)上加入一條特異的熒光探針，并且該技術(shù)對(duì)引物與模板的同源性要求也高于普通PCR。實(shí)時(shí)熒光TaqMan PCR中的探針序列必須與目標(biāo)序列完全匹配，熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，但在PCR擴(kuò)增時(shí)，隨著引物的延伸Tag酶的5’到3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光檢測(cè)系統(tǒng)可接受到熒光信號(hào)。即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。因此實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法比普通PCR法具有更高的特異性。但是在熒光TaqMan PCR技術(shù)的應(yīng)用中，探針的選擇是一個(gè)重要因素，因?yàn)槠渖婕暗脚c引物的匹配，以及最關(guān)鍵的檢測(cè)特異性的問題。目前，在國(guó)內(nèi)外研究中，沒有對(duì)弗氏枸櫞酸桿菌進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供用于檢測(cè)弗氏枸櫞酸桿菌的靶基因。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供針對(duì)上述靶基因的特異性引物和探針；本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供檢測(cè)弗氏枸櫞酸桿菌的試劑盒?；谝陨夏康?，本發(fā)明對(duì)弗氏枸櫞酸桿菌的TTRP基因與NCBI上公布的其他細(xì)菌 的核苷酸序列進(jìn)行反復(fù)比對(duì)和篩選，發(fā)現(xiàn)弗氏枸櫞酸桿菌的TTRP基因僅與沙門氏菌同源性較高，同源性達(dá)到84%，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。而且該基因在100bp_650bp之間特異性很高，具有高度的保守性，可以很好的區(qū)分弗氏枸櫞酸桿菌與其相近的沙門氏菌和枸櫞酸桿菌屬的其他種。本發(fā)明針對(duì)弗氏枸櫞酸桿菌的一個(gè)三羧酸循環(huán)調(diào)控基因(簡(jiǎn)稱TTRP)特有序列設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，并將獲得的特異性引物和探針在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，以排除引物-探針與其他物種序列可能存在的非特異性匹配，最終獲得優(yōu)化后的引物、探針序列。進(jìn)一步，本發(fā)明提供用于特異性擴(kuò)增上述靶基因序列或其特異片段的引物，以及與所述引物配合使用的熒光探針。其中探針的5’標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM，3’標(biāo)記淬滅基團(tuán)BHQ1。上游引物選自于TTRP基因的第211到229位核苷酸。下游引物選自TTRP基因的第104到126位核苷酸。本發(fā)明提供的優(yōu)選的弓I物序列為上游引物GCAGGACAGGAAGCGTCTG，下游引物CAGCCGACCATCTTTTACATAGC。探針序列序列為FAM-AGCCGCTGAACGACTTCCAGACCA-BHQ1本發(fā)明提供一種弗氏枸櫞酸桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，包括以樣品總DNA為模板，利用本發(fā)明提供的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，同時(shí)設(shè)立無模板對(duì)照和陽性對(duì)照，根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)弗氏枸櫞酸桿菌的試劑盒，其包括上述能特異地?cái)U(kuò)增出如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或其特異性片段的特異性引物以及配合引物使用的Taqman 探針。本發(fā)明試劑盒的引物序列為上游引物GCAGGACAGGAAGCGTCTG，下游引物CAGCCGACCATCTTTTACATAGC。探針序列序列為FAM-AGCCGCTGAACGACTTCCAGACCA-BHQI本發(fā)明提供的試劑盒，還可進(jìn)一步包括DNA裂解液，熒光定量反應(yīng)液，陰性模板和陽性模板，所述陰性模板為雙蒸水，所述陽性模板為弗氏枸櫞酸桿菌基因組DNA。本發(fā)明的試劑盒，其20 μ L總工作體系為
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)弗氏枸櫞酸桿菌(Citrobacter freundii)的祀基因,其特征在于,其為三羧酸循環(huán)調(diào)控基因TTRP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一種用于檢測(cè)弗氏枸櫞酸桿菌的特異性引物，其特征在于，其擴(kuò)增產(chǎn)物為權(quán)利要求1所述靶基因或其特異性片段。
3.如權(quán)利要求2所述的特異性引物，其特征在于，其核苷酸序列為 上游引物GCAGGACAGGAAGCGTCTG， 下游引物CAGCCGACCATCTTTTACATAGC。
4.與權(quán)利要求2或3所述特異性引物配合使用的熒光探針。
5.如權(quán)利要求4所述的熒光探針，其核苷酸序列為 FAM-AGCCGCTGAACGACTTCCAGACCA-BHQI。
6.含有權(quán)利要求2或3所述引物和/或權(quán)利要求4或5所述探針的試劑盒。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括DNA裂解液、熒光定量反應(yīng)液、陰性模板、陽性模板，所述陰性模板為雙蒸水，所述陽性模板為弗氏枸櫞酸桿菌基因組DNA。
8.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，其20μ L總工作體系為 試劑體積pL濃度 2χ Premix, Ex, Taq10,0Ix 上游引物0.4ΙΟμΜ 下游引物0.4ΙΟμΜ 探針0.4ΙΟμΜ DNA模極1.0去核酸水7.8e
9.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，其工作程序?yàn)?5°C預(yù)變性30sec，l個(gè)循環(huán)；95°C變性5sec，60°C退火30sec，40個(gè)循環(huán)。
10.含有權(quán)利要求2或3所述引物和/或權(quán)利要求4或5所述探針的診斷試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測(cè)弗氏枸櫞酸桿菌的靶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供了實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和探針，引物和探針的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4。本發(fā)明還提供了檢測(cè)弗氏枸櫞酸桿菌的試劑盒。本發(fā)明的檢測(cè)方法及其試劑盒具有檢測(cè)準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的臨床標(biāo)本檢測(cè)能力。
文檔編號(hào)C12N15/31GK103014024SQ20121051968
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月6日
發(fā)明者劉麗云, 金東 , 王藝婷, 徐建國(guó), 葉長(zhǎng)蕓 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所