專利名稱：：肌醇六磷酸酶變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及與源自布氏檸檬酸桿菌(Citrobacterbraakii)ATCC51113的肌醇六磷酸酶具有至少74%同一性并與該肌醇六磷酸酶相比包含至少一個變化的肌醇六磷酸酶(即，是其變體)。本發(fā)明還涉及編碼這些肌醇六磷酸酶的DNA,它們的制備方法，以及它們的用途，例如在動物飼料和動物飼料添加劑中的用途。布氏檸檬酸桿菌ATCC51113肌醇六磷酸酶的成熟部分作為SEQIDNO:2包括于序列表中。
背景技術(shù)：
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背景技術(shù)：
：來自布氏檸檬酸桿菌的phyA基因的序列已經(jīng)由Zinin等向EMBL/GenBank/DDBJ數(shù)據(jù)庫提交，登錄號為AY390262。相應(yīng)的肌醇六磷酸酶氨基S吏序列以登錄號Q676V7存在于UniProt/TrEMBL數(shù)據(jù)庫。Q676V7預(yù)期的成熟部分作為SEQIDNO:4包括在本發(fā)明的序列表中。WO-2004/085638以SEQIDNO:7公開了來自保藏為KCCM10427的布氏檸檬酸桿菌YH-15的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列。將該氨基酸序列的成熟部分作為SEQIDNO:3包括于此。該序列還存在于凄t據(jù)庫Geneseqp中，登錄號為ADU50737。WO2006/037328公開了布氏檸檬酸桿菌ATCC51113的野生型肌醇六磷酸酶(即，本文的SEQIDNO:2)，以及同樣包括在本序列表中的它的變體，即作為SEQIDNO:6。WO2006/038062和WO2006/038128都公開了以登錄號NCIMB41247保藏的弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)P3-42肌醇六磷酸酶基因的氨基酸序列。該氨基酸序列作為SEQIDN0:9被包括于此。本發(fā)明的一個目的是提供具有修改的，優(yōu)選改進(jìn)的特性的肌醇六磷酸酶。這些特性的非限制性實例是熱穩(wěn)定性，溫度曲線，pH曲線，比活性，在動物飼料中的性能，蛋白酶敏感性和/或糖基化模式。發(fā)明概述本發(fā)明涉及肌醇六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少74%同一性并與SEQIDNO:2相比在選自下組中的至少一個位置上包含至少一個變化1，2,3，4,5，31,41，46,52，53,55，57,59，74，76,82，84，91，99,100，104，105，107，109，111，114,115，116,117，118,119，120，121，122，123,124，136,137，141，154，161，162，164,167,m，176，177,179，180，181，182,183，184，185，186，196，199，200,202，203，218,223，239,240，241，247，273，276,281，282,283，284，285,286，289,294,299，308，314，316,324,331，339，351，355,362,379,385,406，409,410和411;條件是該肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO:3，不是SEQIDNO:4，并且不是SEQIDNO:6。本發(fā)明還涉及fl醇六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少74%同一性并包含至少一個下列變化1H,K,R,60P,105E，106A，G，155F,157F,173P,175L,188P，205P，215M，231P,254Y,280P,330D和/或371P;條件是該肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO:3，不是SEQIDNO:4，不是SEQIDNO:6，并且不是SEQIDNO:9及在圖1中列出的它的變體。本發(fā)明還涉及編碼這些肌醇六磷酸酶的DNA，它們的制備方法，以及它們的用途，例如在動物飼料和動物飼料添加劑中的用途。附圖筒述圖1對應(yīng)于WO2006/038062的表2并公開了具有SEQIDNO:9氨基酸序列的弗氏檸檬酸桿菌NCIMB41247肌醇六磷酸酶的多種變體；圖2是SEQIDNO:2和9的肌醇六磷酸酶的比對。圖1中的位置號參考SEQIDNO:9的編號方式。相對應(yīng)的SEQIDNO:2位置可以通過減去22得到(例如，應(yīng)用本申請的編號方式圖1的變體P229S的意思是變體P207S)。7發(fā)明詳述第一方面，本發(fā)明涉及肌醇六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少74%同一性并與SEQIDNO:2相比在選自下組中的至少一個位置上包含至少一個變化1，2,3，4，5，31,41,46,52,53,55，57，59，74，76，82，84,91,99,100，104，105,107，109,111，114,115，116,117，118，119，120，121,122,123,124,136，137，141，154，161,162,164，167，171，176,177，179，180,181，182，183,184，185,186,196，199，200，202,203，218,223,239，240，241，247，273,276,281，282,283,284,285，286，289，294，299，308，314，316，324，331，339，351,355,362，379,385，406,409，410和411;條件是該月幾醇六磷酸酶不是SEQIDNO:3，不是SEQIDNO:4，并且不是SEQIDNO:6。如在"肌醇六磷酸酶多肽，同一性百分比"一節(jié)中所述來確定同一性百分比。位置號參考SEQIDNO:2的位置編號方式，如在"位置編號方式"一節(jié)中所述。其它肌醇六磷酸酶中與這些SEQIDNO:2位置號相對應(yīng)的位置如"確定相應(yīng)位置號"一節(jié)中所述來確定。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶是SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶的變體，即其與SEQIDNO:2不同，因為其與SEQIDNO:2相比包含至少一個變化。在一具體實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶與SEQIDNO:2相比在選自下組的至少一個位置上包含至少一個變化1，2，3,4,5,31,46，52，53，55，57,59，76,82，99,100，107,109，111,114，115，116,117，118，119，120,121,122,123,124,137，141，161，162，164，167，179,180，181，182，183,184，185,186,196,199,200，202，218，223，241,273,276,285,286，299，314，331，339，362,379，385，406,410和411。在另一具體實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO:9。在更進(jìn)一步的具體實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶不是圖l列出的SEQIDNO:9的變體。在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶包含至少一個下列變化1*,2*，3*，4P,5P，31C，T，41P，46C,D,E，52C,E，53V,Q，55D,I，57Y59C，74A,76G,82E，84Y,91C,P，99C，IOOC，104A，105F，107D，E，G，109A，G,111P,114H,N,T，115Q,116A,E，P,T,Q，117D,E,K,1181,L,M,T,119G，K,R,S，120K,S，T，Q，121A，D，M,P,T，V,122D，123P,S，124L,T，V,136P，137P，141C，154P，161P,162C，164D,E，167Q，171T,176C，177C,179QI,K,N,Q,180A，E,G，T，181D,QI，K，182H，K，S，Q,183A,L,P,S,V，Q，184*,185*,186*，196Q，199C,200K，R,202N,203T，218Q，223E，239Q,240P，241Q,247C，273L,Q，276K,R,281H,282P，283P，284P,285QN，R,286K,Q,289P,294T,299L,308A3314，，316D,324N,331K,339D，351Y，355P,362K，R,379K，R,385D，406A，409D，E，410D，E和/或411R,K。本文對于變化用到的命名法在"變化，如取代，缺失，插入。"一節(jié)中詳纟田4苗述。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶優(yōu)選包含至少一個下列變化1*,2*,3*，4P，5P，31C，46E,52C，E，53V，55D,57Y，59C，76G,82E，99C，IOOC，107D,E，G,109A,111P,114T,115Q,116AT,117D,118T,119K,R，S，120S，121D，P，T，122D,123P，124L,137P,141C,161P，162C，164E,167Q，179K，180E,T，181D,K，182H，K,Q,183L,V,Q,184*，185*,186*，196Q,199C,200K，202N，218Q，223E，241Q,273L，276K,R，285G，R，286Q,299L，314QN，331K,339D，362K,R,379K,R，385D,406A，410D，E和/或411R，K;和/或其中位置179，180，181,182，183,184，185和186的氨基酸已經(jīng)由KEKHQ,KEKQQ,KEKKV或KTDKL取代。在另一優(yōu)選實施方式中，位置179,180,181,182,183,184,185和186的氨基酸已經(jīng)由QADKP,GEDKP，NGISA,IAGKS，KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL取代。本發(fā)明還涉及與SEQIDNO:2具有至少74%的同一性并包含至少一個下列變化的肌醇六磷酸酶1H，K，R，60P,105E,106A,G,155F,157F，173P，175L，188P,205P，215M，231P,254Y,280P,330D和/或371P;條件是該肌醇六磷酸酶不是SEQIDN0:3，不是SEQIDNO:4，不是SEQIDNO:6，并且不是SEQIDNO:9及在圖1中列出的它的變體。在一優(yōu)選的實施方式中肌醇六磷酸酶包含變化1K。在其他的優(yōu)選實施方式中，肌醇六磷酸酶包含下列變化組合280P/282P/283P，155F/254Y和/或155F/157F/254Y。本發(fā)明優(yōu)選的MJf六磷酸酶包含選自下列的一個變化52C，141C,162C，31C，52C,99C,59C,IOOC，141C/199C，4P,5P,lllP，137P，161P，52E,57Y，76G,107D，107G,109A，1*,1*/2*,1*/2*/3*,121T，273L，285G,286Q，299L，362K，331K/55D，107E，46E,82E,119R，119K，164E，223E，276R，276K，362R,379R，379K，385D,410D,410E，411R,411K,53V，121D，167Q，196Q，200K,202N，218Q，241Q,285N,314N,314G，頓A，179K/180E/181K/182H/183Q/184*/185*/186*，179K/180E/181K/182Q/183Q/184*/185*/186*，179K/180E/18IK/182K/183V/l84*/185*/186*,179K/180T/181D/182K/183L/184*/185*/186*，111P/241Q,IK,本發(fā)明的肌醇六磷酸酶可以是任何野生型的或變體肌醇六磷酸酶的變體。在具體的實施方式中，它是SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:9的肌醇六磷酸酶的變體，或與SEQIDNO:9相關(guān)的并在圖1中列出的任何一種肌醇六磷酸酶變體的變體。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶可以進(jìn)一步包含一個變化(取代)或多個變化(取代)的組合，它們選自圖1各行中所列出的變化(取代)或變化(取代)的組合。尤其優(yōu)選的SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶的變體是下列R339D，N4P,G5P，Q111P，El*，El*/E2*，El*/E2*/Q3*，M273L和N286K;以及它們的任意組合；以及SEQIDNO:3，4和6的相應(yīng)變體。本發(fā)明尤其優(yōu)選的肌醇六磷酸酶包含至少一個下列變化339D,4P，5P，111P，1*，1*/2*，1*/2*/3*，273L和/或286K。本發(fā)明還涉及與SEQIDNO:2具有至少74%同一性并包含至少一個下列變化的肌醇六磷酸酶(i)141C/199C,91C/46C，52C/99C，31C/176C，31C/177C,59C/100C和/或162C/247C;(ii)41P,91P,136P,137P,154P，161P，355P,111P，240P,282P,283P，284P,289P,4P和/或5P;(iii)52E,551，57Y，104A/105F,107D,G,109A,G,76G,84Y，121T，362K，273L，Q，285QR，286K,Q，294T，299L，331K/55D和/或351Y;(iv)1*，1*/2*或1*/2*/3*;(v)其中K179,T180，T181,E182,K183,S184,T185和K186已經(jīng)由QADKP，GEDKP，NGISA，IAGKS,KEKHQ，KEKQQ,KEKKV或KTDKL取代；(vi)119R,K和/或411R,K;(vii)107E和/或164E，D;(viii)362R，K,276R，K,379R,K，409D,E，223E,385D,46D,E,410D，E和/或82E;(ix)218Q,324N,200R，K，121D，196Q，202N,楊A(yù)，167Q,53V，Q，241Q,314N,G,239Q和/或285N;(xi)31T,74A,171T，203T,281H，316D和/或308A;和/或(xii)339D。制備變體的策略通過同源性建模(modeling),利用大腸桿菌(E.coli)AppA肌醇六磷酸酶的結(jié)構(gòu)作為模板(ProteinDataBankid.:IDKO;Lim等，Nat.Struct.Biol.(2000):vol.2，pp.108-113(第二巻，第108-113頁))構(gòu)建布氏檸檬酸桿菌ATCC51113肌醇六磷酸酶的結(jié)構(gòu)。對該結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子動力學(xué)(MD^莫擬和靜電計算。還鑒定了推定的二硫4建(disulfidebridges)和脯氨酸的位置，以及與各種合乎需要的酶特性有關(guān)的潛在重要性的其他位點。最后，鑒定了推定的糖基化位點(NXT或NXS的伸展(stretches))。在模型化結(jié)構(gòu)和模擬結(jié)果的框架之內(nèi)對所有的這些提議進(jìn)行評估，尤其著重在高溫端評估熱穩(wěn)定性。相對應(yīng)的肌醇六磷酸酶變體通過本領(lǐng)域所熟知的方法制備并如在實驗部分中所述進(jìn)行測試。li肌醇六磷酸酶多肽，同一性百分比在本文中肌醇六磷酸酶是具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，即催化肌醇六磷酸(鹽)(phytase)(肌醇六磷酸鹽(myo-inositolhexakisphosphate))的水解生成(1)肌醇(myo-inositol)和/或p)它的單，二，三，四和/或五磷酸鹽以及(3)無機(jī)磷酸。在本文中術(shù)語肌醇六磷酸酶底物包括，但不限于(i.a.)，肌醇六磷酸和任何肌醇六磷酸鹽(肌醇六磷酸的鹽)，以及在上面的(2)中所列出的磷酸鹽。網(wǎng)絡(luò)上的ENZYME網(wǎng)站(http:〃www.expasy.ch/enzyme/)是酶的命名法相關(guān)的信息庫。它主要依據(jù)國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)協(xié)會命名委員會andMolecularBiology)的建議，它描述了提供有EC(酶委員會)號的經(jīng)表征的酶的各種類型(BairochA.TheENZYMEdatabase,2000，NucleicAcidsRes28:304-305)。還可參見NC-IUBMB的酶命名手冊，1992。根據(jù)ENZYME網(wǎng)站，已知有三種不同類型的肌醇六磷酸酶所謂的3-肌醇六磷酸酶(別名l-肌醇六磷酸酶；肌醇六磷酸鹽3-磷酸水解酶，EC3.1.3.8),所謂的4-肌醇六磷酸酶(別名6-肌醇六磷酸酶，基于1L編號系統(tǒng)而不是ID編號的名稱，EC3.1.3.26),以及所謂的5-肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.72)。就本發(fā)明而言，將全部三種包括在肌醇六磷酸酶的定義中。在一具體實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶屬于酸性組氨酸磷酸酶家族，包括大腸桿菌pH2.5酸性磷酸酶(基因appA)以及真菌的肌醇六磷酸酶如泡盛曲霉(Aspergillusawamorii)肌醇六磷酸酶A和B(EC:3.1,3.8)(基因phyA和phyB)。各組氨酸酸性磷酸酶共同具有兩個區(qū)的序列相似性，每個區(qū)圍繞著一個保守的組氨酸殘基中心。這兩個組氨酸看起來象參與了酶的催化機(jī)制。第一個組氨酸位于N-末端部分并形成磷-組氨酸中間體，而第二個位于C-末端部分并且可能作為質(zhì)子供體發(fā)揮作用。在更具體的實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶具有保守的活性位點基序，即R-H-G-X-R-X-P，其中X代表任何氨基酸(參見SEQIDNOs:2，3,4,6的氨基酸16到22以及SEQIDNO:9的氨基酸38-44)。在一優(yōu)選實施方式中，保守的活性位點基序為R-H-G-V-R-A-P，即氨基酸16-22(參考SEQIDNO:2)是RHGVRAP。就本發(fā)明而言，肌醇六磷酸酶的活性以FYT單位來確定，一個FYT是12在下列條件下每分鐘釋放1微摩爾無機(jī)正磷酸的酶量pH5.5;溫度37。C;底物濃度為0.0050mo1/1的肌醇六磷酸鈉(C6H6024P6Na！2)。適當(dāng)?shù)募〈剂姿崦笢y定法是在WO00/20569的實施例1種描述的FYT和FTU測定法。FTU用于測定飼料和預(yù)混合物中的肌醇六磷酸酶活性。還可以利用實施例1("磷酸酶活性的測定"或"肌醇六磷酸酶活性的測定")中的測定法來確定肌醇六^l酸酶的活性。在一具體實施方式中本發(fā)明的肌醇六磷酸酶是分離的。本文所用的術(shù)語"分離的"是指如由SDS-PAGE確定的，至少20%純的，優(yōu)選至少40%純的，更優(yōu)選至少60%純的，還更優(yōu)選至少80%純的，最優(yōu)選至少90%純的，甚至最優(yōu)選至少95%純的多肽。具體的，優(yōu)選多肽為"基本上(essentially)純的形式"，即，所述多肽制備物基本上不含(essentiallyfreeof)與其天然結(jié)合(nativelyassociated)的其他多肽原料。例如，這可以通過用熟知的重組方法或經(jīng)典的純化方法制備多肽來實現(xiàn)。兩個氨基酸序列之間的相關(guān)性通過參數(shù)"同一性，，來描述。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列的比對通過利用來自EMBOSS軟件包(http:〃emboss,org)版本2.8.0的Needle程序來確定。Needle程序執(zhí)行在NeedlemanS.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453中描述的全局比對算法(globalalignmentalgorithm)。所用的取代矩陣是BLOSUM62,缺口開啟罰分(gapopeningpenalty)是10，并且缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)是0.5。本發(fā)明的氨基酸序列("發(fā)明序列")和權(quán)利要求中涉及的氨基酸序列(SEQIDNO:2)之間的同一性程度，是通過兩個序列比對中精確匹配的數(shù)目，除以"發(fā)明序列，，的長度或SEQIDNO:2的長度中最短的一個來計算。結(jié)果以百分比同一性表示。當(dāng)"發(fā)明序列"和SEQIDNO:2在重疊的相同位置具有相同的氨基酸殘基時發(fā)生精確匹配(在下文的比對實例中用T代表這種情況)。序列的長度是序列中的氨基酸殘基數(shù)(例如SEQIDNO:2的氨基酸1-411的長度是411)。實施例13是SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶和SEQIDNO:9的月幾醇六磷酸酶的比對實例，該實例說明了如何計算這兩條主鏈的同一性百分比。在下面另一個純假定的比對實例中，重疊是序列1的氨基酸序列"HTWGER-NL，，；或序列2的氨基S^歹'J"HGWGEDANL"。在該實例中缺口用"-"表示。13有支定的比對實例序歹'J1:ACMSHTWGER-NLIIIIII序列2:HGWGEDANLA麗PS在一具體實施方式中，多肽的氨基酸序列與或相對于SEQIDN0:2的同一性百分比如下測定i)使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩陣，缺口開啟罰分10和缺口延伸罰分0.5，比對兩個氨基酸序列；ii)計數(shù)比對中精確匹配數(shù)；iii)用兩個氨基酸序列中的最短序列的長度除精確匹配數(shù)，iv)將iii)除得的結(jié)果轉(zhuǎn)換成百分比。在上面的假定實例中，精確匹配數(shù)是6，兩個氨基酸序列中最短序列的長度是12;因此同一性百分比是50%。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的具體實施方式中，與SEQIDNO:2的同一性程度為至少75%，76%，77%,78%，79%,80%,81%，82%,83%，84%,85%，86%,87%,88%，89%,90%，91%,92%,93%，94%,95%,96%，97%,98%或至少99%。在更具體的實施方式中，同一性程度為至少98.0%,98.2%,98.4%,98.6%，98.8%，99.0%,99.1%，99.2%,99.3%,99.4%，99.5%,99.6%,99.7%，99.8%或至少99.9%。在可選擇的實施方式中，同一性程度為至少70%，71%,72°/?；蛑辽?3%。在更進(jìn)一步的具體實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶如與SEQIDNO:2相比具有不超過1，2，3，4,5，6，7,8，9或不超過10個變化；如與SEQIDNO:2相比具有不超過11，12,13，14,15，16，17,18,19或不超過20個變化；如與SEQIDNO:2相比具有不超過21，22,23，24,25，26,27，28,29或不超過30個變化；如與SEQIDNO:2相比具有不超過31,32，33，34,35，36,37，38,39或不超過40個變化；如與SEQIDNO:2相比具有不超過41，42，43,44,45，46，47,48，49或不超過50個變化；如與SEQIDNO:2相比具有不超過51，52，53，54，55,56,57,58，59或不超過60個變化；如與SEQIDNO:2相比具有不超過61,62，63，64，65，66，67，68，69或不超過70個變化；如與SEQIDNO:2相比具有不超過71,72，73，74，75,76，77,78,79或不超過80個變化；如與SEQIDNO:2相比具有不超過81，82,83，84，85，86，87，88，89或不超過90個變化；如與SEQIDNO:2相比具有不超過91,92，93，94，95，96，97，98，99或不超過IOO個變化；如與SEQIDNO:2相比具有不超過101，102，103，104，105,106，107,108，109或不超過110個變化；如與SEQIDNO:2相比具有不超過lll,112，113,114,115，116，117，118，119或不超過120個變化；如與SEQIDNO:2相比具有不超過121，122，123或124個變化。位置編號本文所用的定義氨基酸位置的命名法是基于源自布氏檸檬酸桿菌ATCC51113的肌醇六磷酸酶氨基酸序列，其成熟序列在序列表中作為SEQIDNO:2給出(SEQIDNO:2的氨基酸1-411)。因此,在本文中，用于編號位置的基礎(chǔ)是SEQIDNO:2，從El開始到E411終止。當(dāng)用于本文時術(shù)語"成熟"部分(或序列)是指由含有編碼該多肽的多核苷酸作為其部分遺傳部件(geneticequipment)的細(xì)胞分泌的多肽部分。換句話說，成熟多肽部分是指在已經(jīng)切掉信號肽部分，以及前肽部分(如果存在任何前肽部分的話)以后所剩余的多肽部分。信號肽部分可以通過本領(lǐng)域所熟知的程序軟件進(jìn)行預(yù)測(例如SignalP)。將預(yù)期的SEQIDNO:2信號肽部分作為SEQIDNO:8包含在本發(fā)明的序列表中，SEQIDNO:8由SEQIDNO:7編碼。SEQIDNO:2是預(yù)期的成熟部分。通常地，酶的成熟部分的第一個氨基酸可以通過對純化酶的N-末端測序來確定。則信號肽部分和成熟部分之間的任何差異必然歸因于前肽的存在。變化，如取代，缺失，插入肌醇六磷酸酶的變體相對于模板(即參照或比較的氨基酸序列如SEQIDNO:2)可以包含各種類型的變化一個氨基酸可以用另一個氨基酸所取代；可以缺失一個氨基酸；可以插入一個氨基酸；以及任意數(shù)目的這些變化的任意組合。在本文中術(shù)語"插入，，意在還包括N-末端和/或C-末端的延伸。本文對單獨變化所用的一般命名法如下XDcY，其中"X，，和"Y"各自獨立地代表單字母的氨基酸代碼，或"*，，(氨基酸的缺失)，"D，，代表數(shù)字，而"c"代表字母順序計數(shù)(a，b，c等等)，其只存在于插入中。以下面的表1作為參考，其描述了該命名法應(yīng)用于各種類型的變化的完全假定的實例。圖表l類型描述實例取代x^莫板中的氨基酸D—莫板中的位置c空缺Y二變體中的氨基酸G80A80AA固SIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGlimil:llllllllllllllllllllllAALNNSIAVLGVAPSAELYAV跳GASGSG插入x—"*"D二模板中在插入之前的位置c="a"表示在該位置的第一個插入，"b"表示下一個，等等*80aT*80bY*85aS8085AALNNSIG..VLGVA.PSAELYAVKVLGASGiiiiiiiimil111111111111mAALNNSIGTYVLGVASPSAELYAVKVLGASG刪除x—莫板中的氨基酸D—莫板中的位置c空缺Y="*"V81*80AALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGIIIIIIII11111111111111ill1111AA固SIG.LGVAPSAELYAV跳GASGSGN-末端延伸在位置"o"的插入*OaA*ObT*OcG1...AQSVPWGISRVQ111111111111ATGAQSVPWGISRVQC-末端延伸在N-末端氨基酸后的插入*275aS*275bT270275ATSLGST亂YGSGLVNAEAATR..1111111111111111111111ATSLGSTNLYGSGL職EAATRST如上面所解釋的，位置數(shù)("D")是從SEQIDN0:2的第一個氨基酸殘基開始計數(shù)。在同一序列中的幾個變化用"/"(斜線)分隔開，例如標(biāo)識"1*/2*/3*"表示在16位置號1,的氨基酸全部缺失，標(biāo)識"104A/105F，表示位置號104的氨基酸被A取代，并且位置號105的氨基酸被F取代?？蛇x擇的變化用"，，，(逗號)分隔開，例如，標(biāo)識"119R，K，，表示位置119上的氨基酸被R或K取代。本文在各種其他不勝枚舉的可能性中所用的逗號(，)表示它們通常在語法上的作用，即通常是和/或。例如，列表"53V,Q，121D和/或167Q"中第一個逗號表示二中選一(ViQ),而后面的兩個逗號應(yīng)理解為和/或的選擇:53V或Q，和/或121D，和/或167Q。在本文中，"至少一個"(例如變化)表示一個或多個，例如l，2,3，4，5，6,7，8，9或IO個變化；或12，14，15,16，18,20，22，24,25，28或30個變化；等等，直至最多的變化數(shù)目125，130，140,150，160，170，180，l卯或200個。然而，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶變體還必需與SEQIDNO:2具有至少74%的同一性，這個百分比如上所述確定。對用什么取代或延伸沒有進(jìn)行任何指定的取代或延伸是指插入任何天然的，或非天然的氨基酸，除了占據(jù)模板中該位置的氨基酸以外。實施例13為如何應(yīng)用這種命名法提供了進(jìn)一步的解釋說明。鑒定相應(yīng)的位置號如上面所解釋，使用布氏檸檬酸桿菌ATCC51113(SEQIDNO:2)的成熟肌醇六磷酸酶作為位置編號的標(biāo)準(zhǔn)，因此也是命名法的標(biāo)準(zhǔn)。對于其他肌醇六磷酸酶，尤其是本發(fā)明的肌醇六磷酸酶變體，對應(yīng)于SEQIDNO:2中位置D的位置通過在名為"肌醇六磷酸酶多肽，同一性百分比"一節(jié)中所詳細(xì)說明的方法比對兩個序列來查找到。從比對中，本發(fā)明序列中與SEQIDNO:2的位置D相對應(yīng)的位置可以清晰地和明白地鑒定出來(在比對中互在對方頂部的那兩個位置)。實施例13是SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶與SEQIDNO:9的肌醇六磷酸酶的比對實例，該實例展示了這兩條主鏈中的相應(yīng)位置是如何鑒定的。其他一些的完全假設(shè)的實例也包括在內(nèi)，這些實例源自上文的表l，表1在第三列中包括一批兩條序列的比對參照表l的第一行的第三格上面的序列為模板，下面的是變體。位置號80是指模板中的氨基酸殘基G。氨基酸A占據(jù)了變體中的相應(yīng)位置。因此，該取f^表示為G80A。17現(xiàn)在參照表l的第二行的第三格上面的序列還是模板而下面是變體。位置號80仍是指模板中的氨基酸殘基G。變體有兩個插入，即，TY,在模板的G80后而V81前。而T和Y當(dāng)然會有它們自己在變體氨基酸序列中"實際"的位置號，就目前的情況而言我們總是參照模板中的位置號，于是將T和Y稱為分別在位置號80a和80b。最后，參照表l的最后一行第三格位置號275是指模板的最后一個氨基酸。C-末端的延伸ST分別稱為在位置號275a和275b,同樣盡管它們當(dāng)然也具有它們自己"實際"的在變體氨基酸序列中的位置號。修改的特性，參考肌醇六磷酸酶在一具體實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶具有修改的，優(yōu)選是改進(jìn)的特性。術(shù)語"修改"和"改進(jìn)，，意指與另一種肌醇六磷酸酶相比較。這些其他的用于參考或比較的肌醇六磷酸酶實例是SEQIDNO:3和/或SEQIDNO:4。參考肌醇六磷酸酶的更進(jìn)一步的實例可以是SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:6。參考肌醇六磷酸酶的更進(jìn)一步的實例可以是SEQIDNO:9，以及在圖1中公開的它的變體。修改的，優(yōu)選為改進(jìn)的特性的非限定性實例如下熱穩(wěn)定性，pH曲線，比活性，在動物飼料中的性能，蛋白酶敏感性和/或糖基化模式。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶還可以具有修改的，優(yōu)選改進(jìn)的，溫度曲線，和/或其可以摻入潛在蛋白酶切割位點的變化。熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性，或溫度穩(wěn)定性，可以如實施例l題目為"溫度穩(wěn)定性的測定"部分所述來測定。因此，在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶具有比參考肌醇六磷酸酶高的剩余活性，其中剩余活性如下測定將發(fā)酵上清分成兩部分，一部分在預(yù)期提高的溫度下溫育30分鐘，另一部分在5。C溫育30分鐘，然后于37。C和pH5.5測定二者針對對硝基苯磷酸的活性，用在提高的溫度下溫育的樣品的活性除以在5。C溫育的相同樣品的活性。優(yōu)選的提高的溫度是50。C，55。C,60。C,65°C,70。C，75。C,80°C或85。C。如果需要的話，含酶的樣品可以在0.1MNaAcpH5.5中稀釋。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的剩余活性優(yōu)選是參考肌醇六磷酸酶剩余活性的至少105%，或至少110%，120%，130%，140%，150%。在更進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的剩余活性是參考肌醇六磷酸酶剩余活性的至少200%,或至少250%，300%,400%或至少500%。在更進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的剩余活性是參考肌醇六磷酸酶剩余活性的至少2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，10倍，15倍，20倍或至少25倍。熱穩(wěn)定性還可以通過實施例5中所述來測定。因此，在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶具有比參考肌醇六磷酸酶高的剩余活性，其中剩余活性如下測定將發(fā)酵上清分成兩部分，一部分在50。C溫育30分鐘，另一部分在5。C溫育30分鐘，接著在37。CpH5.5測定二者針對對硝基苯磷酸的活性，用在提高的溫度下溫育的樣品的活性除以在5。C溫育的相同樣品的活性。如果需要，含酶的樣品可以在0.1MNaAcpH5.5中稀釋。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的剩余活性優(yōu)選是SEQIDN0:3的參考肌醇六磷酸酶剩余活性的至少2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，10倍，15倍，20倍或至少25倍。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的剩余活性優(yōu)選是SEQIDN0:2的參考肌醇六磷酸酶剩余活性的至少105%，或至少110%,120%,130%，140%，150%,160%，170%，180%,190%或至少200%。下列取代是尤其優(yōu)選的，因為它們使熱穩(wěn)定性與SEQIDNO:3的肌醇六磷酸酶以及SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶相比有所改進(jìn)(見表3):4P，5P，111P,1*，1*/2*，1*/2*/3*，273L和/或286Q。熱穩(wěn)定性還可以如實施例8中所述來測定。因此，在一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶具有比參考肌醇六磷酸酶高的剩余活性，其中剩余活性如下測定將發(fā)酵上清分成兩部分，一部分在60。C溫育30分鐘，另一部分在5°C溫育30分鐘，接著在37。CpH5.5測定二者針對對硝基苯磷酸的活性，用在提高的溫度下溫育的樣品的活性除以在5°C溫育的樣品的活性。如果需要，含酶的樣品可以在任選包含0.005%Tween-20的O.lMNaAcpH5.5中稀釋。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶和參考肌醇六磷酸酶可以在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)宿主菌林中表達(dá)。宿主菌林可以在500ml搖瓶中的100mlPS1培養(yǎng)基(100g/L蔗糖，40g/L大豆薄片(Soyflakes),lOg/LNa2HP04.12H20,O.lml/LDowfax63N10(Dow))中以300rpm在30。C培養(yǎng)四天。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的剩余活性優(yōu)選是SEQIDNO:2的參考肌醇六磷酸酶的剩余活性的至少32%，或至少34%,36%，38%或至少40%。更優(yōu)選地，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的剩余活性是SEQIDNO:2的參考肌醇六磷酸酶的剩余活性的至少50%，或至少60%，70%,80%，90%或至少100%。還更19優(yōu)選地本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的剩余活性是SEQIDN0:2的參考肌醇六磷酸酶的剩余活性的至少120%，140%，160%，180%或至少200%。最優(yōu)選地，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的剩余活性是SEQIDNO:2的參考肌醇六磷酸酶的剩余活性的至少2倍，或至少3倍，4倍或至少5倍。下列取代尤其優(yōu)選(見表5):(i)409E，136P;(ii)411K,331K/55D，167Q，179K/180T/181D/182K/183L/184*/185*/186*，107E;(iii)196Q,276R,285G,299L,200K;(iv)l服，121D，107D，179K/180E/181K/182H/183Q/184*/185*/186*;(v)314N，161P,410D,141C,179K/180E/181K/182Q/183Q/184*/185*/186*，285N;(vi)164E，411R，52C，137P,314G;(vii)IK,l*/2*/3*,121T,4Q6A，82E,109A;(iix)5P,57Y,379R，l*/2*;(ix)410E,1*,119K,52E;(x)4P,362K，202N，276K，385D;(xi)111P/241Q,162C,179K/180E/181K/182K/183V/184*/185*/186*，241Q;(xii)223E,286Q,107G，114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L,379K,273L;(xiii)31C，53V,59C/100C;(xiv)46E，11IP,114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L,76G,362R;(xv)141C/199C,52C/99C。熱穩(wěn)定性還可以如實施例9中所述來測定，即應(yīng)用DSC測量法來測定純化的肌醇六磷酸酶蛋白的變性溫度Td。Td對于蛋白的熱穩(wěn)定性具有指示性Td越高則熱穩(wěn)定性越高。因此，在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶具有比參考肌醇六磷酸酶高的Td，其中針對純化的肌醇六磷酸酶樣品使用差示掃描量熱法從20-90。C以90。C/h的掃描率在20mM乙酸鈉緩20沖液，pH4.0中測定Td(優(yōu)選用純度為至少95%，通過SDS-PAGE測定)，在此測定之前在20mM乙酸鈉pH4.0中透析(優(yōu)選在2-3小時的步驟后接著過夜步驟)，再進(jìn)行0.45um過濾并用透析緩沖液將蛋白濃度稀釋至相當(dāng)于約2個吸光單位(A，)。在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明肌醇六磷酸酶的Td比SEQIDNO:4的肌醇六磷酸酶的Td高，更優(yōu)選是它的至少101%，或至少102%，103%,104%，105%,106%，107%,108°/。，109%或是它的至少110%。還更優(yōu)選地，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的Td是SEQIDNO:4的肌醇六磷酸酶Td的至少120%,130%,140%，150%，160%，170%，180%或至少190%。下列取代尤其優(yōu)選(見表6):362K，362R，111P和/或273L。在更進(jìn)一步的具體實施例中，如使用實施例2中所述的差示掃描量熱法(DSC)(即在20mM乙酸鈉，pH4.0中)測定，本發(fā)明的熱穩(wěn)定的肌醇六石粦酸酶具有至少50。C的解鏈溫度Tm(或變性溫度，Td)。在更進(jìn)一步的具體實施方式中，Tm是至少51，52，53，54,55,56，57,58,59，60，61，62，62.5，63,64,65，66，67，68，69，70，71，72,73，74，75,76,77，78,79,80，81,82,83，84,85，86,87，88,89,90，91，92，93，94,95,96，97,98,99或至少100。C。DSC測量法還可以如實施例1("DSC測量法")中所述來進(jìn)行，或如實施例2("通過DSC測定熱穩(wěn)定性")中所述來進(jìn)行。熱穩(wěn)定性還可以如實施例12中所述來測定。因此，在一優(yōu)選的實施方式中，在70。C和pH4.0條件下溫育60分鐘后，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶與按照同樣方式處理的參考肌醇六磷酸酶相比具有改進(jìn)的剩余活性，對于每種肌醇六磷酸酶而言所述剩余活性是相對于溫育前(在第0分鐘)存在的活性來計算的。剩余活性優(yōu)選針對肌醇六磷酸鈉在pH5.5和3"C時進(jìn)行測量。溫育優(yōu)選在0.1M乙酸鈉，pH4.0中。肌醇六磷酸酶優(yōu)選是純化的，更優(yōu)選地純化至通過SDS-PAGE測定為至少95%的純度。優(yōu)選的肌醇六磷酸酶活性測試緩沖液是0.25M乙酸鈉pH5.5。應(yīng)用本方法，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的剩余活性優(yōu)選是參考肌醇六磷酸酶的剩余活性的至少105%，更優(yōu)選至少110%,115%,120%,130%，140%，150%,160%,170%,180o/o,190%或至少200%。或者，相對于第O分鐘的活性的剩余活性優(yōu)選是至少31%或至少32%。下列提供了改進(jìn)的熱穩(wěn)定性的取代是優(yōu)選的(見表9):273L,46E，362R和/或53V。在一具體實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶變體與參考肌醇六磷酸酶相比對熱更加穩(wěn)定，其中熱穩(wěn)定性通過應(yīng)用上述四種試驗中的任何試驗來測定(基于實例1,5，8，9或12)。在具體實施方式中，預(yù)期SEQIDN0:2的肌醇六磷酸酶的下列變體具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性(在各分組內(nèi)，以優(yōu)選的順序)(i)K141C/V199C，Q91C/W46C,G52C/A99C,N31C/E176C,N31C/T177C，G59C/F100C，S162C/S247C;(ii)D41P，Q91P,N136P,T137P，L154P,S161P，T355P,Q111P,K240P,G282P，T283P,T284P，G289P,N4P，G5P;(iii)G52E，V55I，E57Y,L104A/A105F,K107D,G，Q109A,G，T76G，A84Y，N121T,B62K，M273L,Q，E285GR，N286Q,V294T,I299L,E331K/V55D,F351Y;(iv)El*，El*/E2*，El*/E2*/Q3*;(v)用更短的環(huán)取代C178和C187之間包含的環(huán)，所述更短的環(huán)選自例如，QADKP，GEDKP,NGISA,IAGKS,KEKHQ,KEKQQ,KEKKV，KTDKL;(vi)E119R,K，E411R，K;(vii)K107E,R164E,D;(iix)1362R，K，T276R,K，B79R，K，V409D，E，Q223E,N385D,W46D，E，T410D,E，Q82E。(ix)用選自例如，HQEKMGTMDPT,HQQDIKQVDSL，HQPEIGKMDPV,TQADTSSPDPL,HQQDIKQADPL,TQTDTSSPDPL，NQADLKKTDPL的環(huán)取代殘基114和124之間面對活性位點的環(huán)(YQKDEEKNDPL);(x)R339D。溫度曲線本發(fā)明的肌醇六磷酸酶與參考肌醇六磷酸酶相比是否具有修改的溫度可以如實施例10中所述來確定。因此，在一具體實施方式中本發(fā)明的肌醇六磷酸酶與參考肌醇六磷酸酶相比具有修改的溫度曲線，其中將溫度曲線測定為在20-90。C范圍內(nèi)(以10。C為一級)pH5.5時肌醇六磷酸酶針對肌醇六磷酸鈉的活性相對于溫度的函數(shù)。優(yōu)選的緩沖液是在0.25M乙酸鈉緩沖液，pH5.5中。各溫度的活性優(yōu)選表示為相對于在最佳溫度的值標(biāo)準(zhǔn)化后的相對22活性(以％表示)。最佳溫度是測試的溫度(即以10°C為一次跨越的那些溫度)中活性最高時的溫度。在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在70。C時具有至少18%,或至少19%，20%，21%,22%,23%，24%,或至少25%的相對活性。如上面所解釋，這是相對于在最佳溫度時的活性。更優(yōu)選地，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在70°C時具有至少26%，27%，28%,29%,30%,31%，或至少32%的相對活性。提供修改的溫度曲線的優(yōu)選取代(以在70。C具有更高相對活性的形式)是(見表7》57Y，76G,107G,273L,362K，46E，362R，53V和/或241Q。它們在70。C時的相對活性與SEQIDNO:3和4的參考肌醇六磷酸酶相比更高，并且在一些情況下(57Y,76G，107G，273L,362K,362R和/或53V)與SEQIDNO:2的參考肌醇六磷酸酶相比也是這樣。。H曲線本發(fā)明的肌醇六磷酸酶與參考肌醇六磷酸酶相比是否具有修改的pH曲線可以如在實施例11中所述來測定。因此，在一具體實施方式中本發(fā)明的肌醇六磷酸酶與參考肌醇六磷酸酶相比具有修改的pH曲線，其中將pH曲線確定為在37°C時在pH2.0至7.5范圍內(nèi)(以0.5個pH單位為一級)針對肌醇六磷酸鈉的肌醇六磷酸酶活性作為pH的函數(shù)。優(yōu)選的緩沖液是50mM甘氨酸，50mM乙酸和50mMBis-Tris的混合液(cocktail)。另一個優(yōu)選的緩沖液是0.25M乙酸鈉。在每個pH的活性優(yōu)選表示為相對于在最佳pH的值標(biāo)準(zhǔn)化后的相對活性(以％表示)。修改的pH曲線的實例是pH曲線(相對活性作為pH的函數(shù))向更高或更低的pH偏移。與SEQIDNO:2，3或4的參考肌醇六磷酸酶相比，提供向更高pH偏移0.5pH單位的優(yōu)選取代是(見表8):46E和/或218Q。修改的pH曲線的其他實例是其中最佳pH向上方或向下方改變。與SEQIDNO:2，3或4相比，提供更低的最佳pH的優(yōu)選取代是(見表8):46E，121D和/或200K。與SEQIDNO:2，3或4相比，提供更高的最佳pH的優(yōu)選取代是(見表8):218Q和/或241Q。修改的pH曲線還可以如實施例1("修改的pH曲線pH3.5/5.5活性比的測定")中所述測定，即，通過比較在pH3.5和5.5時的磷酸酶活性?？晒┻x擇地，pH3.5時的活性可以與pH4.0,4.5或5.0時的活性比較。在更進(jìn)一步的可供選擇的實施方式中，比較的是肌醇六磷酸酶活性而非磷酸酶活性。在一具體實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶與參考肌醇六磷酸酶相比具有修改的pH曲線。更具體的，pH曲線在pH3.5-5.5范圍內(nèi)修改。進(jìn)一步更具體的，在pH4.0，4.5,5.0和/或5.5時的活性是在最佳pH(pH3.5)時的活性的至少50%，55%，60%,65%，70%,75%,80%,85%，90°/?；蛑辽?5%的水平。多肽的pH曲線，以及最佳pH可以通過在各種pH值下溫育該多肽來測定，所述溫育應(yīng)用事先確定好濃度的底物并在固定的溫育溫度下進(jìn)行。pH曲線是肌醇六磷酸酶活性相對于pH的圖解，最佳pH從該pH曲線中確定。在一具體實施方式中，應(yīng)用了實施例1的磷酸酶或月幾醇六石壽酸酶測定法，例如底物是5mM肌醇六磷酸鈉，反應(yīng)溫度37。C,并且在各pH值測定活性，例如pH2-12，用合適的緩沖液替換pH5.5乙酸緩沖液。合適的緩沖液的實例是0.1M甘氨酉^/HC1(pH2.0-3.5)，0.1MNaAc/Ac(pH4.0-5.0)，0.1MBis畫Tris/HCl(pH5.5-6.5),0.1MTris/HCl(pH7.0)。緩沖液的其他實例是用HCl或NaOHi周節(jié)至pH^(直2.0，2.5,3.0，3.5,4.0，5.0,6.0,7.0，8.0,9.0,10.0,ll.O和12.0的100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS。在具體實施例中，預(yù)期SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶的以下變體具有修改的pH曲線(在各分組內(nèi)，以優(yōu)選的順序)(i)E218Q，D324N，T200R，K，N121D，E196Q，D202N，E406A，E167Q，E53V,Q，E241Q,D314N，G,E239Q，E285N;(ii)用選自例如HQEKMGTMDPT，HQQDIKQVDSL,HQPEIGKMDPV，TQADTSSPDPL，HQQDIKQADPL，TQTDTSSPDPL，NQADLKKTDPL的環(huán)取代殘基114和124之間面對活性位點的環(huán)(YQKDEEKNDPL)。比活性在一具體實施例中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶相對于參考肌醇六磷酸酶具有改進(jìn)的比活性。更具體的，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的比活性是相對于通過相同步驟測定的參考肌醇六磷酸酶的比活性的至少105%。在更進(jìn)一步的具體實施方式中，相對的比活性是至少110，115,120,125，130,140,145,150，160,170，180,l卯，200，220，240，260，280，300，350或甚至400%，仍相對于通過相同步驟測定的參考肌醇六^l酸酶的比活性。在可供選擇的情況下，術(shù)語高的比活性指的是至少200FYT/mg酶蛋白(EP)的比活性。在具體實施方式中，比活性是至少300，400,500，600,700,800，900，1000，1100，1200，1300，1400,1500，1600，1700,1800，1900,2000，2100,2200，2300，2400,2500,2600，2700，2800,2900或3000FYT/mgEP。比活性是針對高度純化的樣品(SDS聚丙烯酰胺凝膠應(yīng)顯示只有一種成分存在)測量的。酶蛋白的濃度可以通過氨基酸分析來測定，以FYT單位表示的肌醇六磷酸酶活性通過如實施例1中所述測定。比活性是所討論的具體肌醇六磷酸酶變體的一種特征，并且將其作為以如下單位測量的肌醇六磷酸酶活性來計算，即每毫克肌醇六磷酸酶變體酶蛋白的FYT單位數(shù)。進(jìn)一步細(xì)節(jié)參見實施例7。在具體實施方式中，預(yù)期SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶的下列變體具有修改的比活性，其中以優(yōu)選的順序，將殘基114和124之間面對活性位點的環(huán)(YQKDEEKNDPL)用選自下列的環(huán)取代，例如，HQEKMGTMDPT,HQQDIKQVDSL，HQPEIGKMDPV,TQADTSSPDPL,HQQDIKQADPL，TQTDTSSPDPL，NQADLKKTDPL。在動物飼料中的性能在一特定實施方式中本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在動物飼料中與參考肌醇六磷酸酶相比具有改進(jìn)的性能。在動物飼料中的性能可以通過實施例6中的體外模型來測定。因此，在一優(yōu)選實施方式中本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在動物飼料中具有改進(jìn)的性能，其中所述性能在體外模型中測定，通過制備由30%大豆粉(soybeanmeal)和70。/。玉米粉(maizemeal)組成的飼料樣品，向該飼料樣品添加CaCl2至每千克飼料5克鉤的濃度；在40。C和pH3.0條件下預(yù)溫育它們30分鐘，接著添加胃蛋白酶(3000U/g飼料)和肌醇六磷酸酶；在40°C和pH3.0條件下預(yù)溫育樣品60分鐘接著在pH4.0條件下30分鐘；終止反應(yīng)；通過添加HC1至終濃度0.5M并在40。C溫育2小時，接著進(jìn)行一次凍融循環(huán)并在40。C溫育1小時來提取肌醇六磷酸和磷酸肌醇；通過高效離子層析(highperformanceionchromatography)來分離月幾醇六磷酸和磷酸月幾醇；測定殘余的肌醇六磷酸磷(IP6-P)的量；計算經(jīng)肌醇六磷酸酶處理的和未經(jīng)肌醇六磷酸酶處理的空白樣品之間殘余IP6-P的差異(該差異是降解的IP6-P);相對于參考肌醇六磷酸酶(例如具有SEQIDNO:3和4的肌醇六磷酸酶)的降解的IP6-P來表示本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P。當(dāng)然本發(fā)明的肌醇六磷酸酶和參考肌醇六磷酸酶是以相同的量，優(yōu)選基于肌醇六磷酸酶活性單位(FYT)來給藥。優(yōu)選的劑量是125FYT/千克飼料。另一個優(yōu)選的劑量是250FYT/千克飼料。肌醇六^f岸酸酶可以以純化的MJ享六磷酸酶形式，或以發(fā)酵上清的形式給藥。純化的肌醇六磷酸酶優(yōu)選具有至少95%的純度，如由SDS-PAGE測定。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的純化肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P值，相對于參考肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P值，是至少101%，或至少102%,103%,104%，105%,110%,115%,或至少120%。在更進(jìn)一步的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的純化肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P值，相對于參考肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P值，是至少125%,130%,140%，150%，160%,170%，180%，190%，或至少200%。優(yōu)選地，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P值，相對于SEQIDNO:2肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P值，是至少105%,110%,113%,115%,120%，125%,或至少130%。與SEQIDNO:3的肌醇六磷酸酶相比，下列取代提供了改進(jìn)的或至少同樣優(yōu)秀的在體外動物飼料中的性能(見表4A):4P,5P，111P,1*，1*/2*,1*/2*/3*,273L，286Q。與SEQIDNO:3的肌醇六磷酸酶相比，下列取代也提供了改進(jìn)的或至少同樣優(yōu)秀的在體外動物飼料中的性能(見表4A):57Y,76G，107G，362K，362R，121D,196Q，200K,202N，314N,406A和關(guān)于動物飼料性能的更加優(yōu)選的取代是57Y,76G，362K,362R,121D,196Q，200K，202N和406A。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的相對性能還可以作為由參考肌醇六磷酸酶釋放的磷的百分比來計算。在更進(jìn)一步的具體實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的相對性能可以作為由本發(fā)明的肌醇六磷酸酶釋放的磷相對于由參考肌醇六磷酸酶釋放的磷量的百分比來計算。在更進(jìn)一步的具體實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的相對性能是至少105%,優(yōu)選至少110,120，130,140，150,160,170，180，190，或至少200%。降低的蛋白酶敏感性在一具體實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶具有降低的蛋白酶敏感性。更具體的，它對Kex2蛋白酶具有降低的敏感性，意味著發(fā)生通過這種蛋白酶的切割的趨勢降低。變體339D，優(yōu)選R339D，是具有降低的蛋白酶敏感性的本發(fā)明的肌醇糖基化模式糖基化是僅在真核細(xì)胞如真菌和轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)蛋白時觀察到的現(xiàn)象，但未在原核細(xì)胞如細(xì)菌中觀察到。有各種類型的糖基化，但在本文中最相關(guān)的是N-糖基化，即天冬酰胺連接的糖基化，其中從N-乙酰葡糖胺分子附接于天冬酰胺起始，使糖附接于蛋白。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)N-糖基化只發(fā)生于在序列中是下列三肽的一部分的天冬酰胺N-X-T或N-X-S，其中X代表任何氨基酸。令人驚訝地，當(dāng)SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶在真菌(酵母)巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)中表達(dá)時，與在枯草芽孢桿菌中表達(dá)時相比，發(fā)現(xiàn)了更低的熱穩(wěn)定性，見實施例2。該發(fā)現(xiàn)引起了本發(fā)明的提議，即通過改變潛在的糖基化位點，可以改進(jìn)在真菌中表達(dá)的肌醇六磷酸酶的熱穩(wěn)定性。因此本發(fā)明還涉及具有修改的糖基化模式，優(yōu)選修改的N-糖基化位點的肌醇六磷酸酶變體。期望當(dāng)在真菌中表達(dá)時，修改的糖基化會賦予肌醇六磷酸酶變體改進(jìn)的熱穩(wěn)定性。肌醇六磷酸酶的實例是細(xì)菌肌醇六磷酸酶，例如革蘭氏-陰性(Gram-negative)肌醇六磷酸酶，如大腸桿菌(E.coli)和檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)肌醇六磷酸酶及其變體，包括本發(fā)明的月幾醇六磷酸酶以及本文SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:6和SEQIDNO:9的肌醇六磷酸酶。真菌的表達(dá)宿主的實例是畢赤酵母屬(Pichia)，酵母屬(Saccharomyces)和曲霉屬(Aspergillus)菌種。在具體的實施方式中，下列本發(fā)明的肌醇六磷酸酶(例如SEQIDNO:2的變體)期望具有修改的糖基化模式，以優(yōu)選的順序N31T,N74A,N171T，N203T，N281H,N316D,N308A。下列是取代N-X-T型模式N31T,N74A,N281H。下列是取代N畫X-S型模式N171T，N203T，N308A，N316D。低變應(yīng)原性的變體27在一具體實施方式中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶(也)是低變應(yīng)原性的變體，計劃當(dāng)與動物，包括人接觸時，可引起降低的免疫應(yīng)答。術(shù)語免疫應(yīng)答應(yīng)理解成由接觸肌醇六磷酸酶變體的動物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的任何反應(yīng)。一個類型的免疫應(yīng)答是變應(yīng)性應(yīng)答，其導(dǎo)致被接觸的動物體內(nèi)IgE水平的增高。低變應(yīng)原性的變體可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來制備。例如肌醇六磷酸酶變體可以與聚合物基團(tuán)屏蔽部分(polymermoietiesshieldingportions)或免疫應(yīng)答涉及的肌醇六磷酸酶變體的表位結(jié)合。與聚合物的結(jié)合可涉及聚合物對肌醇六磷酸酶變體的體外化學(xué)偶聯(lián)，例如，如在WO96/17929,WO98/30682，WO98/35026和/或WO99/00489中所述。結(jié)合可以額外或可選擇地涉及聚合物與肌醇六磷酸酶變體在體內(nèi)的偶聯(lián)。這種結(jié)合可以通過下述方法實現(xiàn)基因工程處理編碼肌醇六磷酸酶變體的核酸序列，在肌醇六磷酸酶變體中插入編碼其他糖基化位點的共有序列，和在能夠使肌醇六磷酸酶變體糖基化的宿主中表達(dá)肌醇六磷酸酶變體，參見例如WO00/26354。^是供低變應(yīng)原性的變體的另一種途徑是以基因工程處理編碼肌醇六磷酸酶變體的核苷酸序列從而引起肌醇六磷酸酶變體的自寡聚，導(dǎo)致所述肌醇六磷酸酶變體單體可屏蔽其他肌醇六磷酸酶變體單體的表位并且由此降低寡聚體的抗原性。這些產(chǎn)品和它們的制備在例如WO96/16177中描述?？梢酝ㄟ^各種方法如WO00/26230和WO01/83559所述的噬菌體展示法，或EP561907中所述的隨4/L方法來鑒定參與免疫應(yīng)答的表位。一旦鑒定了表位，可通過已知的基因操作技術(shù)如定向誘變(參見例如WO00/26230，WO00/26354和/或WO00/22103)來改變它的氨基酸序列以產(chǎn)生改變的肌醇六磷酸酶變體的免疫性質(zhì)，和/或可在足夠接近表位處進(jìn)行聚合物的結(jié)合，以使聚合物屏蔽所述表位。核酸序列和構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含編碼本發(fā)明肌醇六磷酸酶變體的核酸序列的核酸序列。術(shù)語"分離的核酸序列"是指基本上(essentially)不含其他核酸序列的核酸序列，例如如通過瓊脂糖凝膠電泳測定，至少約20%純的，優(yōu)選至少約40%純的，更優(yōu)選至少約60%純的，甚至更優(yōu)選至少約80%純的，最優(yōu)選至少約90%純的。例如，分離的核酸序列可以通過在基因工程中所用的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法獲得，以使核酸序列從其天然位置重新定位到其將進(jìn)行復(fù)制的不同位置?？寺》椒梢陨婕扒谐头蛛x包含編碼多肽的核酸序列的期望核酸片段，將片段插入載體分子，以及將重組載體并入宿主細(xì)胞，在該宿主細(xì)胞中將復(fù)制該核酸序列的多個拷貝或克隆。核酸序列可以是基因組的，cDNA，RNA,半合成的，合成的來源，或它們的任意組合。本發(fā)明的核酸序列可以通過引入至少一個突變到模板肌醇六磷酸酶編碼序列或其亞序列內(nèi)來制備，其中突變的核酸序列編碼變體肌醇六磷酸酶。向核酸序列中引入突變，以用一個核酸替換另一個核酸，這可以通過本領(lǐng)域4壬何已知的方法完成，例如通過定向i秀變，通過隨4幾-漆變，或通過摻入的(doped),楔入的(spiked)，或局部的隨才幾"i秀變(localizedrandommutagenesis)?；嵝蛄械幕虻闹辽偃齻€部分上進(jìn)行，或在完整基因內(nèi)進(jìn)行。當(dāng)通過使用寡核苷酸來進(jìn)行誘變時，可以在寡核苦酸的合成過程中在將要改變的位置將所述三個非親本(non-parent)核香酸摻入(doped)或楔入(spiked)該寡核苷酸。進(jìn)行摻入或楔入從而避免不想要的氨基酸的密碼子。摻入的或楔入的寡核苷酸可以通過任何技術(shù)并入編碼肌醇六磷酸酶的DNA中，例如，PCR,LCR或認(rèn)為合適的任何DNA聚合酶和連接酶。優(yōu)選地，摻入用"恒定隨機(jī)摻入(constantrandomdoping)"來進(jìn)行，其中在每個位置的野生型和突變的百分比是預(yù)先定義的。此外，可以使摻入致力于優(yōu)選引入特定核苷酸，并因此優(yōu)選引入一種或多種特定的氨基酸殘基。摻入可以做成例如，使其允許在每個位置引入90°/。野生型和10%突變。在摻入設(shè)計的選擇方面的另一個考慮是基于遺傳的以及蛋白結(jié)構(gòu)的限制。隨枳3秀變可以有利地局限于所討^r的親本"幾醇六》粦酸酶的部分。例如，當(dāng)已經(jīng)鑒定了酶的某些區(qū)域?qū)τ谠撁傅奶囟ㄌ匦杂绕渲匾獣r，這種方式可能是有利的。提供本發(fā)明變體的可供選擇的方法包括基因改組(shuffling)，例如如WO95/22625或WO96/00343中所述，以及如EP897985中所述的共有序列衍生方法(consensusderivationprocess)。核酸構(gòu)建體核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的核酸序列，該序列與一個或多個調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。應(yīng)將表達(dá)理解為包括多肽生成中涉及的任何步驟，包括但不限于，轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后修飾，翻譯，翻譯后修飾和分泌。29這里所用的術(shù)語"核酸構(gòu)建體，，是指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或者修飾所述核酸分子以使其以本來不會存在于自然界中(wouldnototherwiseexistinnature)的方式含有核酸的片l殳。當(dāng)核酸構(gòu)建體包含表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語"表達(dá)盒"(expressioncassette)同義。術(shù)語"調(diào)控序列"在本文定義為包括對于編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸表達(dá)是必需的或有利的所有成分。對于編碼多肽的核酸序列而言每個調(diào)控序列可以是天然的或外源的。這樣的調(diào)控序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列，多腺苦酸化序列，前肽序列，啟動子，信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子，和轉(zhuǎn)錄的和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接。術(shù)語"可操作地連接"在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的恰當(dāng)位置，從而使調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達(dá)。當(dāng)用于本文時術(shù)語"編碼序列"(CDS)表示直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界一般由開讀框決定，通常以ATG起始密碼子或其他的起始密碼子如GTG和TTG開始。編碼序列可以是DNA，cDNA或重組核苦酸序列。表達(dá)載體術(shù)語"表達(dá)"包括多肽生成中涉及的任何步驟，但不限于，轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后修飾，翻譯，翻譯后修飾以及分泌。術(shù)語"表達(dá)載體"在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。編碼本發(fā)明的肌醇六磷酸酶變體的核酸序列可以使用表達(dá)載體表達(dá)，所述表達(dá)載體通常包括調(diào)控序列，其編碼啟動子，操縱子，核糖體結(jié)合位點，翻譯起始信號，和任選地阻抑基因或各種活化基因。攜帶編碼本發(fā)明的肌醇六磷酸酶變體的DNA序列的重組表達(dá)載體可以是任何載體，其可以方便地進(jìn)行重組DNA方法，載體的選擇經(jīng)常取決于其將導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。載體可以是這樣一種載體，當(dāng)將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞時，該載體整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組并與整合了它的染色體一起復(fù)制。肌醇六磷酸酶變體還可以與在動物飼料方面感興趣的至少一種其他的酶一起共表達(dá)，所述其他的酶例如肌醇六磷酸酶，磷酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶，a-半乳糖苷酶，蛋白酶，磷脂酶，淀粉酶，和/或P-葡聚糖酶。酶可以從不同載體共表達(dá)，從一個載體共表達(dá)，或應(yīng)用兩種技術(shù)的組合。當(dāng)使用不同載體時，載體可以有不同的選擇標(biāo)記，以及不同的復(fù)制起點。當(dāng)僅使用一個載體時，各基因可以從一個或多個啟動子表達(dá)。如果在一個啟動子的調(diào)控下克隆(二或多順反子的)，基因克隆的順序可能影響蛋白的表達(dá)水平。還可以將肌醇六磷酸酶變體作為融合蛋白來表達(dá)，即已經(jīng)將編碼肌醇六磷酸酶變體的基因符合讀框地(inframe)融合到編碼另一蛋白的基因中。該蛋白可以是其他酶或來自其他酶的功能結(jié)構(gòu)域。宿主細(xì)胞術(shù)語"宿主細(xì)胞"，如本文所用的，包括對于使用包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)導(dǎo)等易感的任何細(xì)胞類型。本發(fā)明還涉及適合用于多肽的重組生產(chǎn)的重組宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的多核苷酸。將包含本發(fā)明的多核苷酸的載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞，從而使該載體作為染色體整合體或作為如早先所述的自復(fù)制染色體外載體保持。術(shù)語"宿主細(xì)胞"包括親本細(xì)胞的任何子代，其由于在復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不完全相同。宿主細(xì)胞的選擇將很大程度上依賴于編碼多肽的基因及其來源。宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如原核細(xì)胞，或非單細(xì)胞微生物，例^口4才亥纟田月包。有用的單細(xì)胞微生物是細(xì)菌細(xì)胞，例如革蘭氏陽性細(xì)菌，包括，但不限于，芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)胞，例如，嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)，角罕淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),短芽孢桿菌(Bacillusbrevis),環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans),克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)，凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillussoagulans)，杣爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)，遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus),地衣芽孑包桿菌(Bacilluslicheniformis),巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium),嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)，枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis);或鏈霉菌屬(Streptomyces)細(xì)胞，例如，淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)和鼠灰鏈霉菌(Streptomyces31murinus);或革蘭氏陰性細(xì)菌，例如大腸桿菌(E.coli)和假單胞菌屬菌種(Pseudomonassp)。在優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在另一優(yōu)選的方面，芽孢桿菌屬細(xì)胞是嗜堿芽孢桿菌(alkalophilicBacillus)。向細(xì)菌宿主細(xì)胞導(dǎo)入載體可以通過如下方法來完成例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen，1979,MolecularGeneralGenetics168:111-115),利用感受肽細(xì)胞(參見，例如，Young和Spizizin，1961，JournalofBacteriology81:823-829,或Dub腿和Davidoff-Abelson，1971,JournalofMolecularBiology56:209-221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)，或4妄合(conjugation)(參見，Koehler和Thorne,1987，JournalofBacteriology169:5771-5278)。宿主細(xì)胞還可以是真核生物，例如哺乳動物，昆蟲，植物或真菌細(xì)胞。在優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。這里用到的"真菌，，包括以下門子嚢菌門(Ascomycota)，4旦子菌門(Basidiomycota),壺菌門(Chytridiomycota)禾口4妻合菌門(Zygomycota)0口由Hawksworth等,在AinsworthandBisby，sDictionaryofTheFungi,她edition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如在Hawksworth等，1995,同上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfUngi)(Hawksworth等，1995，同上)。在更優(yōu)選的方面，真菌的宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。"酵母"如本文所用包括產(chǎn)子嚢酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))，產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)，和屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽孑包纟岡(Blastomyetes))的酵母。由于酵母的分類在將來可能改變，就本發(fā)明而言，酵母應(yīng)該定義為如在酵母生物學(xué)和活性(BiologyandActivitiesofYeast)(Skinner,F.A.，Passmore,S.M.禾口Davenport,R.R.，eds,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在更優(yōu)選的方面中，酵母宿主細(xì)胞是念珠菌屬(Candida),漢遜酵母屬(Hansenula)，克魯維酵母屬(Kluyveromyces),畢赤酵母屬(Pichia),酵母屬(Saccharomyces)，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)細(xì)胞。在最優(yōu)選的方面中，酵母宿主細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)，曱醇畢赤酵母(Pichiamethanolica)，卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis),酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，并唐化酵母(Saccharomycesdiastaticus)，道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)，克魯維酵母(Saccharomyceskluyveri),諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的方面中，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細(xì)胞。在另一最優(yōu)選方面中，酵母宿主細(xì)胞是解脂西;羊著霧(Yarrowialipolytica)纟田月包。在另一優(yōu)選方面中，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。"絲狀真菌"包括真菌(Eumycota)和卵菌(Oomycota)亞門中的全部絲狀形態(tài)(如Hawksworth等,1995,同上所定義)。絲狀真菌的特征通常在于由殼多糖，纖維素，葡聚糖，殼聚糖，甘露聚糖，以及其他復(fù)雜多糖所組成的菌絲體壁。營養(yǎng)生長是通過菌絲延長來實現(xiàn)并且碳分解代謝是專性需氧的。相反地，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長是通過單細(xì)胞菌體的出芽來實現(xiàn)的并且碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在更優(yōu)選的方面中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是枝頂孢霉屬(Acremonium)，曲霉屬，短梗霉屬(Aureobasidium)，煙管菌屬(Bjerkandera)，擬蠟菌屬(Ceriporiopsis)，鬼傘屬(Coprinus)，革蓋菌屬(Coriolus),隱J求菌屬(Cryptococcus)，網(wǎng)孢菌屬(Filobasidium)，鐮孢屬(Fusarium),腐質(zhì)霉屬(Humicola)，瘟病菌屬(Magnaporthe)，毛霉屬(Mucor),毀絲霉屬(Myceliophthora),新考瑪脂霉屬(Neocallimastix),脈孢菌屬(Neurospora)，擬青霉屬(Paecilomyces)，青霉屬(Penicillium)，平革菌屬(Phanerochaete)，射脈菌(Phlebia),瘤胃壺菌屬(Piromyces),側(cè)耳屬(Pleurotus),裂褶菌屬(Schizophyllum),踝節(jié)菌屬(Talaromyces)，嗜熱子嚢菌屬(Thermoascus),梭孢殼屬(Thielavia),彎頸霉屬(Tolypocladium)，栓菌屬(Trametes)或木霉屬(Trichoderma)細(xì)胞。在最優(yōu)選的方面中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉，煙曲霉(Aspergillusfumigatus),臭曲霉(Aspergillusfoetidus),曰本曲霉(Aspergillusjaponicus),斗勾巢曲霉(Aspergillusnidulans)，，繁、曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孑包一夫鐮孑包(Fusarmmbactridioides)，禾谷鐮孑包(Fusariumcerealis),庫威鐮孑包(Fusariumcrookwellense),大刀鐮孑包(Fusariumculmorum),禾本牙牛鐮孑包(Fusariumgraminearum),禾赤嫌孢(Fusariumgraminum)，異孑包嫌孑包(Fusariumheterosporum)，合歡木嫌孑包(Fusariumnegundi)，尖嫌孑包(Fusariumoxysporum)，多枝鐮孑包(Fusariumreticulatum),粉紅嫌孑包(Fusariumroseum)，接骨木嫌孑包(Fusariumsambucinum)，月夫色鐮孑包(Fusariumsarcochroum)，擬分4支孑包鐮孑包(Fusariumsporotrichioides),疏色嫌孑包(Fusariumsulphureum)，圓錄孢(Fusariumtorulosum)，擬絲孑包鐮孑包(Fusariumtrichothecioides)或鑲片鐮孑包(Fusariumvenenatum)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)，干4以堵菌(Ceriporiopsisaneirina)，干4以錯菌,Ceriporiopsiscaregiea,Ceriporiopsisgilvescens，Ceriporiopsispannocinta，Ceriporiopsisrivulosa,Ceriporiopsissubrufa或蟲4以蠟菌(Ceriporiopsissubvermispora)，灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)，毛革蓋菌(Coriolushirsutus)，特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)，疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginose)，米黑毛霉(Mucormiehei)，嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)，粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)，產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)，黃孑包原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)，輻射射月7jc菌(Phlebiaradiata),刺芽側(cè)耳(Pleurotuseryngii)，土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)，長絨毛栓菌(Trametesvillosa),雜色栓菌(Trametesversicolor)，哈茨木霉(Trichodermaharzianum)，康寧木霉(Trichodermakoningii),長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)，里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)菌林的纟田胞。真菌細(xì)胞可以通過涉及原生質(zhì)體形成，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞壁再生的方法以本身已知的方式來轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023和Yelton等,1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中有描述。轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述?？梢岳肂ecker和Guarente，在Abelson，J.N.禾口Simon,M.I.纟扁壽專的GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology，巻194,182-187頁，AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163;和Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920.中所述的方法將酵母轉(zhuǎn)化。制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還涉及用于制備本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的方法，其包括(a)在有益培養(yǎng)宿主細(xì)胞；以及(b)回收肌醇六磷酸酶。在本發(fā)明的制備方法中，應(yīng)用本領(lǐng)域所熟知的方法在適合多肽產(chǎn)生的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以通過搖瓶培養(yǎng)，以及在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)的，分批，補(bǔ)料分批(fed-batch)，或固態(tài)發(fā)酵)，在合適的培養(yǎng)基中并在允許所述多肽表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行。利用本領(lǐng)域已知的方法，在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基可從供應(yīng)商處獲得，或可以按照公開的成分制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，則可以從培養(yǎng)基直接回收多肽。如果多肽沒有分泌，則可以從細(xì)胞裂解物中回收。得到的多肽可以用本領(lǐng)域已知方法回收。例如，可以通過常規(guī)的方法包括，但不限于，離心，過濾，提取，噴霧干燥，蒸發(fā)或沉淀，從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收多肽。本發(fā)明的多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法來純化，包括但不限于，層析(例如，離子交換，親和，疏水，層析聚焦，和大小排阻)，電泳方法(例如，制備型等電聚焦)，差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)，SDS-PAGE或提取(參見，例i口，ProteinPurification,J,-C,Janson和LarsRyden,編4辱，VCHPublishers,NewYork,1989)。轉(zhuǎn)基因植物本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物，植物部分或植物細(xì)胞，其已經(jīng)使用編碼具有本發(fā)明的肌醇六磷酸酶活性的多肽的核香酸序列轉(zhuǎn)化，從而以可回收的量表達(dá)和產(chǎn)生所述多肽。多肽可以從植物或植物部分中回收。可供選擇地，包含重組多肽的植物或植物部分可以如這樣應(yīng)用，用以改進(jìn)食物或飼料的質(zhì)量，例如，改進(jìn)營養(yǎng)價值，適口性和流變性質(zhì)，或破壞抗?fàn)I養(yǎng)(antinutritive)因子。在具體實施方式中，多肽靶向種子中的胚乳儲藏泡(endospermstoragevacuole)。這可以通過將其合成為具有合適信號肽的前體來實現(xiàn)，參見Horvath等，在PNAS，2000年2月15日，97巻，4號，1914-1919頁中。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)或它們基因工程化的變體。單子葉植物的實例為草，例如草地早熟禾(meadowgrass)(藍(lán)草(bluegrass),禾本一牛(Poa))，斗文草(foragegrass)侈'Ji口羊茅屬(Festuca),黑麥草屬(Lolium)，溫帶草例如剪股穎屬(Agrostis)，以及谷類，35例如，小麥，燕麥，黑麥，大麥，稻，高粱，黑小麥(triticale)(小麥(小麥屬(Triticum))和黑麥(黑麥屬(Secale))的穩(wěn)定雜合體)，以及玉米(maize)(玉米(corn))。雙子葉植物的實例為煙草，豆類，例如向日葵(向日葵屬(Helianthus)),棉花(棉屬(Gossypium》，羽扇豆，馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet)，豌豆，菜豆(bean)以及大豆，和十字花科植物(十字花科(familyBrassicaceae))，例如花椰菜，油菜籽(rapeseed)，以及緊密關(guān)聯(lián)的模式生物擬南芥(Arabidopsisthaliana)。低肌醇六磷酸鹽植物如例如美國專利no.5,689,054和美國專利no.6,111,168所述的為基因工程化^f直物的實例。植物部分的實例為莖，愈傷組織，葉，根，果實，種子和塊莖，以及包含這些部分的獨立組織，例如表皮，葉肉，薄壁組織，維管組織，分生組織。特定的植物細(xì)胞區(qū)室，例如葉綠體，質(zhì)外體(apoplast)，線粒體，液泡，過氧化物酶體，以及細(xì)胞質(zhì)也被認(rèn)為是植物部分。此外，任何植物細(xì)胞，不管組織來源如何，均認(rèn)為是植物部分。同樣，植物部分，例如為促進(jìn)本發(fā)明的應(yīng)用而分離的特定組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如胚，胚乳，糊粉和種皮(seedcoats》在本發(fā)明范圍內(nèi)還包含這些植物，植物部分和植物細(xì)胞的子代。可以按照本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建表達(dá)本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。簡要地，如下構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，通過將一個或多個編碼本發(fā)明多肽的表達(dá)構(gòu)建體摻入植物宿主基因組，并使得到的經(jīng)修飾的植物或植物細(xì)胞增殖成為轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。方便地，表達(dá)構(gòu)建體是核酸構(gòu)建體，其包含編碼本發(fā)明的多肽的核酸序調(diào)控序列可操作地連接。此外，表達(dá)構(gòu)建體可以包含選擇標(biāo)記用于鑒定整合了表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞以及對于將構(gòu)建體導(dǎo)入所述植物所必需的DNA序列(后者依賴于所應(yīng)用的DNA導(dǎo)入方法)。調(diào)控序列，例如啟動子和終止子序列和任選地信號或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選擇，基于例如期望何時，何處以及如何表達(dá)多肽來決定。例如,編碼本發(fā)明的多肽的基因的表達(dá)可以是組成型或誘導(dǎo)型，或可以是發(fā)育，階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以靶向特定細(xì)胞區(qū)室，組織或植物部分如種子或葉。調(diào)控序列是，例如，由Tague等，1988，PlantPhysiology86:506所描述的。對于組成型表達(dá)，可以使用下列啟動子35S-CaMV啟動子(Franck等,361980,Cell21:285-294)，玉米泛素1(ChristensenAH,SharrockRA和Quail1992.Maizepolyubiquitingenes:structure,thermalperturbationofexpressionandtranscriptsplicing,andpromoteractivityfollowingtransfertoprotoplastsbyelectroporation),或稻肌動蛋白1啟動子(PlantMo.Biol.18,675-689.;ZhangW，McElroyD.和WuR1991,AnalysisofriceActl5，regionactivityintransgenicriceplants.PlantCell3,1155-1165)。器官特異性的啟動子可以是，例如，貯存庫組織(storagesinktissue)例如種子，馬鈴薯塊莖和果實的啟動子(Edwards&Coruzzi，1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303),或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動子(Ito等，1994,PlantMol.Biol.24:863-878)，種子特異性的啟動子例如來自稻的谷蛋白，醇溶谷蛋白，球蛋白或白蛋白的啟動子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885-889),來自豆球蛋白B4和來自蠶豆(Viciafaba)的未知種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiology152:708-711),來自種子油體蛋白(seedoilbodyprotein)的啟動子(Chen等，1998,PlantandCellPhysiology39:935-941),來自歐洲油菜(Brassicanapus)的貯存蛋白napA啟動子，或本領(lǐng)域已知的其他任何種子特異性的啟動子，例如，如WO91/14772中所述。此外，啟動子可以是葉特異啟動子例如來自稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993,PlantPhysiology102:991-1000),小球藻病毒腺嘌呤曱基轉(zhuǎn)移酶基因啟動子(Mitra和Higgins,1994,PlantMolecularBiology26:85-93),或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995，MolecularandGeneralGenetics248:668-674)，或損傷誘導(dǎo)型啟動子例如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993,PlantMolecularBiology22:573-588)。同樣，啟動子可以通過非生物(abiotic)處理例如溫度，干旱或鹽度變化來誘導(dǎo)，或可以通過外源施用的激活啟動子的物質(zhì)來誘導(dǎo)，所述物質(zhì)例如乙醇，雌激素，植物激素如乙烯，脫落酸，赤霉酸和/或重金屬。啟動子增強(qiáng)元件還可以用于在植物中獲得多肽更高的表達(dá)。例如，啟動子增強(qiáng)元件可以是內(nèi)含子，其置于啟動子和編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列之間。例如，上述Xu等，1993，公開了利用稻肌動蛋白l基因的第一內(nèi)含子來增強(qiáng)表達(dá)。更進(jìn)一步，可以相對于研究的植物種類優(yōu)化密碼子選擇以改進(jìn)表達(dá)(參見上面提到的Horvath等)。選擇標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其他部分可以從本領(lǐng)域那些可獲得的選取。按照本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)將核酸構(gòu)建體并入進(jìn)植物基因組，這些技術(shù)包括農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，顯微注射，粒子轟擊，生物彈射轉(zhuǎn)化以及電穿孔(Gasser等，1990，Science244:1293;Potrykus,1990,Bio/Technology8:535;Shimamoto等，1989,Nature338:274)。目前，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是用于制備轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(參見綜述Hooykas和Schilperoort，1992,PlantMolecularBiology19:15-38),并且它還可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，盡管對于這些植物更通常使用其他轉(zhuǎn)化方法。目前，制備轉(zhuǎn)基因單子葉植物的優(yōu)選方法，除了農(nóng)桿菌方法外，是胚俞傷組織或發(fā)育中的胚的粒子轟擊(用轉(zhuǎn)化DNA涂覆的精細(xì)金(microscopicgold)或鴒顆粒)(Christou,1992,PlantJournal2:275-281;Shimamoto,1994,CurrentOpinionBiotechnology5:158-162;Vasil等，1992,Bio/Technology10:667-674)。可供選擇的單子葉植物轉(zhuǎn)化方法基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如Omimlleh等，1993,PlantMolecularBiology21:415-428所述。轉(zhuǎn)化之后，按照本領(lǐng)域所熟知的方法選"f奪并入了表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并代中可以選擇性地去除選擇基因，其通過利用例如使用兩個分離的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或者通過特定重組酶對選擇基因進(jìn)行位點特異性切除。本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明的多肽的方法，其包括在有益于所述多肽生成的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含編碼具有本發(fā)明肌醇六磷酸酶活性的多肽的核酸序列。轉(zhuǎn)基因動物本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因的非人動物以及它們的產(chǎn)品或成分，其實例為體液例如乳和血，器官，肉和動物細(xì)胞。用于表達(dá)蛋白的技術(shù)，例如在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)蛋白的技術(shù)，是本領(lǐng)域已知的，參見例如手冊ProteinExpression:APracticalApproach(蛋白表達(dá)實用方法)，Higgins和Hames(編輯)，OxfordUniversityPress(牛津大學(xué)出版社)(1999)，以及該系列涉及基因轉(zhuǎn)錄，RNA加工和翻譯后加工的三個手冊。通常來說，為了制備轉(zhuǎn)基因動物，用編碼具有本發(fā)明的肌醇六磷酸酶活性的多肽的核酸序列轉(zhuǎn)化所選動物的所選細(xì)胞，從而表達(dá)并制備多肽?？梢詮膭游矬w中回收多肽，例如從雌性動物的乳中，或可以將多肽表達(dá)為有益于動物本身，例如輔助動物消化。動物的實例在下面標(biāo)題為動物銅料的部分中提到。為了制備以從動物乳中回收多肽為目的的轉(zhuǎn)基因動物，可以將編碼多肽的基因插入到所討論的動物的受精卵中，例如通過使用包含合適的乳蛋白啟動子和編碼所述多肽的基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體。將轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體顯微注射進(jìn)受精卵，優(yōu)選永久整合入染色體。一旦卵開始生長和分裂，就將潛在的胚胎植入代用的母體(surrogatemother),并且鑒定出攜帶該轉(zhuǎn)基因的動物。獲得的動物隨即可以通過常規(guī)飼養(yǎng)來繁殖。多肽可以從動物乳中純化，參見例^口Meade,H.M.等(1999):Expressionofrecombinantproteinsinthemilkoftransgenicanimals,Geneexpressionsystems:Usingnaturefortheartofexpression.(在轉(zhuǎn)基因動物乳中表達(dá)重組蛋白，基因表達(dá)系統(tǒng)將自然性質(zhì)用于表達(dá)技術(shù)).J,MFernandez和J,P,Hoeffler(編輯)，AcademicPress。在另一方面，為了制備在其體細(xì)胞和/或干細(xì)胞的基因組中攜帶有包含異源轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的核酸序列的非人轉(zhuǎn)基因動物，其中所述異源轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體包含編碼多肽的轉(zhuǎn)基因，可以將該轉(zhuǎn)基因與用于多肽的唾液腺特異性表達(dá)的第一調(diào)控序列可操作地連接，如WO00/064247所公開。組合物和用途在更進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物，以及應(yīng)用這些組合物的方法。多肽組合物可以按照本領(lǐng)域已知的方法來制備，并且可以以液體或干組合物的形式。例如，多肽組合物可以以顆粒或微顆粒形式存在。將要包括在組合物中的多肽可以按照本領(lǐng)域已知的方法來穩(wěn)定化。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶可以在任何工業(yè)環(huán)境中用于降解，例如，肌醇六磷酸鹽，fl醇六磷酸和/或單，二，三，四和/或五磷酸"幾醇。熟知這些化合物的磷酸部分螯合二價和三價的陽離子例如金屬離子，包括但不限于(i.a.)營養(yǎng)必需離子鈣，鐵，鋅和鎂，以及痕量金屬錳，銅和鉬。此外，肌醇六磷酸還在某種程度上通過靜電相互作用結(jié)合蛋白。因此，本發(fā)明的多肽的優(yōu)選用途是在動物飼料制備物中(包括人類食物)或用于這些制備物的添加劑。在一具體實施方式中，本發(fā)明的多肽可以用于改進(jìn)動物飼料的營養(yǎng)價值。改進(jìn)動物飼料(包括人類食物)的營養(yǎng)價值的非限定性實例是改進(jìn)飼料消化性；促進(jìn)動物生長；改進(jìn)飼料應(yīng)用；改進(jìn)蛋白的生物利用度；提高可消化磷酸鹽的水平；改進(jìn)肌醇六磷酸鹽的釋放和/或降解；改進(jìn)痕量礦物質(zhì)的生物利用度；改進(jìn)大礦物質(zhì)的生物利用度；消除添加補(bǔ)充性的磷酸鹽，痕量礦物質(zhì)和/或大礦物質(zhì)的需要；和/或改進(jìn)卵殼質(zhì)量。飼料的營養(yǎng)價值因此增加，并且可以改進(jìn)動物的生長速率和/或重量增加(weightgain)和/或飼^F轉(zhuǎn)化率(即攝入的飼料重量相對于重量增加)。進(jìn)而，本發(fā)明的多肽可以用于降低糞便中的肌醇六磷酸鹽水平。動物，動物飼料以及動物祠料添加劑術(shù)語動物包括所有動物，包括人類。動物的實例是非反芻動物，和反芻動物。反芻動物包括，例如綿羊，山羊和牛(cattle)，例如奶牛(cow)如肉牛(beefcattle)和奶牛(dairycow)。在一具體實施方式中，動物是非反芻的動物。非反芻動物包括單胃的動物，例如豬(pig)或豬(swine)(包括但不限于，小豬(piglet),生長中的豬(growingpig)和母豬(sow));家禽例如火雞，鴨和雞(包括但不限于雛雞(broilerchick),蛋雞(layers));魚(包括但不限于鮭魚(salmon),鱒魚(trout),羅非魚(tilapia)，鯰魚(catfish)和鯉魚(carp));和曱殼類(包括但不限于河壞(shrimp)和7于蟲下(prawn))。術(shù)語飼料或飼料組合物是指適合于動物攝入或意在由動物攝入的任何化合物，制備物，混合物或組合物。在按照本發(fā)明的用途中，可以在餐前，餐后或與進(jìn)餐同時向動物喂食多肽。后者是優(yōu)選的。在一具體實施方式中，多肽，以其添加到飼料中的形式，或當(dāng)其包括在飼料添加劑中時，是基本上(substantially)純的。在一具體實施方式中它是確定的(well-defined)。術(shù)語"確定的"意味著肌醇六磷酸酶制備物是至少50%純的，如由大小排阻層析所測定(參見WO01/58275的實施例12)。在其他具體的實施方式中，如通過這種方法測定，肌醇六磷酸酶制備物是至少60，70,80,85，88,90,92，94或至少95%純的。基本上純的，和/或確定的多肽制備物是有利的。例如，以正確劑量給藥基本上沒有其他多肽干擾或污染的多肽容易得多。術(shù)語以正確劑量給藥具體是指獲得恒定(consistent)和不變的(constant)結(jié)果的目的，以及基于期望的效果優(yōu)化劑量的能力。然而，對于在動物飼料中的應(yīng)用，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶多肽不需要那么純；例如它可以包含其他多肽，在此情況下可以稱其為MJI六磷酸酶制備物。肌醇六磷酸酶制備物可以(a)直接添加到飼料(或直接用于蛋白的處理方法)，或(b)可以用于一個或多個中間組分的生產(chǎn)，所述中間組分如隨后添加的禾i度是^原始多肽制備物的純度:無論按照:上面f的(a)或(b)應(yīng)用。、'具有這種數(shù)量級的純度的多肽制備物尤其可以應(yīng)用重組生產(chǎn)方法來獲得，反之通過傳統(tǒng)發(fā)酵方法獲得它們并不是很容易并且還具有高得多的批間差(batch-to-batchvariation)。這樣的多肽制備物當(dāng)然可以與其他多肽混合。多肽可以以任-f可形式添加到飼津+中，作為相對純的多肽(beitasarelativelypurepolypeptide),或與意名夂添加到動物祠料中的其他組分混合，即以動物飼料添加劑的形式，例如所謂的動物飼料的預(yù)混合料(pre-mixes)。在進(jìn)一步的方面中本發(fā)明涉及在動物祠3+方面使用的組合物，例如動物飼料，和動物飼料添加劑，例如預(yù)混合料。除本發(fā)明的多肽之外，本發(fā)明的動物添加劑含有至少一種脂溶性維生素，和/或至少一種水溶性維生素，和/或至少一種痕量礦物質(zhì)。動物添加劑還可以包含至少一種大礦物質(zhì)(macromineral)。另外，可選的，銅料添加劑成分是著色劑，例如類胡蘿卜素如P-胡蘿卜素，蝦青素和葉黃素；芳香化合物；穩(wěn)定劑；抗微生物肽；多不飽和脂肪酸；;舌'I"生氧生成4勿(reactiveoxygengeneratingspecies);禾口/或選自下歹'J之中的至少一種其他多肽肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8或3丄3.26);磷酸酶(EC3.1.3.1;EC3丄3.2;EC3丄3.39);木聚糖酶(EC3.2丄8);半乳聚糖酶(EC3.2.1.89);a-半乳糖芬酶(EC3.2.1.22);蛋白酶(EC3.4,,);磷脂酶Al(EC3丄1.32);磷脂酶A2(EC3丄1.4);溶血磷脂酶(EC3丄1.5);磷脂酶C(3丄4.3);磷脂酶D(EC3丄4.4);淀粉酶例如a-淀粉酶(EC3.2.1.1);和/或P-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)。在一具體實施方式中這些其他的多肽是確定的(如上面對肌醇六磷酸酶制備物所定義的)。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶還可以與其它肌醇六磷酸酶組合，例如子嚢菌類(ascomycete)肌醇六磷酸酶如曲霉屬肌醇六磷酸酶，例如源自無花果曲霉(Aspergillusficuum)，黑曲霉或泡盛曲霉；或擔(dān)子菌類(basidiomycete)肌醇六磷酸酶，例如源自Peniophoralycii,平田頭恭(Agrocybepediades),絨毛栓菌(Trametespubescens)或巻邊樁菇(Paxillusinvolutus);或具有肌醇六石舞酸酶活性的它們的衍生物，片段或變體。因而，在本發(fā)明的在動物飼料中的用途的優(yōu)選實施方式中，以及在本發(fā)明的動物飼料添加劑和動物飼料的優(yōu)選實施方式中，將本發(fā)明的肌醇六磷酸酶與這些肌醇六磷酸酶組合。抗微生物肽(AMP，s)的實例是CAP18，LeucocinA，Tritrpticin,Protegrin-l,Thanatin，防衛(wèi)素(Defensin)，吝丄4夾蛋白(Lactoferrin)，Lactoferricin和Ovispirin如Novispirin(RobertLehrer,2000)，Plectasins和他汀類藥物(Statins)，包才舌在WO03/044049和WO03/048148中所公開的化合物和多肽，以及保持抗微生物活性的上述各項的變體或片段?？拐婢嚯?AFP，s)的實例是巨大曲霉(Aspergillusgiganteus)和黑曲霉肽，以及保持抗真菌活性的它們的變體和片段，如在WO94/01459和WO02/090384中所公開的。多不飽和脂肪酸的實例是C18,C20和C22多不飽和脂肪酸，如花生四烯酸,二十二碳六烯酸(docosohexaenoicacid),十二碳五烯酸和y-亞油酸?；钚匝跎晌锏膶嵗腔瘜W(xué)試劑例如過硼酸鹽，過碌^酸鹽或過^^酸鉀；以及多肽例如氧化酶，加氧酶或合成酶。通常脂溶性和水溶性維生素，以及痕量礦物質(zhì)形成意;&夂向飼料添加的所謂的預(yù)混合料的部分，而大礦物質(zhì)則通常單獨添加到飼料中。這些組合物類型中的任一種當(dāng)加入有本發(fā)明的多肽時便成為本發(fā)明的動物飼料添加劑。在一具體實施方式中，意名夂將本發(fā)明的動物飼料添加劑以0.01至10.0%的水平包含于(或規(guī)定必須包含于)動物飲食或伺料中；更具體地以0.05至5.0%的水平；或0.2至1.0%的水平(％代表每100克飼料中添加劑的克數(shù))。在預(yù)混合料中尤其是這樣。下列是這些組分的非排他性實例列表脂溶性維生素的實例是維生素A，維生素D3，維生素E和維生素K，例如維生素K3。水溶性維生素的實例是維生素B12,生物素和膽堿，維生素Bl，維生素B2,維生素B6,煙酸，葉酸和泛酸鹽(panthothenate),例如D-泛酸4丐42(Ca-D-panthothenate)。痕量礦物質(zhì)的實例是錳，鋅，鐵，銅，碘，硒和鈷。大礦物質(zhì)的實例是鈣，磷和鈉。對這些組分的營養(yǎng)要求(用家禽和小豬/豬為例)在WO01/58275的表A中列出。營養(yǎng)要求意味著這些組分在飲食中應(yīng)該以規(guī)定的濃度提供。在另一方面，本發(fā)明的動物飼料添加劑包含至少一種在WO01/58275的表A中指定的個體組分。至少一個意味著，一個或多個，一個，或兩個，或三個，或四個和以此類推多至全部的十三個，或多至全部的十五個個體組分的任意一種。更具體地，這至少一種的個體組分以這樣的量包括在本發(fā)明的添加劑中，該量提供在表A的第四列，或第五列，或第六列中說明的范圍內(nèi)的飼料中濃度(in畫feed-concentration)。本發(fā)明還涉及動物飼料的組合物。動物飼料組合物或々大食具有相對高的蛋白含量。家禽和豬的飲食的特征可以如WO01/58275表B第2-3列中所述。魚的飲食的特征可以如該表B的第4列中所述。此外這樣的魚類飲食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。WO01/58275對應(yīng)于US09〃79334,將其通過引用并入。本發(fā)明的動物飼料組合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量，并且此外還包含至少一種本文要求保護(hù)的多肽。此外，或在可供選擇的情況下(對于上述的粗蛋白含量)，本發(fā)明的動物飼料組合物具有含量為10-30MJ/kg的可代謝能量；和/或0.1-200g/kg的4丐含量；和/或0.1-200g/kg的可用磷(availablephosphorus)含量；和/或0.1-100g/kg的曱硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的曱硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的賴氨酸含量。在具體實施方式中，可代謝能量，粗蛋白，釣，磷，曱硫氨酸，曱硫氨酸加半胱氨酸，和/或賴氨酸的含量是在WO01/58275的表B中的范圍2,3，4或5(R.2-5)中的任一之內(nèi)。粗蛋白是以氮(N)乘以因子6.25來計算的，即粗蛋白(g/kg"N(g/kg)x6.25。氮含量由凱氏定氮法測定(A.O.A.C.，1984,OfficialMethodsofAnalysis14thed.,AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)。可代謝能量的計算可以基于NRC出版物豬的營養(yǎng)需求，第九次修訂版1988，豬營養(yǎng)學(xué)小組委員會，動物營養(yǎng)學(xué)委員會，農(nóng)業(yè)部，國家科學(xué)委員會。國家學(xué)術(shù)出版社，華盛頓特區(qū)，第2-6頁(Nutrientrequirementsinswine,ninthrevisededition1988，subcommitteeonswinenutrition,committeeonanimalnutrition,boardofagriculture,nationalresearchcouncil.NationalAcademyPress:Washington,D.C.,pp.2_6),以及歐洲家禽飼料能量值表，Spelderholt家禽研究與拓展中心，7361DABeekbergen,荷蘭。GrafischbedrijfPonsen&looijenbv,Wageningen.ISBN90-71463-12-5(EuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs,Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension,7361DABeekbergen,TheNetherlands.GrafischbedrijfPonsen&looijenbv,Wageningen.ISBN90-71463-12-5)。在完整動物飲食中的鈣，可用磷和氨基酸的飲食含量的計算是基于飼料表，例^口Veevoedertabel1997，gegevensoverchemischesamenstelling,verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen,CentralVeevoederbureau,Runderweg6,8219pkLelystad.ISBN90-72839-13-7。在一具體實施方式中，本發(fā)明的動物飼料組合物包含至少一種蛋白。所述蛋白可以是動物蛋白，例如肉和骨粉，和/或魚粉；或其可以是植物蛋白。本文所用的術(shù)語植物蛋白是指任何化合物，組合物，制備物或混合物，其包括至少一種從植物衍生或起源的蛋白，包括經(jīng)修飾的蛋白和蛋白衍生物。在具體實施方式中，植物蛋白的蛋白含量是至少10，20，30,40,50或60%(w/w)植物蛋白可以源自植物蛋白源，例如豆類和谷類，例如來自豆科(Fabaceae)(豆科(Leguminosae))，十字花科(Cruciferaceae)，藜科(Chenopodiaceae)和禾本科(Poaceae)的植物的材料，例如大豆粉，羽扇豆粉(lupinmeal)和油菜籽粉(rapeseedmeal)。在一具體實施方式中，植物蛋白源是來自豆科的一種或幾種植物的材料，例如大豆，羽扇豆，豌豆或菜豆。在另一具體實施方式中，植物蛋白源是來自藜科的一種或幾種植物的材料，例如甜菜，糖甜菜，菠菜或昆諾阿藜(quinoa)。植物蛋白源的其他實例是油菜籽，向日葵子(sunflowerseed)，棉籽(cottonseed)和甘藍(lán)(cabbage)。大豆是優(yōu)選的植物蛋白源。植物蛋白源的其他實例是谷類例如大麥，小麥，黑麥，燕麥，玉米(玉米)，稻，黑小麥和高粱。在更進(jìn)一步的具體實施方式中，本發(fā)明的動物飼料組合物包含0-80%玉米；和/或0-80%高粱；和/或0-70%小麥；和/或0-70%大麥；和/或0-30%燕麥；和/或0-40%大豆粉；和/或0-25%魚粉；和/或0-25%肉粉或骨粉；和/或0-20%乳清。可以將動物飲食例如生產(chǎn)為糊狀飼料(mashfeed)(非顆粒的(nonpelleted))或顆粒飼料(pelletedfeed)。通常地，將磨碎的飼料混合并根據(jù)對所討論的物種的規(guī)范(specification)添加足量的必需維生素和礦物質(zhì)。多肽可以作為固體或液體多肽制劑的形式添加。例如，固體多肽制劑通常在混合步驟之前或期間添加；液體多肽制劑通常在造粒步驟之后添加。多肽也可以#^在飼料添加劑或預(yù)混合料中。飲食中多肽的終濃度在每千克飲食0.01-200mg多肽蛋白范圍內(nèi)，例如每千克動物飲食5-30mg多肽蛋白的范圍。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶應(yīng)當(dāng)以有效的量應(yīng)用，即以足夠改進(jìn)溶解和/或改進(jìn)飼料營養(yǎng)價值的量。目前考慮多肽以一個或多個下列量(劑量范圍)來施用0.01-200;0.01-100;0.5-100;1-50;5-100;10-100;0.05-50或0.10-10——所有的這些范圍均為每千克飼料中的肌醇六磷酸酶多肽蛋白的毫克數(shù)(ppm)。對于測定每千克飼料的肌醇六磷酸酶多肽蛋白的毫克數(shù)，將肌醇六磷酸酶從飼料組合物中純化出來，純化的肌醇六磷酸酶的比活性應(yīng)用相關(guān)測定法來測定。象這樣的伺料組合物的肌醇六磷酸酶活性也應(yīng)用相同的測定法來確定，并基于這兩種測定，來計算每千克飼料中肌醇六磷酸酶蛋白的毫克劑量。相同的機(jī)理適用于測定飼料添加劑中的肌醇六磷酸酶多肽蛋白的毫克數(shù)。當(dāng)然，如果可以獲得用于制備伺料添加劑或飼料的肌醇六磷酸酶的樣品，則從該樣品中測定比活性(無需從飼料組合物或添加劑中純化肌醇六磷酸酶)。具體實施例方式本發(fā)明還涉及下列具體實施例方式I.肌醇六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少74%同一性，并且其與SEQIDNO:2相比包含在選自以下的至少一個位置上的至少一個變化1,2,3，4，5,31,41，46，52,53，55，57，59,74，76，82，84，91，99,100,104，105,107,109，111，114,115，116,117，118，119,120，,121，122,123,124，136，137，141,154，161,162，164,167，171,176，177，179，180,181，182，183，184，185，186，196，199，200，202,203，218,223，239，240，241，247,273，276，281,282，283，284,285，286,289,294,299，308,314，316,324，331，339,351,355，362,379,385，406,409，410和411;優(yōu)選在選自以下的至少一個位置1，2,3，4,5，31，46，52,53,55，57，59,76，82，99,100,107,109,111，114,115，116，117,118，119,120，121，122，123，124,137，141，161，162，164,167，179，180，181，182，183，184，185，186，196，199，200,202，218,223,241,273,276，285,286，299,314,331，339,362，379，385，406,410和411;條件是該肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO:3，不是SEQIDNO:4，并且不是SEQIDNO:6。II.肌醇六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少74%同一性，并且其與SEQIDNO:2相比包含在選自以下的至少一個位置上的至少一個變化1，2,3,4,5，41，46,52，53，55，57,59，74,76，82,84，91,99，100，104，105，107，109，111,114,115，116，117,118,119，120,122，123,124，136,137,141,154,161，162，164,167,171,176，177，179,180，181，182，183,184，185，186，196，199,200，202，203，218，223，239，240,241，247，273，276，281，282，283，284，285，286，289，294,299，308,314，324，339,351，355，362，379,385，406，409，410和411;優(yōu)選在選自以下的至少一個位置1,2，3，4，5,46，52,53，55,57,59，76,82,99，100,107，109，111，114，115，116，117，118,119,120,122，123，124，137,141，161，162，164,167,179,180,181，182，183，184，185，186,196,199，200，202，218，223，241,273，276，285，286，299,314，339，362，379，385,406,410和411。III.MJ享六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少74%同一性，并且其與SEQIDNO:2相比包含在選自以下的至少一個位置上的至少一個變化1,2，3，4，5，31，41，46,52,53,55,57，59,74,76，82,84，91,99，100，104,105,107,109，111，114，115，116，117,118，119，120，121，122，123，124，136,137,141,154，161，162，164，167，171，176，177,179，180,181,182,183，184，185，186,196，199,200,202,203，218，223，239,240，241,247，273，276，281，282，283,284,285，286,289，294，299,308，314，316,324,331,339,351,355,362,379，385,406，409，410和411;優(yōu)選在選自以下的至少一個位置優(yōu)選在選自以下的至少一個位置1,2，3，4，5，31，46,52,53，55,57,59,76，82，99，100,107，109，111，114,115,116,117，118，119，120，121，122,123，124，137，141，161，162,164,167，179,180，181,182，183，184，185,186,196，199，200，202，218,223,241,273，276,285，286，299,314,331，339，362,379,385,406,410和411;條件是該肌醇六磷酸酶不是SEQIDN0:3，不是SEQIDNO:4，不是SEQIDNO:6，并且不是SEQIDNO:9以及圖1中所列的它的變體。IV.肌醇六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少74%同一性，并且其與SEQIDNO:2相比包含在選自以下的至少一個位置上的至少一個變化1，2，3，4,5，41,46，52,53，55，57,59，74,76，82,84，91，99，100,104，105，107,109，111，114，115，116，117,118，119,120，122,123124，136,137，141，154，161，162，164，167,171,176,177，179，180，181，182，183，184,185,186，196，199，200,202，203，218，223,239，240,241,247,273，276,281，282，283,284,285,286，289，294，299，308，314,324，339,351，355,362，379,385，406，409，410和411優(yōu)選在選自以下的至少一個位置1，2，3，4,5，46，52，53，55，57,59，76,82,99，100，107,109，111,114，115，116，117，118'119，120,122，123,124,137，141，161，162,164，167,179,180，181,182，183，184，185，186,196，199,200,202，218,223,241，273，276,285，286，299，314，339，362，379，385，406，410和411;條件是該肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO:9和圖1中所列的它的變體。V.肌醇六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少74%同一性，并且其與47SEQIDN0:2相比包含在選自以下的至少一個位置上的至少一個變化4，5,41,46,59，82，84，91,99,105,107，109，111,115，116，117，119,122，123，124,136，137，141，161,162，164，167，171，176，179,180，186，196,199,200，218，223,239，240，241,247，273,276,281，282，283,284,289,294，299，308，314，324,339，351,355,379，385,406,409，410和411;優(yōu)選在選自以下的至少一個位置4，5，46，59，82，99，107,109,111,115，116，117,119，122，123,124，137，141,161,162，164,167,179，180,186，196，199，200，218，223，241，273,276，299，314,339,379，385,406，410和411。VI.肌醇六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少74%同一性并且其包含至少一個下列變化1*,2*,3*，4P，5P，31C,T,41P，46C，D,E,52C,E,53V,Q，55D,I，57Y，59C，74A,76G,82E，84Y，91C，P，99C,100C，104A，105F,107D,E，G，109A，G,111P，114H,N，T,115Q，116A,E，P,T,Q,117D,E,K1181,L,M,T,119G，K,R，S，120K，S,T，Q，121A，D，M，P，T，V,122D,123P，S，124L，T,V，136P，137P，141C,154P，161P，162C,164D，E,167Q，171T，176C，177C，179G，I，K,N,Q，180A，E,GT,181D,QI，K，182H,K，S,Q,183A，L，P，S,V,Q,184*，185*,186*，196Q，199C，200K，R，202N,203T,218Q，223E，239Q，240P,241Q，247C,273L，Q,276K，R，281H，282P，283P,284P,285G,N,R，286K,Q，289P，294T，299L,308A,314QN,316D,324N，331K,339D,351Y，355P,362K，R,379K，R,385D,楊A(yù),409D，E,410D,E和/或411R,K;和/或其中位置179，180，181,182，183，184,185和186的氨基酸被QADKP，GEDKP,NGISA，IAGKS,KEKHQ，KEKQQ,KEKKV或KTDKL所取代；優(yōu)選至少一個下列變化1*,2*,3*，4P，5P，31C，46E,52C,E，53V,55D,57Y,59C，76G，82E，99C，IOOC，107D，E，G,109A，111P,114T,115Q，116AT,117D,118T,119K,R,S,120S，121D,P，T，122D，123P，124L,137P，141C，161P,162C，164E，167Q,179K,180E,T，181D，K，182H,K,Q，183L,V,Q，184*,185*，186*，196Q,199C,200K，202N，218Q，223E,241Q,273L，276K，R,285QR,286Q,299L，314G,N，331K，339D,362K，R，379K，R,385D,406A,410D，E和/或411R,K;和/或其中在位置179,180,181,182,183，184，185和186的氨基酸被KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代；條件是該肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO:3，不是SEQIDNO:4，并且不是SEQIDNO:6。VII.肌醇六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少74%同一性并且其包含至少一個下列變化1*,2*,3*，4P，5P,31C，T,41P,46C,D，E，52C,E，53V,Q，55I，D，57Y,59C,74A，76G,82E,84Y,91C,P,99C,100C,104A，105F，107D，E,G，109A，G，111P,114H,N，T，115Q,116A,E，P,T,Q117D,E，K，1181,M，L，T，119GK,R，S，120K，S，T，Q，121A,D,M，P,V，122D，123P,S，124L，T,V,136P，137P，141C,154P，161P，162C，164D,E,167Q，171T，176C,177C，179QI，K，N,Q,180A,E，GT,181D,GI，K，182H,K，S,Q，183A,L，P,S，V,Q,184*，185*，186*，196Q，199C，200K,R，202N，203T，218Q,223E,239Q，240P,241Q,247C，273L,Q，276K，R，281H,282P，283P,284P,285G,N,R，286K，Q,289P,294T，299L，308A，314QN，316D，324N,339D,351Y，355P,362K，R，379K,R，385D,406A，409D,E，410D,E和/或411K,R;和/或其中在位置179，180，181，182，183，184，185和186的氨基酸被QADKP,GEDKP，NGISA，IAGKS，KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代；優(yōu)選至少一個下列變化1*,2*，3*,4P,5P，31C,46E，52C,E,53V，55D，57Y,59C，76G，82E,99C，100C,107D,E,G,109A，111P，114T，115Q，116AT,117D，118T，119K，R，S，120S,121D，P，122D，123P,124L，137P，141C，161P，162C，164E，167Q，179K,180E，T,181D,K，182H，K，Q，183L，V，Q,184*，185*,186*,196Q，199C,200K202N,218Q,223E,241Q，273L,276K，R，285G，R,286Q,299L,314QN,339D，362K，R,379K，R,385D，406A，410D,E和/或411R，K;和/或其中在位置179，180，181，182,183，184，185和186的氨基酸被KEKHQ,KEKQQ,KEKKV或KTDKL所取代。IIX.肌醇六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少74%同一性并且其包含至少一個下列變化1*，2*,3*，4P，5P,31C,T，41P,46C，D，E,52C，E,53V，Q,55D,I，57Y，59C，74A，76G，82E,84Y，91C,P,99C，IOOC，104A,105F，107D，E，G，109A,G，111P,114H，N,T,115Q,116A，E,P,T,Q，49117D，E，K,1181，L，M,T,119G，K，R,S，120K，S,T,Q，121A，D,M,P,T，V,122D，123P,S，124L，T,V,136P，137P，141C，154P,161P,162C，164D，E,167Q，171T，176C,177C,179QI,K,N，Q,180A，E,G，T,181D,QI,K，182H，K，S,Q，183A，L,P，S,V,Q,184*，185*，186*,196Q，199C，200K,R，202N，203T，218Q，223E,239Q，240P，241Q，247C，273L,Q,276K，R，281H，282P,283P,284P,285G，N，R，286K,Q，289P，294T,299L,308A,314，，316D，324N，331K，339D，351Y,355P,362K，R，379K,R，385D,406A，409D，E，410D，E和/或411R,K;和/或其中在位置179,180，181,182,183,184，185和186的氨基酸被QADKP，GEDKP，NGISA,IAGKS，KEKHQ，KEKQQ,KEKKV或KTDKL所取代；優(yōu)選至少一個下列變化1*，2*，3*,4P,5P,31C，46E，52C,E，53V,55D，57Y,59C,76G,82E，99C,IOOC，107D，E，G,109A，111P，114T,115Q,116AT，117D，118T,119K，R,S,120S，121D,P，122D,123P,124L,137P，141C，161P，162C,164E，167Q，179K,180E，T，181D，K,182H，K,Q,183L,V,Q,184*,185*，186*,196Q，199C，200K202N，218Q，223E，241Q,273L,276K，R，285QR，286Q,299L,314QN，339D，362K,R,379K,R,385D,406A,410D,E和/或411R,K;和/或其中在位置179,180，181,182，183，184，185和186的氨基酸被KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代。條件是該肌醇六磷酸酶不是SEQIDN0:3,不是SEQIDNO:4，不是SEQIDNO:6，并且不是SEQIDNO:9以及圖1所列的它的變體。IX.肌醇六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少74%同一性并且其包含至少一個下列變化1*,2*,3*，4P，5P，31C，T，41P,46C,D，E,52C,E，53V，Q,55I，D，57Y,59C,74A，76(3，82E，84Y，91C，P,99C，廳C,104A，105F,107D,E,G，109A，G，111P,114H，N,T,115Q,116A，E,P,T,Q117D,E，K,1181，M，L，T，119G，K，R，S，120K，S,T,Q，121A,D,M，P，V,122D，123P，S，124L，T,V，136P,137P,141C,154P,161P，162C，164D，E，167Q,171T,176C,177C，179G，I，K,N,Q,180A,E,(VT，181D，QI,K，182H，K,S,Q,183A,L,P,S,V,Q,184*，185*，186*，196Q，199C，200K,R，202N，203T,218Q,223E，239Q，240P,241Q,247C,273L，Q，276K，R，281H，282P，283P，284P,285GN,R，286K,Q,289P，294T，299L，308A,314G，N，316D,324N,339D,351Y,355P,362K,R，379K,R，385D,406A，409D，E,410D，E和/或411K,R;和/或其中在位置179，180，181，182，183,184，185和186的氨基酸被QADKP,GEDKP，NGISA，IAGKS，KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代；優(yōu)選至少一個下列變化1*,2*,3*，4P，5P，31C，46E，52C,E，53V，55D,57Y,59C，76G，82E，99C,IOOC，107D,E，G，109A，111P，114T,115Q,116AT,117D,118T，119K,R，S，120S,121D，P，122D，123P，124L，137P,141C,161P，162C，164E,167Q，179K,180E,T，181D,K，182H,K,Q，183L，V，Q，184*,185*,186*，196Q，199C,200K202N，218Q,223E,241Q，273L,276K，R，285QR,286Q，299L,314QN，339D，362K，R，379K，R，385D,406A，410D，E和/或411R，K;和/或其中在位置179，180，181,182，183，184，185和186的氨基酸被KEKHQ,KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代。條件是該肌醇六磷酸酶不是SEQIDN0:9和圖1所列的它的變體。X.肌醇六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少74%同一性并且其包含至少一個下列變化1*,2*,3*，4P，5P，31C，T，41P,46C，D，E,52C,E，53Q，55D，57Y,59C，74A，82E，84Y,91C，P，99C,100C,104A,105F，107D,E,G,109A,G，111P,114H,T,115Q，116A,E,P，T，Q，117D,E,K,1181,M,L,T，119G,K,R,S,120K，S,T，Q，121A，D,M，V，122D，123P，S，124L，T，V，136P,137P,141C，154P，161P,162C，164D，E,167Q，171T,176C，177C,179GI,K,N,Q，180A，E,G,T，181D,G，K，182K，S,Q，183A，L,S,V,Q，184*，185*,186*,196Q，199C,200K,R，202N，203T,218Q，223E，239Q,240P,241Q，247C，273L，Q,276K，R,281H，282P,283P,284P,285G,N，R，286K，Q，289P，294T,299L，308A，314，，316D,324N,339D,351Y，355P，362K，R,379K，R,385D，406A，409D，E,410D,E和/或411K，R;和/或其中在位置179，180，181，182,183，184，185和186的氨基酸被QADKP,GEDKP,NGISA,IAGKS,KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代；優(yōu)選至少一個下列變化1*，2*，3*，4P，5P，31C，46E，52C,E,55D，57Y，59C，82E，99C，畫C，107D,E，G，109A,111P，114T,115Q,116AT，117D，118T，119K,R,S，120S,121D,122D,123P，124L，137P,141C,161P，162C，164E，167Q，179K,180E，T，181D，K,182K,Q,183L,V,Q,184*,185*，186*,196Q，199C,200K202N,218Q,223E,241Q,273L,276K，R，285G，R,286Q，299L，314G,N，339D，362K,R，379K，R,385D，406A，410D,E和/或411R，K;和/或其中在位置179，180,181，182,183，184，185和186的氨基酸被KEKHQ,KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代。XI.肌醇六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少74%同一性并且其包含至少一個下列變化1H，K，R,60P，105E，106A,G,155F，157F,173P，175L，188P，205P，215M，231P,254Y，280P，330D和/或371P;優(yōu)選1K;條件是該肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO:3，不是SEQIDNO:4，不是SEQIDNO:6，并且不是SEQIDNO:9以及圖1中列出的它的變體。XII.肌醇六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少74%同一性并且其包含至少一個下列變化1H,R,60P，105E,106A,G，157F，173P，175L，188P,205P，215M,231P，254Y,280P。XIII.肌醇六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少74%同一性并且其包含至少一個下列變化52C,141C，162C,31C，52C,99C,59C，100C,141C/199C，4P，5P，111P，137P,161P,52E,57Y，76G,107D，107G,109A,1*，1*/2*，1*/2*/3*,121T,273L，285G，286Q，299L，362K,331K/55D，107E，46E,82E，119R，119K，164E，223E，276R,276K，362R，379R，379K，385D，410D，410E，411R,411K,53V，121D，167Q,196Q，200K,202N,218Q,241Q,285N，314N,314G,406A,179K/180E/181K/182H/183Q/184*/185*/186*，179K/180E/181K/182Q/183Q/184*/185*/186*，179K/180E/18IK/182K/183V/184*/185*/186*,179K/180T/181D/182K/183L/184*/185*/186*，111P/241Q，1K，XIV.實施方式1-13中任一項的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDNO:2的肌醇六》粦酸酶的變體。XV.實施方式1-13中任一項的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDNO:3的肌醇六磷酸酶的變體。XVI.實施方式1-13中任一項的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDN0:4的肌醇六磷酸酶的變體。XVII.實施方式1-13中任一項的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDNO:6的肌醇六磷酸酶的變體。IIXX.實施方式1-13中任一項的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDNO:9的肌醇六磷酸酶的變體。IXX.實施方式1-13中任一項的肌醇六磷酸酶，其是與SEQIDNO:9相關(guān)并在圖1中列出的肌醇六磷酸酶變體中的任一種的變體。XX.實施方式1-19中任一項的肌醇六磷酸酶，其進(jìn)而包含選自圖1中每行列出的取代和取代組合中的取代或取代組合。XXI.實施方式1-20中任一項的肌醇六磷酸酶，其具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性，改進(jìn)的pH曲線，改進(jìn)的比活性，修改的糖基化模式，改進(jìn)的溫度曲線，改進(jìn)的在動物飼料中的性能，和/或其含有(incorporate)潛在的蛋白酶切割位點的改變。XXII.分離的核酸序列，其包含編碼實施方式I-XXI中任一項的肌醇六磷酸酶的核S交序列。xxni.核酸構(gòu)建體，其包含實施方式xxn的核酸序列，該核酸序列可操作地連接于指導(dǎo)在恰當(dāng)表達(dá)宿主中產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的一個或多個調(diào)控序列。XXIV.重組表達(dá)載體，其包含實施方式XXIII的核酸構(gòu)建體。XXV.重組宿主細(xì)胞，其包含實施方式XXIII的核酸構(gòu)建體和/或?qū)嵤┓绞絏XIV的表達(dá)載體。XXVI.制備實施方式I-XXI中任一項的肌醇六磷酸酶的方法，其包括(a)培養(yǎng)實施方式XXV的宿主細(xì)胞以產(chǎn)生包含肌醇六磷酸酶的上清液；和(b)回收fl醇六磷酸酶。XXVII.轉(zhuǎn)基因植物，或植物部分，其能夠表達(dá)實施方式I-XXI中任一項的l幾醇六^粦酸酶。IIXXX.轉(zhuǎn)基因的，非人動物，或它的產(chǎn)物，或組分(dement),其能夠表達(dá)實施方式I-XXI中任一項的肌醇六磷酸酶。IXXX.組合物，其包含實施方式I-XXI中任一項的至少一種肌醇六磷酸酶,和(b)至少一種水溶性維生素；和/或(c)至少一種痕量礦物質(zhì)。XXX.實施方式IXX的組合物，其進(jìn)一步包含選自下組的酶中的至少一種酶淀粉酶，肌醇六磷酸酶，磷酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶，a-半乳糖苦酶，蛋白酶，磷脂酶和/或(3-葡聚糖酶。XXXI.實施方式IXX-XXX中任一項的組合物，其是動物飼料添加劑。XXXII.動物飼料組合物，其具有50至800g/kg的粗蛋白含量并且包含實施方式I-XXI中任一項的肌醇六磷酸酶或?qū)嵤┓绞絀XXX-XXXI中任一項的纟且合物。XXXIII.用于改進(jìn)動物飼料營養(yǎng)價值的方法，其中將實施方式I-XXI中任一項的肌醇六磷酸酶或?qū)嵤┓绞絀XXX-XXXI中任一項的組合物添加到飼料中。XXXIV.用于降低動物糞便中肌醇六磷酸鹽水平的方法，其包括以有效量的實施方式XXXII的飼料喂養(yǎng)動物。XXXV.用于處理植物蛋白的方法，其包括向至少一種植物蛋白或蛋白源添加實施方式I-XXI中任一項的肌醇六磷酸酶或?qū)嵤┓绞絀XXX-XXXI中任一項的組合物的步驟。XXXVI.實施方式I-XXI中任一項的肌醇六磷酸酶或?qū)嵤┓绞絀XXX-XXXI中任一項的組合物在動物飼料中的用途；在動物飼料的制備中的用途；用于改進(jìn)動物飼料的營養(yǎng)價值的用途；用于降低動物糞便中的肌醇六磷酸鹽水平的用途；用于植物蛋白的處理的用途；或用于從肌醇六磷酸酶底物中釋放磷的用途。a).肌醇六磷酸酶，其與SEQIDN0:2具有至少70%同一性并且其與SEQIDNO:2相比包含選自下列的至少一個變化1,2，3，4，5,31,41，46,52，53,55,57，59，74，76，82，84，91，99，100,104，105，107，109，111，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123,124，136，137,141，154,161,162，164，167,171，176，177，179,180,181,182，183，184，185，186，196,199，200,202,203，218，223，239，240，241，247，273,276,281，282,283,284,285,286，289,294,299，308，314，316，324,331，339,351,355，362，379，385,406,54409，410和411;條件是該肌醇六磷酸酶不是SEQIDN0:3，不是SEQIDN0:4，并且不是SEQIDNO:6。al).肌醇六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少70%同一性并且其與SEQIDNO:2相比包含選自下列的至少一個變化1，2,3，4，5，31,41，46，52，53，55,57，59，74,76,82,84，91,99，100，104，105，107，109，111,114，115,116，117，118，119，120,121,122，123，124,136,137，141,154，161，162,164，167，171,176,177，179，180，181,182，183,184，185，186，196，199,200，202，203，218，223，239,240，241,247，273,276，281,282，283，284,285，286,289，294，299，308,314，316，324，331，339,351，355，362，379,385，406，409，410和411;條件是該變體不包含(i)31D/121T/316N/331E,并且不包括(ii)31D/121N/316K/331E,并且不包括(iii)31N/121N/316N/331K。a2).肌醇六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少70%同一性并且其與SEQIDNO:2相比包含選自下列的至少一個變化1,2，3，4,5,41,46，52，53，55，57，59，74,76,82，84，91，99，100,104，105，107,109,111，114，115，116，117，118,119，120,122，123，124,136，137，141，154,161,162,164,167,171，176，177，179，180，181,182，183,184,185,186，196，199，200，202,203，218,223，239，240，241,247，273，276，281,282,283，284，285,286，289，294，299,308，314，324,339，351，355，362，379,385，406,409,410和411。a3).實施方式a2)的肌醇六磷酸酶，其包含至少一個下列變化1*，2*，3*,4P，5P，31C,T，41P，46C,D,E,52C,E，53V,Q，55I,D，57Y，59C,74A，76G，82E,84Y，91C，P,99C,100C，104A，105F,107D,E,G,109A,G，111P，114H，N，T,115Q,116A，E,P，T,Q117D，E，K，1181，M,L,T，119G，K,R,S,120K,S,T,Q，121A,D，M，P，V，122D,123P，S，124L,T，V，136P，137P，141C,154P，161P，162C，164D，E,167Q，171T,176C，177C,179GJ，K,N，Q，180A，E,G，T，181D，G，I,K,182H,K，S,Q,183A，L，P,S，V，Q，184*,185*，186*,196Q，199C，200K，R,202N，203T,218Q，223E，239Q,240P,241Q，247C，273L,Q,276K，R，281H，282P,283P，284P,285G，N,R,286K,Q,289P,294T，299L，308A,314G，N,316D，324N,339D,351Y，355P，362K，R，379K,R,385D,406A,409D,E，410D,E和/或411K,R;和/或其中55在位置179,180,181,182,183，184，185和186的氨基酸被QADKP，GEDKP,NGISA，IAGKS,KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代。a4).實施方式a2)-a3)中任一項的肌醇六磷酸酶,其包含至少一個下列變化(i)31C,46C，52C，59C,91C，99C,謂C,141C，162C,176C，177C,199C和/或247C;(ii)4P,5P，41P，91P，111P，136P,137P，154P，161P,240P,282P，283P,284P，289P和/或355P;(iii)52E，55D,I,57Y,76G，84Y,104A，105F,107D，G，109A,G,273L，Q，285G，R,286Q,294T，299L，351Y和/或362K;(iv)1*,1*/2*或1*/2*/3*;(v)其中K179，T180,T181，E182,K183,S184，T185和K186已經(jīng)被QADKP,GEDKP,NGISA，IAGKS,KEKHQ，KEKQQ,KEKKV或KTDKL所取代；(vi)119K,R和/或411K,R;(vii)107E和/或164D,E;(viii)46D，E，82E，223E,276K，R，362K，R，379K，R，385D，409D，E和/或410D，E;(ix)53V，Q，121D，167Q,196Q,200K，R,202N，218Q，239Q，241Q,285N,314G,N，324N和/或406A;(x)114H，N,T115Q,116A,E,P,T,Q，117D，E，K，1181,L，M,T119QK，S，120K,S,T,Q,121A，M,P，V,122D，123P,S和/或124L，T，V(xi)31T，74A,171T，203T,281H,308A和/或316D;和/或(xii)339D。a5).實施方式a2)-a4)中任一項的肌醇六磷酸酶，其包含至少一個下列變化(i)141C/199C，91C/46C,52C/99C,31C/176C，31C/177C，59C/100C和/或162C/247C;(ii)41P,91P,136P，137P，154P，161P，355P，111P,240P，282P,283P,284P，289P，4P和/或5P;(iii)52E，551，57Y,104A/105F,107D,G,109A，G，76G,84Y，362K，273L，Q,285QR，286Q,294T,299L，331K/55D和/或351Y;(iv)1*，1*/2*或1*/2*/3*;(v)其中K179，T180,T181,E182，K183,S184，T185和K186已經(jīng)被QADKP,GEDKP,NGISA，IAGKS，KEKHQ，KEKQQ,KEKKV或KTDKL取代；(vi)119R，K和/或411R,K;(vii)107E和/或164E,D;(viii)362R,K，276R,K，379R,K，409D,E，223E，385D,46D，E，410D，E和/或82E;(ix)218Q，324N,200R,K，121D,196Q，202N，406A,167Q,53V,Q,241Q,314N,G，239Q和/或285N;(x)114H/115Q/116P/117E/1181/119G/120K/121M/122D/123P/124V,114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L,(xi)31T，74A，171T,203T，281H,308A，和/或316D;和/或(xii)339D。b).實施方式a)或al)的肌醇六磷酸酶，其包含至少一個下列變化1*，2*,3*，4P,5P，31C,T，41P,46C,D，E，52C,E,53V，Q，55D，I，57Y，59C,74A,76G，82E，84Y，91C,P,99C，IOOC，104A,105F,107D,E，G,109A,G，111P，114H,N，T，115Q,116A，E，P，T，Q,117D,E,K1181,L，M,T119QK,R，S，120K，S,T,Q，121A,D,M,P,T,V，122D，123P,S，124L，T,V,136P，137P,141C,154P,161P，162C,164D，E，167Q,171T,176C,177C，179QI,K,N,Q,180A，E,G,T，181D,G,I,K,182H,K，S,Q，183A，L，P，S，V,Q,184*,185*，186*，196Q,199C，200K，R，202N，203T，218Q,223E，239Q,240P,241Q,247C,273L,Q,276K,R,281H,282P，283P,284P，285G,N,R，286K，Q，289P,294T,299L，308A，314，，316D，324N,331K,339D，351Y，355P，362K,R，379K，R,385D，406A，409D,E,410D，E和/或411R,K;和57/或其中在位置179，180,181，182，183,184,185和186的氨基酸被QADKP，GEDKP,NGISA，IAGKS，KEKHQ,KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代。c).上面實施方式中任一項的肌醇六磷酸酶，其包含至少一個下列變化(i)31C,46C,52C,59C，91C，99C,IOOC，141C,162C,176C，177C,199C和/或247C;(ii)4P,5P,41P，91P，111P,136P,137P，154P,161P,240P，282P,283P，284P,289P和/或355P;(iii)52E,55D，I,57Y，76G,84Y,104A,105F,107D,G，109A,G，121T，273L，Q,285QR，286Q，294T，299L，331K,351Y和/或362K;(iv)1*，1*/2*或1*/2*/3*;(v)其中K179，T180,T181，E182，K183，S184，T185和K186被QADKP,GEDKP,NGISA，IAGKS,KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL取代；(vi)119K，R和/或411K,R;(vii)107E和/或164D，E;(viii)46D，E,82E，223E，276K，R,362K，R，379K，R，385D，409D,E和/或410D,E;(ix)53V,Q，121D，167Q,196Q,200K,R，202N，218Q,239Q，241Q，285N，314G,N，324N和/或406A;(x)114H,N,T115Q，116A,E,P,T,Q，117D，E,K,簡,L,M,T119G,K,S,120K，S,T，Q，121A,M，P,T，V，122D,123P,S和/或124L,T，V;(xi)31T,74A，171T,203T，281H，308A和/或316D;和/或(xii)339D。cl).上述實施方式中任一項的肌醇六磷酸酶，其包含至少一個下列變化(i)31C,46C,52C，59C，91C,99C，100C,141C，162C，176C，177C，199C和/或247C，優(yōu)選52C，99C,141C和/或199C;(ii)4P,5P，41P,91P,111P，136P，137P,154P,161P,240P，282P，283P，284P,289P和/或355P,優(yōu)選4P，5P，111P;(iii)52E，55D,I，57Y，76G，84Y，104A，105F，107D,G,歸A，G,58121T,273L，Q，285G,R，286Q，294T,299L,331K,351Y和/或362K，優(yōu)選57Y，76G,107G,273L，286Q和/或362K;(iv)1*，1*/2*或1*/2*/3*;(v)其中K179，T180,T181,E182,K183，S184，T185和K186被QADKP,GEDKP,NGISA,IAGKS，KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL，優(yōu)選KEKKV取代；(vi)119K,R和/或411K,R，優(yōu)選119K;(vii)107E和/或164D,E;(viii)46D，E,82E，223E，276K,R，362K,R，379K,R,385D,409D，E和/或410D,E優(yōu)選46E,223E362K，R和/或379K，R;(ix)53V，Q，121D，167Q,196Q,200K，R，202N，218Q,239Q，241Q，285N，314GN，324N和/或406A，優(yōu)選53V，121D,196Q，200K，202N，218Q,241Q,314N和/或406A;(x)114H，N,T115Q，116A，E，P,T,Q,117D,E，K,1181，L，M,T，119G，K,S，120K，S,T,Q,121A，M,P，T，V，122D，123P,S和/或124L,T，V優(yōu)選114T115Q，116A，T,117D,118T119K，S,120S,121P，122D，123P和/或124L;(xi)31T，74A,171T，203T,281H,308A和/或316D;和/或(xii)339D。d).上面實施方式中任一項的肌醇六磷酸酶，其具有改進(jìn)的特性。e).實施方式c)或cl)的肌醇六磷酸酶，其包含實施方式3的特性(i)，(ii)，(iii),(iv)，(v)，(vi),(vii)，(viii)，(x)，(xi)和/或(xii)的一個或多個變化中的至少一個，并具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性。f).實施方式c)或cl)的肌醇六磷酸酶，其包含實施方式c)的特性(ix)和/或(x)的一個或多個變化中的至少一個，并具有改進(jìn)的pH曲線。g).實施方式c)或cl)的肌醇六磷酸酶，其包含實施方式c)的特性(x)的一個或多個變化中的至少一個，并具有改進(jìn)的比活性。h).實施方式c)或cl)的肌醇六磷酸酶，其包含實施方式c)的特性(xi)的一個或多個變化中的至少一個，并具有修改的糖基化模式。i).實施方式c)或cl)的肌醇六磷酸酶，其包含實施方式c)的特性(xii)的變化，其改變了潛在的蛋白酶切割位點。j).包括al)-a5)和cl)的實施方式a)-d)中任一項的肌醇六磷酸酶，其包含至少一個下列變化(i)141C/199C,91C/46C，52C/99C，31C/176C,31C/177C,59C/100C和/或162C/247C;(ii)41P,91P，136P，137P，154P，161P，355P，111P,240P,282P，283P,284P,289P，4P和/或5P;(iii)52E,551，57Y，104A/105F,107D,G，109A,G，76G，84Y，121T，362K，273L,Q,285QR，286Q,294T，299L，331K/55D和/或351Y;(iv)1*，1*/2*或1*/2*/3*;(v)其中K179,T180，T181,E182，K183,S184,T185和K186被QADKP，GEDKP,NGISA，IAGKS，KEKHQ,KEKQQ,KEKKV或KTDKL取代；(vi)119R,K和/或411R，K;(vii)107E和/或164E,D;(viii)362R，K,276R，K,379R，K，409D，E,223E，385D，46D,E，410D，E和/或82E;(ix)218Q，324N，200R,K,121D,196Q，202N，406A,167Q，53V,Q，241Q，314N,G,239Q和/或285N;114H/115Q/116Q/117D/1181/119K/120Q/121A/122D/123P/124L，(xi)31T，74A，171T，203T，281H，316D和/或308A;和/或(xii)339D。k).包括al)-a5)和cl)的實施方式a)-d)中任一項的肌醇六磷酸酶，包含至少一個下列變化(i)K141C/V199C，Q91C/W46C,G52C/A99C，N31C/E176C，N31C/T177C,G59C/F100C和/或S162C/S247C;(ii)D41P，Q91P，N136P,T137P，L154P,S161P,T355P，Q111P，K240P,G282P，T283P,T284P，G289P，N4P和/或G5P;(iii)G52E,V55I,E57Y，L104A/A105F，K107D,G，Q109A，G，T76G，A84Y,N121T，I362K,M273L，Q,E285QR，N286Q，V294T,1299L，E331K/V55D和/或F351Y;(iv)El*，EP/E2氺或El*/E2*/Q3*;(v)其中K179，T180，T181,E182，K183，S184,T185和K186被QADKP,GEDKP,NGISA，IAGKS，KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代；(vi)E119R,K和/或E411R，K;(vii)K107E和/或R164E，D;(viii)1362R,K,T276R,K，1379R,K，V409D,E，Q223E，N385D,W46D，E，T410D,E和/或Q82E;(ix)E218Q,D324N，T200R,K,N121D,E196Q，D202N，E406A，E167Q,E53V，Q，E241Q,D314N，G,E239Q和/或E285N;(x)Y114H/K116E/D117K/E118廳119G/K120T/N121M/L124T，Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121V/P123S,Y114魔116P/D117E/E118I/E119G/N121M/L124V,Y114T/K116A/E118T/E119S/K120S/N121P，Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121A,Y114T/K116T/E118T/E119S/K120S/N121P或Yl14N/K116A/E118L/E119K/N121T;(xi)N31T,N74A,N171T,N203T,N281H,N316D和/或N308A;和/或(xii)R339D。1).實施方式k)的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDNO:2的變體。m).包括al)-a5)和c)的實施方式a)-d)中任一項的肌醇六磷酸酶，其包含至少一個下列變化Ci)T141C/V199C，Q91C/W46C，G52C/A99C,D31C/E176C,D31C/T177C,G59C/F100C和/或S162C/S247C;(ii)D41P,Q91P,N136P，T137P,L154P，S161P，T355P,Q111P，K240P，G282P，T283P，T284P,G289P，N4P和/或G5P;(iii)G52E，V55I,E57Y,L104A/A105F,K107D，G，Q109A,G,T76G,A84Y,I362K,M273L,Q，E285G,R，麗6Q，V294T,I299L,E331K/V55D和/或F351Y;(iv)E1*,EP/E2承或El*/E2*/Q3*;(v)其中K179，T180,T181,E182，K183，S184,T185和K186被QADKP，GEDKP，NGISA，IAGKS，KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL;(vi)El19R,K和/或E411R，K;(vii)K107E，R164E，D;(viii)1362R，K,T276R，K,1379R,K，V409D，E,Q223E,N385D，W46D,E，T410D，E,Q82E;(ix)E218Q，D324N，T200R,K，T121D,E196Q，D202N，E406A，E167Q，E53V,Q，E241Q,D314N,G,E239Q和/或E285N;Cx)Y114H/K116E/D117K/E118廳119G/K120T/T121M/L124TY114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/T121V/P123SYl14H/K116P/D117E/E118I/E119G/T121M/L124VYl14T/K116A/E118T/E119S/K120S/T121P/Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/T121A/(xi)N74A，N171T，N203T,N281H,N316D和/或N308A;和/或(xii)R339D。n).實施方式m)的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDN0:4的變體。o).包括al)-a5)和cl)的實施方式a)-d)中任一項的肌醇六磷酸酶，其包含至少一個下列變化(i)K141C/V199C,Q91C/W46C,G52C/A99C，D31C/E176C，D31C/T177C，G59C/F100C和/或S162C/S247C;(ii)D41P，Q91P,N136P，T137P，L154P，S161P，T355P，Q111P,K240P，G282P，T283P，T284P，G289P，N4P和/或G5P;(iii)G52E，V55I，E57Y，L104A/A105F,K107D，G，Q109A,G，T76G,A84Y,N121T，I362K,M273L,Q,E285QR,N286Q，V294T，I299L,E331K/V55D和/或F351Y;(iv)E1*,E1"E2承或El*/E2*/Q3*;(v)其中K179，T180,T181,E182,K183，S184,T185和K186被QADKP,GEDKP,NGISA，IAGKS,KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代；(vi)El19R，K和/或E411R,K;(vii)K107E和/或R164E,D;(viii)1362R,K,T276R，K，1379R，K，V409D，E,Q223E，N385D,W46D，E,T410D，E和/或Q82E;(ix)E218Q，D324N,T200R，K，N121D，E196Q，D202N，E406A,E167Q,E53V,Q,E241Q，D314N，G,E239Q和/或E285N;(x)Y114H/K116E/D117K/E118M/E119G/K120T/N121M/L124T，Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121V/P123S，Y114H/K116P/D117E/E118I/E119G鹿21M/L124V,Y114T/K116A/E118T/E119S/K120S/N121P,Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121A，Y114T/K116T/E118T/E119S/K120S/N121P或Y114N/K116A/E118L/E119K/N121T;(xi)N74A,N171T，N203T,N281H和/或N308A;和/或(xii)R339D。p).實施方式o)的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDN0:3的變體。q).包括al)-a5)和cl)的實施方式a)-d)中任一項的肌醇六磷酸酶，其包含至少一個下列變化(i)K141C/V199C，Q91C/W46C,G52C/A99C，N31C/E176C，N31C/T177C,G59C/F100C和/或S162C/S247C;(ii)D41P，Q91P,N136P，T137P，L154P，S161P，T355P，Q111P，K240P，G282P，T283P,T284P，G289P，N4P和/或G5P;(iii)G52E,V55I,E57Y,L104A/A105F，K107D，G，Q109A,G,T76G，A84Y，N121T,I362K,M273L,Q，E285G,R,N286Q，V294T，I299L,V55D和/或F351Y;(iv)El*，E"/E2承或El*/E2*/Q3*;(v)其中K179，T180，T181,E182，K183,S184,T185和K186被QADKP，GEDKP，NGISA，IAGKS，KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL63所取代；(vi)E119R,K和/或E411R，K;(vii)K107E和/或R164E，D;(viii)1362R,K，T276R，K，1379R,K，V409D，E，Q223E,N385D，W46D，E，T410D,E和/或Q82E;(ix)E218Q，D324N，T200R，K,N121D，E196Q,D202N,E406A，E167Q,E53V，Q,E241Q,D314N,G,E239Q和/或E285N;(x)Y114H/K116E/D117K/E118M/E119G/K120窗121M/L124T,Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121V/P123S，Y114H/K116P/D117E/E118I/E119G/N121M/L124V，Y114T/K116A/E118T/E119S/K120S/N121P，Y114跳116Q/E118I/E119K/K120Q/N121A,Y114T/K116T/E118T/E119S/K120S/N121P或Yl14N/K116A/E118L/E119K/N121T;(xi)N31T，N74A，N171T，N203T，N281H，N316D和/或N308A;和/或(xii)R339D。r).實施方式q)的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDNO:6的變體。s).包括al)-a5)和cl)的實施方式a)-d)中任一項的肌醇六磷酸酶，其包含至少一個下列變化(i)K141C/V199C,Q91C/W46C，G52C/A99C，D31C/E176C,D31C/T177C,G59C/F100C和/或S162C/S247C;(ii)D41P,Q91P,圖6P，T137P,L154P，S161P，T355P,Q111P，K240P，G282P，T283P,T284P,G289P，N4P和/或G5P;(iii)G52E,V55I，E57Y，L104A/A105F,K107D,G，Q109A,G，T76G，A84Y,I362K,M273L，Q，E285G,R，N286Q，V294T,I299L,E331K/V55D和/或F351Y;(iv)El*，E1"E2氺或El*/E2*/P3*;(v)其中K179,T180,T181，E182，K183,S184,T185和K186被QADKP,GEDKP,NGISA，IAGKS,KEKHQ,KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代；(vi)E119R，K和/或E411R，K;(vii)K107E和/或R164E,D;(viii)1362R，K，T276R,K,1379R，K,V409D，E，Q223E，N385D,W46D,E,T410D,E和/或Q82E;(ix)E218Q，D324N，T200R，K，T121D,E196Q，D202N,E406A，E167Q,E53V，Q,E241Q,D314N，G，E239Q和/或E285N;(x)Y114H/K116E/D117K/E118M/E119G/K120T/T121M/L124T，Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/T121窗23S，Y114H/K116P/D117E/E1181/E119G/T121M/L124V，Yl14T/K116A/E118T/E119S/K120S/T121P，Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/T121A,Y114T/K116T/E118T/E119S/K120S/T121P或Yl14N/K116A/E118L/E119K;(xi)D31T，N74A，N171T，N203T，N281H,N316D和/或N308A;和/或(xii)R339D。t).實施方式s)的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDNO:9的變體。u).分離的核酸序列，其包含編碼實施方式a)-t)包括al)-a5)和cl)中任一項的肌醇六磷酸酶的核酸序列。v).核酸構(gòu)建體，其包含實施方式u)的核酸序列，該核酸序列可操作地連接于指導(dǎo)在合適的表達(dá)宿主中產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的一個或多個調(diào)控序列。w).重組表達(dá)載體，其包含實施方式v)的核酸構(gòu)建體。v).X).重組宿主細(xì)胞，其包含實施方式v)的核酸構(gòu)建體和/或?qū)嵤┓绞絯)的表達(dá)載體。y).用于產(chǎn)生實施方式a)-t)包括al)-a5)和cl)中任一項的肌醇六磷酸酶的方法，其包括(a)培養(yǎng)實施方式x)的宿主細(xì)胞以產(chǎn)生包含肌醇六磷酸酶的上清液；和(b)回收肌醇六磷酸酶。z).轉(zhuǎn)基因植物，或植物部分，其能夠表達(dá)實施方式a)-t)包括al)-a5)和C1)中任一項的肌醇六磷酸酶。ae).轉(zhuǎn)基因的，非人動物，或它的產(chǎn)物，或組分，其能夠表達(dá)實施方式a)-t)包括al)-a5)和cl)中任一項的肌醇六磷酸酶。oe).組合物，其包含實施方式a)-t)包括al)-a5)和cl)中任一項的至少一種肌醇六磷酸酶，和(a)至少一種脂溶性維生素；(b)至少一種水溶性維生素；和/或(c)至少一種痕量礦物質(zhì)。aa).實施方式oe)的組合物，其進(jìn)一步包含選自下組的酶中的至少一種酶淀粉酶，肌醇六磷酸酶，磷酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶，a-半乳糖普酶，蛋白酶，磷脂酶，和/或P-葡聚糖酶。bb).實施方式oe)-aa)中任一項的組合物，其是動物伺料添加劑。cc).動物詞料組合物，其具有50至800g/kg的粗蛋白含量并且包含實施方式a)-t)包括al)-a5)和cl)中任一項的肌醇六磷酸酶或?qū)嵤┓绞給e)-aa)中4壬一項的纟且合物。dd).用于改進(jìn)動物詞料營養(yǎng)價值的方法，其中將實施方式a)-t)包括al)-a5)和cl)中任一項的肌醇六磷酸酶或?qū)嵤┓绞給e)-aa)中任一項的組合物添加至飼料中。ee).用于降低動物糞便中肌醇六磷酸鹽水平的方法，其包括用有效量的實施方式cc)的飼料喂養(yǎng)動物。ff).用于處理植物蛋白的方法，其包括將實施方式a)-t)包括al)-a5)和c1)中任一項的肌醇六磷酸酶或?qū)嵤┓绞給e)-aa)中任一項的組合物添加到至少一種植物蛋白或蛋白源中的步驟。gg).實施方式a)-t)包括al)-a5)和cl)中任一項的肌醇六磷酸酶或?qū)嵤┓绞給e)-aa)中任一項的組合物在動物詞料中的用途；在制備動物飼料中的用途；用于改進(jìn)動物祠料的營養(yǎng)價值的用途；用于降低動物糞^f更中的肌醇六磷酸鹽水平的用途；用于處理植物蛋白的用途；或用于/人肌醇六磷酸酶底物中釋放磷的用途。本文描迷和要求保護(hù)的發(fā)明的范圍不限制于本文所公開的具體實施方式，因為這些實施方式意在作為本發(fā)明的幾個方面的說明。任何等同的實施方式應(yīng)該在本發(fā)明的范圍內(nèi)。確實，除本文所展示和描述之外的對本發(fā)明的各種修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。這些修飾也應(yīng)該在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。在有沖突的情況下，以包括定義在內(nèi)的本公開為準(zhǔn)。本文引用的各種參考文件，將其公開內(nèi)容通過引用并入本文。實施例所用的化學(xué)劑至少是試劑級商品。實施例l:變體的制備，和溫度穩(wěn)定性和pH曲線的檢測肌醇六磷酸酶變體的制備編碼具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶變體的DNA通過本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生，并且用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將構(gòu)建體通過PCR融合于由Takami等在Biosci.Biotechnol.Biochem.56:1455(1992)中所描述的編碼信號肽的DNA并通過同源重組整合進(jìn)枯草芽胞桿菌宿主細(xì)胞的基因組中(參見Diderichsen等(19卯)，J.Bacteriol.，172，4315-4321)?；蛟谌龁幼酉到y(tǒng)(如WO99/43835所述)的控制下表達(dá)并用常規(guī)方法純化得到的肌醇六磷酸酶蛋白。溫度穩(wěn)定性的測定肌醇六磷酸酶變體的溫度穩(wěn)定性可以通過下列方式測定變體和參考蛋白的500微升蛋白溶液(SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4和/或SEQIDNO:6)具有約10微克蛋白每毫升并且溶解在0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.5中，將該蛋白溶液分成兩部分，一部分在期望的升高的溫度(例如50。C，55。C,60。C,65。C,70。C,75。C,80。C或85。C)在塑料容器內(nèi)溫育，另一部分保存于5。C。在升高的溫度下溫育30分鐘之后將蛋白溶液轉(zhuǎn)移到水浴，并且通過下述磷酸酶測定法來測量(扣除緩沖液空白(bufferWindsubtracted))冷卻的樣品和加熱的樣品的活性。將殘余活性定義為熱處理后的活性除以冷卻的樣品的活性(以％形式)。如果在磷酸酶或肌醇六磷酸酶測定法中的殘余活性與參考相比更高，則認(rèn)為變體對溫度更加穩(wěn)定(熱穩(wěn)定)。磷酸酶活性的測定將75樣i升含肌醇六磷酸酶的酶溶液分配到微量滴定板孔(microtiterplatewell)例如NUNC269620中，并且添加75樣i升底物(對于制備底物，將兩個5mg對硝基苯基磷酸片劑(Sigma，目錄號N-9389)溶于10ml0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.5)。將平板密封然后溫育15分鐘，在37。C以750rpm搖動培養(yǎng)。在67溫育期之后添加75微升終止試劑(終止試劑是水中的0.1M四硼酸二鈉)并且在微量滴定板分光光度計上測定在405nm的吸光度。將一個磷酸酶單位定義為在給定反應(yīng)條件下每分鐘釋放l微摩爾磷酸根的酶活性(扣除緩沖液空白)。在測試條件下測定l微摩爾對硝基酚的吸光度為56AU(AU-吸收單位)。DSC測量差異掃描量熱法(DSC)可以在各種pH-值下用MicroCal的VP-DSC來進(jìn)行。掃描在恒定的掃描率1.5。C/min下進(jìn)行，范圍20-90。C。在開始DSC之前，將肌醇六磷酸酶用在適宜緩沖液(例如0.1M甘氨酸-HC1，pH2.5或3.0;20mM乙酸鈉pH4.0;O.IM乙酸鈉，pH5.5;0.1MTris-HCl，pH7.0)中平衡的NAP-5柱(Pharmacia)脫鹽。數(shù)據(jù)處理是使用MicroCalOrigin軟件(MicroCalOriginsoftware)(版本4.10)進(jìn)行，并且將變性溫度Td(也稱為解鏈溫度，Tm)定義為熱解曲線(thermogram)中峰的頂端溫度。修正的pH曲線pH3.5/5.5活性比率的測定肌醇六磷酸酶變體的pH曲線的修正可以如下確定在pH3.5時(0.1M乙酸鹽緩沖液，pH3.5)和pH5.5時(0.1M乙酸鹽緩沖液，pH5.5)測量活性，兩種情況下均扣除緩沖液空白。用在pH3.5時測定的活性除以pH5,5時測定的活性，即將兩個吸收值相除(見下面)。為測量活性，將變體和參考的上清液在各自緩沖液中適當(dāng)稀釋(例如1:5000)。將75微升各自的酶溶液分配到微量滴定板孔例如NUNC269620中，并且添加75微升具有相應(yīng)pH的底物(通過分別在10ml0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.5以及10ml0.1M乙酸鹽緩沖液，pH3.5中溶解兩個5mg對硝基苯基磷酸片劑(Sigma,目錄號N-93S9)來制備底物)。將平板密封并溫育15分鐘，在37。C以750rpm搖動培養(yǎng)。在溫育期之后添加75微升終止試劑(水中的O.lM四硼酸二鈉水溶液)，并且在微量滴定板分光光度計中在405nm測量吸光度。肌醇六磷酸酶活性的測定將適當(dāng)稀釋(例如在0.25M乙酸鈉，0.005%(w/v)Tween-20.pH5.5中)的75微升含肌醇六磷酸酶的酶溶液分配到微來那個滴定才反孔例如NUNC269620中，并且添加75樣i升底物(通過在10ml0.25M乙酸鈉緩沖液，pH5.5中溶解100mg來自稻的肌醇六磷酸鈉(Aldrich目錄號274321)來制備)。將平板密封并溫育15分鐘，在37。C以750rpm搖動培養(yǎng)。溫育期之后添加75微升終止試劑(終止試劑通過混合IO1111鉬酸鹽溶液(10%(\￥)七-鉬酸銨于0.25%(w/v)氨溶液中)；10ml釩酸銨(0.24。/oBie&Bemtsen的商業(yè)產(chǎn)品，目錄號LAB17650)和21.7%(w/v)硝酸來制備)，在微量滴定板分光光度計上測量405nm的吸光度。肌醇六磷酸酶活性以FYT單位來表示，一個FYT是在上述條件下每分鐘釋放1微摩爾無機(jī)正磷酸根的酶量。通過參考從無機(jī)磷酸鹽的適當(dāng)稀釋液制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線或參考從已知活性的肌醇六磷酸酶制備物(這樣的具有已知活性的標(biāo)準(zhǔn)酶制備物可從NovozymesA/S,Krogshoejvej36，DK-2880Bagsvaerd索取獲得)的稀釋液制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線來獲得測量的肌醇六磷酸酶活性的絕對值。實施例2:表達(dá)宿主/糖基化對熱穩(wěn)定性的影響芽孢桿菌屬中的表達(dá)將SEQIDN0:2的肌醇六磷酸酶如實施例1所述在枯草芽孢桿菌中表達(dá)，并用常規(guī)方法純化離心，微生物過濾(germfiltration),硫酸銨沉淀(80%硫酸銨飽和溶液)，離心，在緩沖液A(50mM乙酸鈉，1.5M硫酸銨pH4.5)中重懸沉淀，過濾，疏水相互作用層析(hydrophobicinteractionchromatography)(PhenylToyopearl,用緩沖液A上樣，用緩沖液B(50mM乙酸鈉pH4.5)洗脫)和陽離子交換層析(SP-瓊脂糖，用10mM杼檬酸鈉pH4.0上樣，用線性鹽梯度(10mM檸檬酸鈉pH4.0+1MNaCl洗脫))。在畢赤酵母屬中的表達(dá)更進(jìn)一步，將SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)，j!口由Rodriguez等在ArchivesofBiochemistryandBiophysics,vol.382，no.1，2000,pp.105-112中概括描述的。從發(fā)酵培養(yǎng)液的上清中如下述純化肌醇六磷酸酶用硫酸銨(80%飽和溶液)沉淀，在10ml25mM乙酸鈉緩沖液pH4.5中再溶解，相對于相同緩沖液透析，并通過0.45mm濾器過濾。將150ml的這種溶液加至用相同緩沖液pH4.5平4軒的40mlSPSepharoseFF柱(Pharmacia),將蛋白用線性NaCl梯度(0-0.5M)洗脫。分析來自柱的級分的肌醇六磷酸酶活性。通過SDS-PAGE檢測具有肌醇六磷酸酶活性的級分，并匯集(pool)純的級分。通過^f吏用BCA試劑盒(Pierce)測量蛋白濃度。通過DSC測定的熱穩(wěn)定性對畢赤酵母屬和芽孢桿菌屬表達(dá)的SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶進(jìn)行通過差異掃描量熱法(DSC)的熱穩(wěn)定性的測量。樣品制備將樣品(體積小于3ml)在冷室中(約5攝氏度)相對于500ml的20mM乙酸鈉緩沖液pH4.0透析最少l小時。將樣品轉(zhuǎn)移至500ml新鮮的、冷的緩沖液制劑并透析過夜。將樣品用0.45微米注射器濾器過濾，用透析緩沖液將體積調(diào)節(jié)至約1.5ml，并記錄A28o(在280nm處的吸光度)。在DSC掃描中使用透析緩沖液作為參考。用真空抽吸并攪拌約1O分鐘為樣品排氣。在畢赤酵母屬表達(dá)的肌醇六磷酸酶的樣品制備期間(相對于20mM乙酸鈉(NaAc)pH4.0透析)形成了沉淀。將上清液用于第一個實驗。然后將純化的儲液的剩余部分相對于20mMNaAcpH4.0透析，這才羊使得在該批次中存在的一些低Mw雜質(zhì)沉淀下來。將這個批次用于第二個實驗，該實驗揭示了與第一個實驗非常相似的Tm(54對55。C)。DSC實驗應(yīng)用MicroCaFMVP-DSC設(shè)備的實驗設(shè)置掃描速率90K/h。掃描間隔20-90攝氏度。反饋模式無。過濾期(filteringperiod):16秒。樣品的酶濃度約為1-1.5mg/ml，如通過A28o和在280nm的理論計算消光系數(shù)(VectorNTI版本9.0.0)來估計的。熱解疊溫度(Td;thermalunfoldingtemperature)用MicroCalOrigin軟件(版本4.10)評估，并將變性溫度確定為熱解曲線的頂點溫度。結(jié)果在下面的表2中總結(jié)。表2宿主細(xì)胞緩沖液掃描率(。C/h)掃描間隔(°C)Td(。C)A280枯草芽孢桿菌20mMNaAcpH4.09020-90621,6巴斯德畢赤酵母20mMNaAcpH4.09020-90551.9表2清楚地顯示畢赤酵母屬表達(dá)的肌醇六磷酸酶比芽孢桿菌屬表達(dá)的肌醇六磷酸酶的熱穩(wěn)定性差得多。畢赤酵母屬表達(dá)的肌醇六磷酸酶具有重度糖基化，如使用質(zhì)譜法(Maldi-TOF)通過寬泛的分子量范圍所見的，而芽孢桿菌屬表達(dá)的肌醇六磷酸酶則沒有糖基化。實施例3:肌醇六磷酸酶變體R339D70制備具有取代R339D的SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶蛋白質(zhì)工程化變體，并在米曲霉中用本領(lǐng)域已知的方法表達(dá)。使用如實施例2所述的DSC測定它的變性溫度Td為62.5°C(20mM乙酸鈉，pH4.0)。此外，R339D取代用于去除與在曲霉屬中表達(dá)潛在相關(guān)的Kex2蛋白酶切割位點。實施例4:包含肌醇六磷酸酶變體的動物銅料和動物飼料添加劑動物銅津+添加劑將包含0.15g肌醇六磷酸酶酶蛋白的SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶變體R339D的配制物添加至下列預(yù)混物(每千克預(yù)混物)5000000正維生素A1000000IE維生素D313333mg維生素E1000mg維生素K3750mg維生素Bl2500mg維生素B21500mg維生素B67666meg維生素B1212333mg煙酸33333meg生物素300mg葉酸3000mgD-泛酸釣1666mgCu16666mgFe16666mgZn23333mgMn133mgCo66mgI66mgSe5.8%鈣25%鈉71動物飼料此為動物飼料(小雞飼料(broilerfeed))的實例，該飼料包含1.5mg/kg(1.5ppm)SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶變體R339D(以肌醇六磷酸酶酶蛋白來計算)62.55%玉米33.8%大豆粉(50。/4且蛋白,CP)1.0%大豆油0.2。/。DL-曱硫氨酸0.22。/。DCP(磷酸二4丐)0.76%CaCO3(碳酸4丐)0.32%沙0.15%NaCl(氯化鈉)1%上述預(yù)混物將各成分混合，并將飼料在期望的溫度(例如60，65，75,80，85,90或甚至95。C)制成顆粒。實施例5:溫度穩(wěn)定性的測定如實施例1的變化在下面表3中顯示)。具有SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的兩個參考肌醇六磷酸酶以相同方式制備。溫度穩(wěn)定性如下測定將變體和參考蛋白各自的200微升上清液分成兩部分，一部分在50°C在塑料容器中溫育，另一部分保存在5。C。在50。C溫育30分鐘后將蛋白溶液轉(zhuǎn)移到水浴。以1:100在0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.5中稀釋后，通過實施例1("磷酸酶活性的測定")中的磷酸酶測定法來測量冷卻的和加熱的樣品的活性，扣除緩沖液空白。結(jié)果在下面表3中顯示為分別在5。C和50。C溫育30分鐘后的酶活性(以吸收單位(AU)表示)，而殘余活性(RA)計算為以熱處理樣品(50。C溫育)的活性除以冷卻樣品(5。C溫育)的活性，以°/。表示。表3:具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性的肌醇六磷酸酶變體肌醇六磷酸酶50C(AU)50。C(AU)RA(%)SEQIDN0:20.2100.07033SEQIDNO:31.0520.0273SEQIDNO:2的N4P0.5130.31361SEQIDNO:2的G5P0.5760.28750SEQIDNO:2的Q111P1.0530.57755SEQIDNO:2的E1*0.9090.40144SEQIDNO:2的El*/E2*0.3220.15950SEQIDNO:2的El*/E2*/Q3*0.1010.05151SEQIDNO:2的M273L1.5990.89756SEQIDNO:2的N286Q0.0620.02439實施例6:在體外模型中的在動物飼料中的性能將肌醇六磷酸酶變體在動物飼料中的性能在體外模型中與參考蛋白的性能進(jìn)行比較，所述參考蛋白如SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4和/或SEQIDNO:6。體外模型模擬單胃動物的胃腸條件并與體內(nèi)動物試驗所獲得的結(jié)果充分關(guān)聯(lián)。比較按如下進(jìn)行變體樣品中的肌醇六磷酸酶活性如實施例l"肌醇六磷酸酶活性的測定"中所述來測定。然后制備由30%大豆粉和70%玉米粉所組成的飼料樣品，添加CaCl2至濃度為每千克飼料5g鈣，并在40。C和pH3.0預(yù)溫育30分鐘，接下來添加胃蛋白酶(3000U/g飼料)和適當(dāng)劑量的肌醇六磷酸酶(對于所有要檢測的肌醇六磷酸酶應(yīng)用同一劑量以便比較)，例如0.25至0.75肌醇六磷酸酶單位FYT/g飼料。還包括無肌醇六磷酸酶活性的空白作為參考。其后將樣品在40。C和pH3.0溫育60分鐘，然后在pH4.0溫育30分鐘。通過添加HC1至終濃度0.5M并在40。C溫育2小時，接著進(jìn)行一個凍融循環(huán)和40。C溫育1小時，由此將反應(yīng)終止并提取月幾醇六磷酸和磷酸肌醇。通過高效離子層析如Chen等在JournalofChromatographyA(2003)vol.1018,pp.41-52中所述將肌醇六磷酸和磷酸肌醇分離，并如Skoglund等在J.Agric.FoodChem.(1997),vol.45,pp.431-436中所述進(jìn)行定量。然后將釋放的磷計算為肌醇六磷酸酶處理的和未處理的樣品之間磷酸肌醇結(jié)合的磷(IP-P)的差異。將變體的相對性能計算為相對于對照肌醇六磷73酸酶釋放的磷的百分比。如上所述以125FYT/kg飼料的劑量測定SEQIDNO:2的多個肌醇六磷酸酶變體的體外性能。上清液和純化的肌醇六磷酸酶的結(jié)果分別在下面表4A和4B中顯示。殘余的IP6-P指在體外溫育之后剩余的IP6-P(肌醇六磷酸磷)的量，以mg/gDM(干物質(zhì))表示。將降解的IP6-P測定為空白的殘余IP6-P和各個樣品的殘余IP6-P之間的差異。最后，在最后一列，相對于具有SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶表示降解的IP6-P。在表4A中空白和參考(SEQIDNO:2)值是多個獨立測定的均值，而其他值基于單次測定。在表4B中空白值是多個獨立測定的均值，而其他值基于單次測定。表4A.肌醇六磷酸酶變體上清液的體外性能變體號/(相較于殘余的降解的降解的SEQIDNO:2的修改)IP6-PIP6-PIP6-Pmg/gDMmg/gDM(%)空白2.462026(SEQIDNO:3)0.1062.35699000(SEQIDNO:2)0.0712.391100008(G52C/A99C)0.3872.07587009(G59C/F100C)0.2722.19092010(K141C/V199C)0.2072.25594015(N4P)0.0642.387100016(G5P)0.0992,35198018(Q111P)0.1002.35098020(T137P)0.3702.09287021(L154P)0.3822細(xì)87022(S161P)0.2352.22793023CK240P)0.5811.88179024(T355P)0.7441.71872028(G52E)0.7161.74673030(E57Y)0.6661.79675032(A84Y)0.6671.79575034(L104A)0.7091.75373035(A105E)0.553l細(xì)80036(K107D)0.7671.69571037(K107G)0.4502.01284<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>變體015，016，018,040,041，042,044和050看上去具有與SEQIDNO:2和3的肌醇六磷酸酶相比至少是一樣好的或更好的體外性能。表4B:純化的肌醇六磷酸酶變體的體外性能<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>0.5861.826114091(E218Q)1.2641.14872095(D314N)0馬1.716107098(E406A)0.5151.897119125(Yl14T/Q115Q/K116A/D117D/E118T/E119S/-K120S/N121P/D122D/P123P/L124L)0.7531.658104127(Yl14T/Q115Q/K116T/D117D/E118T/E119S/-K120S/N121P/D122D/P123P/L124L)0.8611.55097變體030,031,037，056，072，085,087,089,090,095，098和125在體外的表現(xiàn)看起來至少與SEQIDNO:3的月幾醇六磷酸酶一樣好。實施例7:比活性基于相對于250mM乙酸鈉，pH5.5透析的高度純化的樣品來測定肌醇六磷酸酶變體的比活性。預(yù)先在SDS聚丙烯酰胺凝膠上檢測純度，顯示只存在一個組分。蛋白濃度通過如下氨基酸分析來測定將樣品的等分試樣在抽空的玻璃管中在6NHC1，0.1%苯酚中在110°C水解16小時。用AppliedBiosystems420A氨基酸分析系統(tǒng)按照制造商的說明書操作來定量所得的氨基酸。從氨基酸的量，能夠計算在水解的等分試樣中的蛋白的總質(zhì)量和濃度。如實施例1("肌醇六磷酸酶活性的測定，，)中所述以FYT單位來測定肌醇六磷酸酶活性，而將比活性計算為肌醇六磷酸酶活性，所述肌醇六磷酸酶活性以FYT單位每mg肌醇六磷酸酶變體酶蛋白來測量。SEQIDNO:2和變體072(SEQIDNO:2的1362R)的肌醇六磷酸酶的比活性如上述測定。變體072的比活性是SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶比活性的86%。不確定性(標(biāo)準(zhǔn)差)估計約為10%,主要是由于肌醇六磷酸酶活性測定法基于復(fù)雜的底物。實施例8:溫度穩(wěn)定性如實施例1中所述制備SEQIDNO:2的多個變體，并將枯草芽孢桿菌宿主菌株在500ml搖瓶中的100mlPS1培養(yǎng)基(100g/L蔗糖，40g/L大豆薄片，7610g/LNa2HP04.12H20,O.lml/LDowfax63N10(Dow》中在30。C以300rpm培養(yǎng)四天。兩個參考肌醇六磷酸酶以相同方式制備，即具有SEQIDNO:3的肌醇六SEQIDNO:4的肌醇六磷酸酶(相應(yīng)于SEQIDNO:2的變體N31D/N121T/K132T/Q139K)。還包括具有SEQIDNO:9的肌醇六磷酸酶進(jìn)行對比(相應(yīng)于SEQIDNO:2的變體Q3P/N31D/N121T/K132T/Q139K)。變體的和參考肌醇六磷酸酶的溫度穩(wěn)定性如下確定通過添加20ulG效升)上清液至180ul0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.5+0.005%Tween-20來將上清液稀釋十倍。將稀釋的酶分成兩部分，一部分在60。C在塑料容器中溫育，另一部分保存在5。C。在60。C溫育30分鐘之后將蛋白溶液轉(zhuǎn)移至冰浴。在0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.5和0.005%Tween-20中以1:10稀釋后，通過實施例1中(磷酸酶活性的確定)的磷酸酶測定法測量冷卻的和加熱的樣品的活性，扣除緩沖液空白。表5是與參考肌醇六磷酸酶相比具有改進(jìn)的溫度穩(wěn)定性的變體列表。對于每個變體，該表還描述了與SEQIDNO:2相比的變化。分別測定了在5。C和60。C溫育30分鐘后的酶活性(以吸收單位(AU)表示)，并且將殘余活性(RA)計算為以熱處理樣品(60。C溫育)的活性除以冷卻樣品(5。C溫育)的活性來。接下來，將殘余活性的結(jié)果相對于以相同方式表達(dá)和處理的SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶的殘余活性標(biāo)準(zhǔn)化。得出的改進(jìn)因子(IF)在表5中顯示。對于SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶，IF是1.0，而SEQIDNO:3和4的兩個參考肌醇六磷酸酶與SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶相比則熱穩(wěn)定性較差，這從這兩個肌醇六磷酸酶的IF分別僅為0.1和0.3的事實中是顯而易見的。表5:具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性的肌醇六磷酸酶變體No.突變IF026N31D/Q139K/L197F/N316K(SEQIDNO:3)0.1101Q3P/N31D/N121T/K132T/Q139K(SEQIDNO:9的氨基酸23-433)0.3102N31D/N121T/K132T/Q139K(SEQIDNO:4)0.3078V409E0.3019N136P0.3082E411K0.4058E331K/V55D0.4086E167Q0.4110Kl79K/T180T/T181D/E182K/K183L/S184*/Tl85*/Kl86*0.4059K107E0.4087E196Q0.5070T276R0.5048E285G0.5053I299L0.5089T200K0.5065E119R0.6085N121D0.6036K107D0.6107Kl79K/T180E/T181K/E182H/K183Q/S184*/Tl85*/Kl86*0.6095D314N0.7022S161P0.7079T410D0.7004K141C0.7108Kl79K/T180E/T181K/E182Q/K183Q/S184*/Tl85VK186*0.7094E285N0.7068R164E0.8081E411R0.8002G52C0.8020T137P0.8096D314G0.8120E1K0.9042El*/E2*/Q3*0,9043N121T0.9098E406A0.9063Q82E0.9038Q109A0.9000SEQIDN0:21.0016G5P1.0030E57Y1.0074I379R1.0041El*/E2*1.0080T410E1.1040E1*1.2066E119K1.2<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>實施例9:根據(jù)DSC的熱穩(wěn)定性如實施例1中概括所述制備SEQIDNO:2的多個純化變體。以相同方式制備兩個參考肌醇六磷酸酶，即具有SEQIDNO:3的肌醇六磷酸酶(相應(yīng)于SEQIDNO:2的變體N31D/Q139K/L197F/N316K)，和具有SEQIDNO:4的包括具有SEQIDNO:9的肌醇六磷酸酶用于比較(相應(yīng)于SEQIDNO:2的變體Q3P/N31D鹿21T/K132T/Q139K)。將蛋白樣品的等分試樣相對于2x500ml20mM乙酸鈉pH4.0在4°C在2-3小時的步驟中透析，接著透析過夜。每個樣品經(jīng)0.45um過濾并用緩沖液稀釋至約2個A，單位。測得的確切吸收值在結(jié)果表中給出。在MicroCalVP-DSC上進(jìn)行DSC,在20mM乙酸鈉緩沖液,pH4.0中，在20-90。C范圍內(nèi)以90°C/h掃描速率進(jìn)行。得到的變性溫度(Td)在下面表6中顯示，總結(jié)了三個不同實驗的結(jié)果。表6:通過DSC的Td測量<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>實施例10:純化和溫度曲線本文所用的肌醇六磷酸酶變體和參考和比較性的肌醇六磷酸酶如下進(jìn)行純化含有肌醇六磷酸酶的發(fā)酵上清液先以7200rpm和5°C離心一小時，然后經(jīng)四層Whatman玻璃微纖維濾紙(2.7,1.6,1.2和0.7微米)的多層裝置(sandwich)過濾。接著將溶液進(jìn)行無菌過濾(或者經(jīng)過帶有0.22(im截留值(cut-off)的快速PES瓶頂部濾器(FastPESBottletopfilter),或者利用壓力經(jīng)過Seitz-EKS深度濾器(Seitz-EKSdepthfilter))。向溶液中添加固態(tài)硫酸銨，得到終濃度1.5M,用6MHC1將pH調(diào)節(jié)至6.0。將含肌醇六磷酸酶的溶液加到丁基-瓊脂糖柱上，在XK26柱中約50ml，使用25mMbis-tris(二-(2-輕乙基)亞氨基-三(羥曱基)甲烷(Bis-(2-hydroxyethyl)imino-tris(hydroxymethyl)methan))+1.5M疏酸鎮(zhèn)pH6.0作為緩沖液A,使用25mMbis-trispH6.0作為緩沖液B。使用磷酸酶測定法(參見實施例1，"磷酸酶活性的測定，，)分析來自柱子的級分的活性，并匯集具有活性的級分。將匯集的級分相對于10mM乙酸鈉pH4.5充分(extensively)透析。接著，將含肌醇六磷酸酶的溶液在S瓊脂糖上通過層析純化，約75ml于XK26柱中，用50mM乙酸鈉pH4.5作為緩沖液A,和50mM乙酸鈉+1MNaClpH4.5作為緩沖液B。同樣，分析來自柱子的級分的活性并且匯集有活性的級分。最后，用帶有10kDa截留值的膜的Amiconultra-15過濾裝置將含有純化的肌醇六磷酸酶的溶液濃縮。在所有情況下，所有肌醇六磷酸酶的分子量(如由SDS-PAGE估計的)為約40kDa,且純度大于95%。變體的溫度曲線(肌醇六磷酸酶活性作為溫度的函數(shù))基本上如實施例1所述("肌醇六磷酸酶活性的測定")在20-90°C的溫度范圍確定，然而，酶反應(yīng)(100微升含肌醇六磷酸酶的酶溶液+100樣l升底物)不在微量滴定板上而在PCR管內(nèi)進(jìn)行。在預(yù)期溫度的15分鐘反應(yīng)期結(jié)束后，將管冷卻至20。C持續(xù)20秒，將150微升反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到微量滴定板上。添加75微升終止試劑并在微量滴定板分光光度計中測量在405nm的吸光度。結(jié)果在下面表7中總結(jié)。對于每個溫度(20-90。C,以10。C為一級)給出的數(shù)字是相對于最優(yōu)值標(biāo)準(zhǔn)化的相對活性(以％表示)。表7:溫度曲線No.肌醇六磷酸酶40溫jWe)70809020305060026SEQIDNO:31832527410044-l102SEQIDN0:42237557910017104000SEQIDNO:22034546810021115SEQIDNO:9的氨基酸10123-43316285065100126-l81018SEQIDN0:2的Q111P2034537510017104030SEQIDNO:2的E57Y21355779訓(xùn)28104031SEQIDNO:2的T76G2034557710023104037SEQIDNO:2的K07G2134557710032114041SEQIDNO:2的El*/E2*213456781001594044SEQIDNO:2的M273L21355679100269050SEQIDNO:2的N286Q163244841006-1-7056SEQIDNO:2的I362K203554781002593062SEQIDNO:2的W46E274265841001812072SEQIDNO:2的I362R213556791002311083SEQIDNO:2的E53V203253761002210093SEQIDNO:2的E241Q2237598310020103變體030,031，037，044，056,062，072,083和093存70。C時與參考肌醇六磷酸酶026和102相比具有較高的相對活性。實施例11:pH曲線在前面實施例中用到的多個變體及相同參考以及比較性的肌醇六磷酸酶的pH曲線(肌醇六磷酸酶活性作為pH的函數(shù))在37°C在2.0至7.5的pH范圍(以0.5個pH單位為一級)如實施例1所述("肌醇六磷酸酶活性的測定")來確定，只是使用緩沖液混合液(cocktail)(50mM甘氨酸，50mM乙酸和50mMBis-Tris)取代了0.25M乙酸鈉pH5.5緩沖液。結(jié)果在下面表8中總結(jié)。對于每個pH(2.0-7.5)給出的數(shù)字是相對于最優(yōu)值標(biāo)準(zhǔn)化的相對活性(以％表示)。表8:pH曲線No.肌醇六磷酸酶pH2.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5026SEQIDNO:3306287991009584654014-1-2102SEQIDNO:42665879710093826643170-4000SEQIDNO:2336089100999580613511-2-4101SEQIDNO:9的氨基酸23-43337658797100938065421920018SEQIDN0:2的Q111P276189971009075573210-2-4030SEQIDNO:2的E57Y3560869710092796036131一3031SEQIDNO:2的T76G3460869910093796236121-1037SEQIDNO:2的K107G335987100999378603410-2-4041SEQIDN0:2的E1"E2承296289100100937959341221044SEQIDNO:2的M273L3163871009994816236120-l82<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>對YC062和YC091,pH曲線(相對活性作為pH的函數(shù))，看起來向較高pH偏移了0.5pH單位。進(jìn)而，當(dāng)對于表8的肌醇六磷酸酶(包括參考肌醇六磷酸酶026和102)的多數(shù)而言最優(yōu)值在pH3.5-pH4.0時，觀察到對于編號062,085和O89的最適pH為3.5，)見察到對于編號091和093的最適pH為4.0。實施例12:溫度穩(wěn)定性通過在70。C和pH4.0(0.1M乙酸鈉)溫育后測量殘余肌醇六磷酸酶的活性來測定如前面實施例中的多個純化的變體和相同的參考以及比較性的肌醇六磷酸酶的溫度穩(wěn)定性。將肌醇六磷酸酶溫育，樣品在0,10，30和60分鐘后撤出并在水上冷卻。使用實施例1中所述("肌醇六磷酸酶活性的測定")的方法來測定pH5.5的殘余活性。將結(jié)果相對于在0分鐘時的活性標(biāo)準(zhǔn)化，在下面表9中顯示。表9:溫度穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>上面結(jié)果顯示編號044，062,072和083在這些條件下(70。C和pH4)可能比參考肌醇六磷酸酶更穩(wěn)定(盡管在此實驗中對于編號000觀察到有大的偏差)。實施例13:計算同一性百分比和鑒定相應(yīng)位置用EMBOSS軟件包2.8.0版本的Needle程序?qū)EQIDNO:9與SEQIDNO:2比對。所用的取代矩陣為BLOSUM62,缺口開啟罰分為10.0，缺口延伸罰分為0.5。得到的比對結(jié)果在圖2中表示。SEQIDNO:9和SEQIDNO:2之間的同一性程度如下計算精確匹配的數(shù)目是406(所有這些用垂直劃(verticalstroke)表示)。最短序列的長度是411(SEQIDNO:2)。同一性的百分比是406/411x100%=98.8%。也將圖2的比對結(jié)果用于推導(dǎo)相應(yīng)的位置，如下在該比對中互在頂部的氨基酸處于相應(yīng)的位置。例如在SEQIDNO:2位置3上的氨基酸Q對應(yīng)84于SEQIDNO:9位置號25的氨基酸P。就本發(fā)明而言，我們采用SEQIDNO:2的位置號。因此，可以將SEQIDNO:9考慮為包含取代Q3P的SEQIDNO:2的變體。在比對結(jié)果的重疊部分內(nèi)以取代形式存在的其它差異處于位置31，121，132和139，即N31D，N121T，K132T和Q139K。此外的差異存在于N-末端，在N-末端與SEQIDNO:2相比SEQIDNO:9具有22個氨基酸的延伸。因此總體上，可以將SEQIDNO:9考慮為以下SEQIDNO:2的變體*0aM/*0bS/*0cT/*0dF/*0eI/*0fI/*0gR/*0hL/*0iL/*0jF/*0kF/*0mS/*0nL/*0oL/*0pC/*0qG/*0rS/*0sF/*0tS/*0uI/*0vH/*0wA/Q3P/N31D/N121T/K132T/Q139K。權(quán)利要求1.肌醇六磷酸酶，其與SEQIDNO2具有至少74％同一性并與SEQIDNO2相比在選自下組中的至少一個位置包含至少一個變化1，2，3，4，5，31，41，46，52，53，55，57，59，74，76，82，84，91，99，100，104，105，107，109，111，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，136，137，141，154，161，162，164，167，171，176，177，179，180，181，182，183，184，185，186，196，199，200，202，203，218，223，239，240，241，247，273，276，281，282，283，284，285，286，289，294，299，308，314，316，324，331，339，351，355，362，379，385，406，409，410和411；條件是該肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO3，不是SEQIDNO4，并且不是SEQIDNO6。2.權(quán)利要求l的肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO:9和其圖l中列出的變體。3.權(quán)利要求1和2中任意一項的肌醇六磷酸酶，其包含至少一個下列變化1*,2*,3*，4P，5P，31C,T,41P,46C，D,E，52C,E,53V，Q，55D,I，57Y,59C，74A,76G,82E，84Y,91C,P,99C,100C，104A，105F，107D,E，G,109A,G,111P，114H，N,T,115Q,116A，E，P，T，Q,117D，E，K，1181,L，M，T,119G,K，R,S，120K，S,T，Q，121A,D,M,P,T,V,122D,123P,S，124L，T，V，136P，137P，141C,154P，161P，162C，164D，E，167Q，171T，176C，177C,179GI，K,N,Q，180A,E，G,T，181D，QI,K,182H，K，S，Q,183A,L,P，S，V，Q，184*,185*，186*，196Q，199C，200K,R，202N,203T，218Q,223E，239Q,240P，241Q,247C，273L，Q,276K,R，281H，282P,283P，284P，285G,N,R，286K,Q,289P,294T，299L，308A,314GN，316D，324N,331K，339D，351Y,355P,362K,R,379K,R，385D,楊A(yù),409D,E，410D，E和/或411R,K。4.權(quán)利要求3的肌醇六磷酸酶，其中位置179,180，181,182，183,184,185和186的氨基酸已被QADKP，GEDKP,NGISA，IAGKS,KEKHQ,KEKQQ,KEKKV或KTDKL取代。5.肌醇六磷酸酶，其與SEQIDNO:2具有至少74%同一性并包含至少一個下列變化1H,K,R,60P,105E，106A，G，155F，157F，173P,175L,188P，205P，215M，231P，254Y，280P,330D和/或371P;條件是該肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO:3，不是SEQIDNO:4，不是SEQIDNO:6，且不是SEQIDNO:9及其在圖1中列出的變體。6.權(quán)利要求1-4中任一項的肌醇六磷酸酶，其包含選自如下變化52C，141C，162C，31C,52C,99C,59C,100C,141C/199C，4P，5P，111P,137P,161P，52E，57Y，76G,107D，107G，109A，1*，1*/2*，1*/2*/3*,121T，273L,285G，286Q，299L，362K，331K/55D，107E，46E,82E，119R,119K，164E,223E，276R,276K,362R，379R,379K,385D,410D,410E，411R，411K,53V,121D，167Q,196Q，200K,202N，218Q,241Q，285N,314N,314G,楊A(yù)，179K/180E/18歸82H/183Q/184*/185*/186*，179K/180E/181K/182Q/183Q/184*/185*/186*，179K/180E/18IK/182K/183V/l84*/185*/186*，179K/180T/181D/182K/183L/184*/185*/186*，111P/241Q，1K,7.權(quán)利要求1-6中任一項的肌醇六磷酸酶，其為SEQIDNO:2的肌醇六脧酶的變體(8.權(quán)利要求1-6中任一項的肌醇六磷酸酵，其為SEQIDNO:3的肌醇六^^酸酶的變體。9.權(quán)利要求1-6中任一項的肌醇六磷酸酶，其為SEQIDNO:4的肌醇六磷酸酶的變體。10.權(quán)利要求1-6中任一項的肌醇六磷酸酶，其為SEQIDNO:6的肌醇六磷酸酶的變體。11.權(quán)利要求1-6中任一項的肌醇六磷酸酶，其為SEQIDNO:9的肌醇六磷酸酶的變體。12.權(quán)利要求1-6中任一項的肌醇六磷酸酶，其為與SEQIDNO:9相關(guān)的并在圖1中列出的肌醇六磷酸酶變體的任何一個的變體。13.權(quán)利要求1-12中任一項的肌醇六磷酸酶，其還包含選自在圖1的每行中列出的取代和取代組合中的取代或取代組合。14.權(quán)利要求1-13中任一項的肌醇六磷酸酶，其具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性，改進(jìn)的pH曲線，改進(jìn)的比活性，修改的糖基化模式，改進(jìn)的溫度曲線，在動物飼料中改進(jìn)的性能和/或其摻入潛在的蛋白酶切割位點的變化。15.分離的核酸序列，其包含編碼權(quán)利要求1-14中任一項的肌醇六磷酸酶的核酸序列。16.核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求15的核酸序列，所述核酸序列可操作地連接于一個或多個指導(dǎo)肌醇六磷酸酶在合適的表達(dá)宿主中產(chǎn)生的調(diào)控序列。17.包含權(quán)利要求16的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。18.包含權(quán)利要求16的核酸構(gòu)建體和/或權(quán)利要求17的表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞。19.產(chǎn)生權(quán)利要求1-14中任一項的肌醇六磷酸酶的方法，其包括(a)培養(yǎng)權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞以產(chǎn)生包含所述肌醇六磷酸酶的上清液；和(b)回收所述力幾醇六磷酸酶。20.—種轉(zhuǎn)基因植物或植物部分，其能夠表達(dá)權(quán)利要求1-14中任一項的肌醇六磷酸酶。21.能夠表達(dá)權(quán)利要求1-14中任一項的肌醇六磷酸酶的轉(zhuǎn)基因非人動物，或其組成部分或產(chǎn)物。22.組合物，其包含權(quán)利要求1-14中任一項的至少一種肌醇六磷酸酶，和(a)至少一種脂溶性維生素；(b)至少一種水溶性維生素；和/或(c)至少一種痕量礦物質(zhì)。23.權(quán)利要求22的組合物，其進(jìn)一步包含至少一種選自下組的酶淀粉酶，肌醇六磷酸酶，磷酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶，a-半乳糖苷酶，蛋白酶，磷脂酶和/或(3-葡聚糖酶。24.權(quán)利要求22-23中任一項的組合物，其為動物飼料添加劑。25.動物詞料組合物，其具有50至800g/kg的粗蛋白質(zhì)含量并且包含權(quán)利要求1_14中任一項的肌醇六磷酸酶或權(quán)利要求22-24中任一項的組合物。26.用于改進(jìn)動物飼料的營養(yǎng)值的方法，其中將權(quán)利要求1-14中任一項的肌醇六磷酸酶或權(quán)利要求22-24中任一項的組合物添加至飼料。27.降低動物糞便中肌醇六磷酸鹽水平的方法，其包括用有效量的權(quán)利要求25的詞料喂養(yǎng)動物。28.處理植物蛋白質(zhì)的方法，其包括將權(quán)利要求1-14中任一項的肌醇六磷酸酶或權(quán)利要求22-24中任一項的組合物添加到至少一種植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)源的步驟。29.權(quán)利要求1-14中任一項的肌醇六磷酸酶或權(quán)利要求22-24中任一項的組合物的用于如下的用途在動物飼料中；在動物祠料的制備中；用于改進(jìn)動物祠料的營養(yǎng)值；用于降低動物糞便中的肌醇六磷酸鹽水平；用于處理植物蛋白質(zhì)；或用于從肌醇六磷酸酶底物中釋放含亞磷的物質(zhì)。全文摘要本發(fā)明涉及與源自布氏檸檬酸菌(Citrobacterbraakii)的肌醇六磷酸酶具有至少74％同一性并與該肌醇六磷酸酶相比包含至少一個變化的肌醇六磷酸酶。這些肌醇六磷酸酶變體具有經(jīng)過修改，優(yōu)選改進(jìn)的特性，如熱穩(wěn)定性、溫度曲線、pH曲線、比活性、在動物飼料中的性能，降低的蛋白酶敏感性，和/或修改的糖基化模式。本發(fā)明還涉及編碼這些肌醇六磷酸酶的DNA，它們的制備方法，以及它們的用途，例如在動物飼料方面和動物飼料添加劑中的用途。文檔編號C12N9/16GK101460612SQ200780020771公開日2009年6月17日申請日期2007年3月19日優(yōu)先權(quán)日2006年4月4日發(fā)明者倫納多·德瑪利亞,卡斯滕·安德森,拉斯·K·斯科夫,邁克爾·B·索倫森申請人:諾維信公司