專利名稱：鴨病毒性肝炎二價(jià)精制卵黃抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 涉及一種用于預(yù)防由I型和新型鴨病毒性肝炎二價(jià)精制卵黃抗體的制備方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鴨病毒性肝炎(duckviral hepatitis, DVH)是由鴨肝炎病毒(duck hepatitisvirus，DHV)引起雛鴨的一種以肝臟為主要病理變化的急性、高度致死性、接觸性傳染病。臨床表現(xiàn)痙攣、抽搐和角弓反張等神經(jīng)癥狀，以肝臟腫脹和出血為特征性病變。I 3周齡的雛鴨易感，發(fā)病嚴(yán)重，傳播迅速，雛鴨通常出現(xiàn)癥狀后的I小時(shí)內(nèi)死亡，10日齡雛鴨感染后死亡率90 95%，已經(jīng)成為嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一。鴨肝炎病毒(DHV)血清型DHV有4個(gè)獨(dú)立的血清型，I型、2型、3型和新型。范書才等(范書才，李虹，袁率珍等.新型鴨肝炎病毒的分離鑒定.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，10)通過試驗(yàn)證明目前在我國同時(shí)存在I型和新型DHV流行。血清中和試驗(yàn)表明，I型和新型之間缺乏交叉保護(hù)作用。在4個(gè)型的DHV中，I型與新型DHV流行最廣泛，毒力最強(qiáng)；對(duì)3周齡內(nèi)的雛鴨致死率可在80%以上。2型DHV僅在英國，3型僅在美國有報(bào)道；二者均呈散發(fā)性流行，致死率低(約20%)。目前國內(nèi)、外尚無商品化的二價(jià)卵黃抗體，由于I型和新型之間無交叉保護(hù)作用，I型卵黃抗體很難對(duì)流行的新型鴨肝炎病毒進(jìn)行預(yù)防，因此研制I型和新型二價(jià)卵黃抗體是預(yù)防和控制鴨病毒性肝炎的必然要求，針對(duì)此要求我們研制了鴨病毒性肝炎I型和新型二價(jià)精制卵黃抗體。卵黃抗體是指從免疫禽蛋中提取出的針對(duì)特定抗原的抗體，由于卵黃中僅有IgG類抗體，故稱其為卵黃免疫球蛋白IgG(egg yolkimmunoglobulins),簡稱為IgY。卵黃抗體的研究始于19世紀(jì)末，1893年，Klemperer發(fā)現(xiàn)了卵黃中富含抗體；1934年Jukes的實(shí)驗(yàn)證明母雞血清中的抗體可以轉(zhuǎn)移到卵黃中，從而為雛雞提供被動(dòng)免疫保護(hù)。Patters等的試驗(yàn)證實(shí)，相對(duì)別的血衆(zhòng)蛋白，IgG被選擇性的轉(zhuǎn)運(yùn)到卵泡中。1969年，Leslie和Clem將這種抗體命名為IgY。卵黃抗體的形成過程是當(dāng)機(jī)體受到外界特異性抗原(尤其是滅活抗原)的刺激后誘發(fā)一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)，激發(fā)B細(xì)胞分化成能分泌特異性抗體的漿細(xì)胞，分泌大量的特異性抗體進(jìn)入血液中。同時(shí)在產(chǎn)蛋禽體內(nèi)，血液中的特異性抗體IgG(所有亞群)由卵巢IgG受體的介導(dǎo)逐步進(jìn)入到卵巢濾泡和輸卵管中，并在卵黃中蓄積起來，也正是由于這種卵黃累積作用，使卵黃中的IgG明顯地高于血清中的含量，而血清中的其他抗體(主要是IgM, IgA)與輸卵管中的卵白白蛋白一起混入到雞蛋白中。卵黃抗體在多種環(huán)境中有較高的穩(wěn)定性，在低于75°C條件下，卵黃抗體具有良好的熱穩(wěn)定性，90°C處理15min后，大部分卵黃抗體喪失結(jié)合活性，在pH < 4時(shí)，僅有少量卵黃抗體失去活性。在PH4-12范圍內(nèi)，卵黃抗體的活性幾乎不受影響，在pH > 12時(shí)，卵黃抗體迅速失去結(jié)合活性。實(shí)驗(yàn)表明，卵黃抗體具有耐受反復(fù)凍融的特性，即使經(jīng)過5次凍融，其抗原結(jié)合活性幾乎不受影響。在室溫下可保存6個(gè)月，4°C保存可達(dá)5年以上，活性僅下降5%左右。由于具有這些穩(wěn)定的理化性質(zhì)，所以其的開發(fā)應(yīng)用備受人們所關(guān)注。對(duì)于鴨病毒性肝炎的預(yù)防和治療，目前除了加強(qiáng)消毒和疫苗免疫外，抗體免疫也在控制該病的流行中發(fā)揮著重要作用。由于卵黃抗體成本比較低且比較容易獲得，所以已廣泛使用于一些疾病的預(yù)防和治療。但由于卵黃中含有大量的脂質(zhì)，給使用帶來許多不便，所以人們采取各種辦法從卵黃中提取分離IgY。常用的方法有聚乙二醇、硫酸葡聚糖、有機(jī)溶劑、水稀釋法、辛酸法等。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了鴨病毒性肝炎二價(jià)精制卵黃抗的研制工作。研制結(jié)果表明，我們研制的卵黃抗體效價(jià)高，安全性好，保護(hù)率高，為預(yù)防鴨病毒性肝炎病奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是制備I型和新型鴨肝炎病毒性的兩種抗原，并進(jìn)行合理配制成鴨病毒性肝炎I型和新型二價(jià)油乳劑滅活疫苗，用此疫苗接種產(chǎn)蛋雞，收獲高免雞蛋，分離蛋黃，滅活、萃提精制而成，可同時(shí)預(yù)防由I型和新型鴨肝炎病毒引起的雛鴨病毒性肝炎，此 卵黃具有抗體效價(jià)高、保護(hù)率高、安全性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所涉及的卵黃抗體含有抗鴨肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株的抗體，可同時(shí)預(yù)防由I型和新型鴨肝炎病毒引起的雛鴨病毒性肝炎。該卵黃抗體的主要相關(guān)內(nèi)容和所采用的技術(shù)手段(I)選育的新毒株要經(jīng)過血清學(xué)、分子生物學(xué)等試驗(yàn)進(jìn)行大量的臨床病料分析鑒定工作，最后選出效價(jià)高、免疫原性好制苗用毒株——鴨肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株。(2)在卵抗的生產(chǎn)過程中用超濾濃縮柱將卵抗經(jīng)過超濾濃縮，使卵抗的效價(jià)高，保護(hù)率高。(3)制備鴨病毒性肝炎二價(jià)精制卵黃抗體主要步驟為①用鴨肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株作為疫苗生產(chǎn)毒株，制成鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗。②將制備的二價(jià)滅活疫苗注射免疫產(chǎn)蛋雞，制備高免蛋。③將收集的高免蛋收集卵黃用酸化水-辛酸的方法萃提、滅活。本發(fā)明詳細(xì)描述一、生產(chǎn)用毒株制苗免疫原用鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus) I型YBHl株和新型YBHX株，均由青島易邦生物公程有限公司分離、鑒定、保管和供應(yīng)。國內(nèi)分離株I型YBHl株和新型YBHX株(兩型毒株均是2008年從山東省某鴨場病死鴨的肝臟中分離)，已于2012年08月15日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC No. 6441、CGMCC No. 6442。二、疫苗(免疫原)的制備I.制苗用病毒液的制備(I)YBHl株病毒液制備將生產(chǎn)用毒種YBHl株作100倍稀釋，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每胚O. 2ml，36 37°C孵育，每日2次照胚檢查。接種后48 120小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，置2 8°C放置4 12小時(shí)后，收取尿囊液、羊水及胚體，胚體去掉頭和四肢。用胚液勻漿后、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無菌容器中，置2 8°C保存。(2)YBHX株病毒液制備將生產(chǎn)用毒種YBHX株100倍稀釋，尿囊腔接種12 13日齡易感鴨胚，每胚O. 2ml，36 37°C孵育，每日2次照胚檢查。接種后48 120小時(shí)內(nèi)死亡的鴨胚，置2 8°C 4 12小時(shí)，收取尿囊液、羊水及胚體(去掉頭和四肢)。用胚液勻漿、凍融3次，4000r/min離心30min,取上清混合于無菌容器中，置2 8°C保存。2.濃縮將收獲的YBH l株和YBHX株病毒液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機(jī)分別濃縮至原體積的1/3，按現(xiàn)行《中國獸藥典》(中國獸藥典委員會(huì).中國人民共和國獸藥典二〇一〇年版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2011，本發(fā)明以下簡稱“現(xiàn)行《中國獸藥典》”)規(guī)定進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長，并留樣備測毒價(jià)。每O. 2ml病毒含量均應(yīng)不低于IO6 3ELD5tlt5濃縮后的胚液隨即進(jìn)行滅活。3.滅活分別將濃縮后的YBHl株與YBHX株病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計(jì)量加入10%甲醛溶液，開啟攪拌機(jī)攪拌，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為O. 2%。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°C滅活16小時(shí)(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開始計(jì)時(shí))后取出，置2 8°C保存，應(yīng)不超過3個(gè)月。4.鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗半成品檢驗(yàn)(I)無菌檢驗(yàn)取滅活的濃縮胚液，按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。(2)病毒含量測定濃縮后YBHl株病毒含量測定將濃縮后的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ、個(gè)稀釋度，分別尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚O. 2ml。同時(shí)設(shè)接種生理鹽水對(duì)照5枚，每胚O. 2ml。置36 37 °C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察168小時(shí)。以雞胚死亡并出現(xiàn)尿囊膜水腫增厚，頭、頸、背部等全身出血性病變判為感染，計(jì)算 ELD50。濃縮后YBHX株病毒含量測定將濃縮后的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10_4、10_5、10_6、10_74個(gè)稀釋度，分別尿囊腔接種12 13日齡易感鴨胚5枚，每胚
O.2ml。同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照，每胚O. 2ml。置36 37 °C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察168小時(shí)。以鴨胚死亡并出現(xiàn)尿囊膜水腫增厚，頭、頸、背部等全身出血性病變判為感染，計(jì)算ELD50。 ③滅活檢驗(yàn)分別將YBHl株和YBHX株滅活后的病毒液尿囊腔接種10日齡SPF雞胚和12 13日齡易感鴨胚各10枚，每胚O. 2ml，置36 37°C繼續(xù)孵育，連續(xù)觀察168小時(shí)。5.滅活疫苗的制備經(jīng)過檢驗(yàn)合格后的半成品抗原進(jìn)行疫苗制備(以下配制中各液體成分按體積比計(jì))。油相制備取獸用白油94份，硬脂酸鋁2份，置于油相制備罐中加熱至80°C后，再加司本一 806份，至溫度達(dá)到115°C時(shí)，維持30min，冷卻后備用。水相制備將滅活檢驗(yàn)合格的YBHl株和YBHX株病毒液適當(dāng)比例混合，使每O. 2ml水相中含YBHl株和YBHX株病毒含量均不低于106_ 1ELD5tlt5取滅菌后的吐溫-804份，加入配液罐中，同時(shí)加混合抗原液96份，開動(dòng)攪拌電機(jī)攪拌20 30min，使吐溫-80完全溶解。乳化取油相3份放于高速剪切機(jī)內(nèi)，開動(dòng)電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)徐徐加入水相I份，以10000r/min,乳化5分鐘。乳化后，取IOml,以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相 < O. 5ml。二、疫苗成品檢驗(yàn)( I)性狀外觀疫苗應(yīng)為乳白色乳劑，無雜質(zhì)并且外包裝應(yīng)合格。劑型為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第I滴外，均應(yīng)不擴(kuò)散。穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)不超過O. 5ml。
黏度按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。(2)裝量檢查按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。(3)無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。(4)安全檢驗(yàn)用21 35日齡SPF雞10只，每只頸部皮下注射疫苗2. Oml,同時(shí)設(shè)對(duì)照5只，在相同的條件下飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14日，記錄試驗(yàn)雞采食、飲水及臨床情況。應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。(5)效力檢驗(yàn)用21 35日齡SPF雞10只，每只頸部皮下注射疫苗，O. 5ml/只，另取5只同日齡雞不免疫作對(duì)照，免后21日，采血分離血清，分別測定I型和新型鴨肝炎病毒中和抗體效價(jià)。免疫組抗體效價(jià)，應(yīng)均不低于1:64，對(duì)照組應(yīng)均為陰性。三、高免蛋的制備I..免疫程序頸部皮下或肌肉注射基礎(chǔ)免疫于開產(chǎn)前2 3周做基礎(chǔ)免疫，Iml/只；第2次免疫基礎(chǔ)免疫后2周，加強(qiáng)免疫，2ml/只；第3次免疫第2次免疫后2周，加強(qiáng)免疫2ml/只；第4次免疫第3次免疫后2周，加強(qiáng)免疫2ml/只；第N次免疫第4次免疫后，每隔6 8周，加強(qiáng)免疫，2ml/只。2..高免蛋收集第4次免疫后第14日，測定卵黃中I型和新型鴨肝炎病毒的中和抗體效價(jià)?？贵w效價(jià)均不低于1:1024為合格。收集高免雞蛋，2 8°C貯存?zhèn)溆?，貯存時(shí)間應(yīng)不超過7日。四、鴨病毒性肝炎卵黃抗體制造及檢驗(yàn)I.卵黃抗體制造(I)將高免蛋浸入1%的TH4+溶液中浸泡消毒5min。取出消毒后的雞蛋自然晾干或吹干，噴灑75%的酒精對(duì)蛋殼表面消毒后備用。(2)卵黃分離采取機(jī)械打蛋。打蛋時(shí)應(yīng)充分除去蛋清、胚盤和系帶，收集卵黃。(3)滅活I(lǐng)將收集的蛋黃充分?jǐn)嚢?，使蛋黃呈均勻膏狀，啟動(dòng)蠕動(dòng)泵，將蛋黃液泵入夾層反應(yīng)罐中，加入與蛋黃等體積的注射用水(注射用水先經(jīng)80°C 30min消毒，并冷卻至65°C以下),攪拌混勻后,60 65°C保溫(滅活)30min。(4)酸化萃提先在隔離反應(yīng)罐中加入相當(dāng)于原蛋黃4倍體積冷卻至4°C的注射用水。然后加入卵黃液，開啟攪拌機(jī)攪拌?；靹蚝笥?11101/1鹽酸調(diào)？!1值至5.4。2 8°C靜置12小時(shí)。酸化完成后，6000r/min離心15min，離心后取上清液。(5)滅活I(lǐng)I在分離的上清液中加入終濃度為O. 2% (體積比)的辛酸作滅活劑和萃提劑，攪拌均勻，2 8°C放置4 8小時(shí)。(6)粗濾用無菌濾布過濾后，再用柱芯濾器過濾至澄清。(7)除菌過濾用O. 22 μ m微孔芯過濾除菌。置2 8°C存放，應(yīng)不超過14日。同時(shí)取樣檢測I型和新型鴨肝炎病毒的中和抗體效價(jià)。(8)濃縮如檢測的I型或新型鴨肝炎病毒的中和抗體效價(jià)低于1:256，應(yīng)將除菌過濾后的卵黃抗體在2 8°C條件下，用30 50KD的濃縮膜包進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)的超濾濃縮，濃縮至原體積的1/3，濃縮后的I型和新型鴨肝炎病毒中和抗體效價(jià)應(yīng)均不低于1:256。(9)滅活I(lǐng)II將過濾后的溶液導(dǎo)入滅活罐中，計(jì)量加入10%的甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為O. 1%，37°C滅活16小時(shí)。 (10)阻斷滅活結(jié)束后，立即在滅活病毒液中加入過濾除菌的50%硫代硫酸鈉溶液，使其終含量為2% (質(zhì)量體積比W/V)，充分混合，取樣后迅速置4°C保存。2.卵黃抗體成品的檢驗(yàn)(I)性狀本品為淡黃色的透明液體。pH值應(yīng)為6. 8 7. 2。(2)裝量檢查按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。(3)無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)無菌生長。(4)安全檢驗(yàn)用I 3日齡易感雛鴨(I型和新型鴨肝炎母源抗體均< 1:4)10只，各肌肉分點(diǎn)注射本品2. Oml0觀察14日，易感雛鴨應(yīng)全部健活。(5)效力檢驗(yàn)(參見表5)血清學(xué)方法按附注I方法測定中和抗體效價(jià)，成品中鴨病毒性肝炎YBHl株和YBHX株卵黃抗體效價(jià)均應(yīng)不低于1:256。免疫攻毒法3 7日齡易感雛鴨(I型和新型鴨肝炎病毒母源抗體均< 1:4)40只，隨機(jī)分成A、B、C、D組，每組10只。A、B為免疫組，頸部皮下或肌肉注射本品，每只O. 5ml ；C、D為攻毒對(duì)照組，頸部皮下或肌肉注射生理鹽水，每只O. 5ml，隔離飼養(yǎng)。16小時(shí)后A、C組雛鴨分別肌肉注射用生理鹽水作10倍稀釋的YBHl株鴨肝炎病毒，每只O. 5ml ;B、D組雛鴨分別肌肉注射用生理鹽水作10倍稀釋的YBHX株鴨肝炎病毒，每只O. 5ml。攻毒后觀察10日，記錄每組雛鴨發(fā)病、死亡情況。A、B組攻毒后應(yīng)至少8只健活；C、D組應(yīng)于攻毒16小時(shí)后開始發(fā)病，10日內(nèi)至少8只死亡。本發(fā)明所涉及微生物本發(fā)明涉及鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus) YBHl株和YBHX株，以上2個(gè)毒株已于2012年08月15日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC No. 6441、CGMCC No. 6442。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明涉及鴨病毒性肝炎二價(jià)精制卵黃抗體的生產(chǎn)方法。本發(fā)明從鴨病毒性肝炎病毒優(yōu)勢流行毒株中篩選出免疫原性良好的鴨病毒性肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株疫苗制備毒株，分別接種雞胚和鴨胚，分別收獲死亡胚胚體和胚液，經(jīng)研磨、凍融后收取病毒液，經(jīng)超濾濃縮、甲醛溶液滅活后，加油佐劑混合乳化制成疫苗。用此疫苗接種產(chǎn)蛋雞，收獲高免雞蛋，分離蛋黃，滅活、萃提精制而成，能同時(shí)預(yù)防由I型和新型鴨肝炎病毒引起的雛鴨病毒性肝炎，此卵黃具有高效、安全性好、保護(hù)率高等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I——疫苗(免疫原)制備I.制苗用病毒液的制備(I)YBHl株毒液制備將生產(chǎn)用毒種YBHl株作100倍稀釋，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚100枚，每胚O. 2ml，36 37°C孵育,每日2次照胚檢查。接種后48 120小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，置2 8°C放置4 12小時(shí)后，收取尿囊液、羊水及胚體，胚體去掉頭和四肢。用胚液勻漿后、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無菌容器中，置2 8°C保存。(參見表I)。 (2)YBHX株毒液制備將生產(chǎn)用毒種YBHX株100倍稀釋，尿囊腔接種12 13日齡易感鴨胚100枚，每胚O. 2ml, 36 37°C孵育，每日2次照胚檢查。接種后48 120小時(shí)內(nèi)死亡的鴨胚，置2 8V 4 12小時(shí)，收取尿囊液、羊水及胚體(去掉頭和四肢)。用胚液勻漿、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無菌容器中，置2 8°C保存。(參見表I)。表I毒液的制備
毒株名稱~胚品種 I接種胚數(shù)(枚) 胚日齡I收獲胚液(ml)
YBHl 株SPF 雞胚 0010 Τ00
YBHX株易感鴨胚1001212002.濃縮將收獲的YBHl株和YBHX株病毒液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機(jī)分別濃縮至原體積的1/3，按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，無菌生長，并留樣備測毒價(jià)。YBHl株病毒液每O. 2ml病毒含量為106· 3ELD5tl, YBHX株病毒液每O. 2ml病毒含量為IO6 5ELD50 0濃縮后的胚液隨即進(jìn)行滅活。(參見表2)。表2毒液濃縮
濃縮前濃縮后
毒株名稱病毒含量病毒含量
數(shù)量(nil)數(shù)量(ml)
(107'0.2ml)(1070.2ml )
YBHI 株11006. I3506. 3
YBHX 株 2006^34006^53.滅活分別將濃縮后的YBHl株與YBHX株病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計(jì)量加入10%甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為O. 2%。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°C滅活16小時(shí)(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開始計(jì)時(shí))后取出，置2 8°C保存。
4.疫苗半成品檢驗(yàn)(I)無菌檢驗(yàn)取滅活的濃縮胚液，按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，無菌生長。(2)病毒含量測定I)濃縮后YBHl株病毒含 量測定將濃縮后的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10_4、10_5、10_6、10_74個(gè)稀釋度，分別尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚O. 2ml。同時(shí)設(shè)接種生理鹽水對(duì)照5枚，每胚O. 2ml。置36 37°C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察168小時(shí)。以雞胚死亡并出現(xiàn)尿囊膜水腫增厚，頭、頸、背部等全身出血性病變判為感染，ELD50,為 IO6 302)濃縮后YBHX株病毒含量測定將濃縮后的病毒液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10_4、10_5、10_6、10_74個(gè)稀釋度，分別尿囊腔接種12 13日齡易感鴨胚5枚，每胚
O.2ml。同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照，每胚O. 2ml。置36 37 °C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察168小時(shí)。以鴨胚死亡并出現(xiàn)尿囊膜水腫增厚，頭、頸、背部等全身出血性病變判為感染，ELD50,為 IO6 50(3)滅活檢驗(yàn)分別將YBHl株和YBHX株滅活后的病毒液尿囊腔接種10日齡SPF雞胚和12 13日齡易感鴨胚各10枚，每胚O. 2ml，置36 37°C繼續(xù)孵育，連續(xù)觀察168小時(shí)，雞胚和鴨胚均無死亡。5.滅活疫苗的制備經(jīng)過檢驗(yàn)合格后的半成品抗原進(jìn)行疫苗制備(以下配制中各液體成分按體積比計(jì)，參見表3)。(I)油相制備取獸用白油94份，硬脂酸鋁2份，置于油相制備罐中加熱至80°C后，再加司本一 806份，至溫度達(dá)到115°C時(shí)，維持30min，冷卻后備用。(2)水相制備將滅活檢驗(yàn)合格的YBHl株和YBHX株病毒液混合，檢測每O. 2ml水相中含YBHl株和YBHX株病毒含量，分別為IO61ELD5tl和106 3ELD5(I。取滅菌后的吐溫-804份，加入配液罐中，同時(shí)加混合抗原液96份，開動(dòng)攪拌電機(jī)攪拌20 30min，使吐溫-80完全溶解。(3)乳化取油相3份放于高速剪切機(jī)內(nèi)，開動(dòng)電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)徐徐加入水相I份，以10000r/min,乳化5分鐘。乳化后,取IOml,以3000r/min離心15分鐘，管底無水相析出。(4)分裝定量分裝，加蓋密封。表3疫苗乳化和分裝
權(quán)利要求
1.一種鴨病毒性肝炎二價(jià)精制卵黃抗體，其特征在于該卵黃抗體含有抗鴨肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株的抗體，可同時(shí)預(yù)防由I型和新型鴨肝炎病毒引起的鴨病毒性肝炎。
2.權(quán)利要求I所述鴨病毒性肝炎二價(jià)精制卵黃抗體的制備方法，其特征在于 (1)鴨肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株已于2012年08月15日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 CGMCC No. 6441、CGMCC No. 6442 ； (2)用鴨肝炎病毒I型YBHl株和新型YBHX株作為疫苗生產(chǎn)毒株，制成鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗； (3)用制備的鴨病毒性肝炎二價(jià)滅活疫苗注射免疫產(chǎn)蛋雞，制備高免蛋； (4)由高免蛋收集卵黃用酸化水-辛酸的方法萃提、滅活后制備成鴨病毒性肝炎二價(jià)精制卵黃抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及鴨病毒性肝炎二價(jià)精制卵黃抗體的生產(chǎn)方法。本發(fā)明從鴨肝炎病毒優(yōu)勢流行毒株中篩選出免疫原性良好的鴨肝炎病毒1型YBH1株和新型YBHX株疫苗制備毒株，分別接種雞胚和鴨胚，分別收獲死亡胚胚體和胚液，經(jīng)研磨、凍融后收取病毒液，經(jīng)超濾濃縮、甲醛溶液滅活后，加油佐劑混合乳化制成疫苗。用此疫苗接種產(chǎn)蛋雞，收獲高免雞蛋，分離蛋黃，滅活、萃提精制而成，能同時(shí)預(yù)防由1型和新型鴨肝炎病毒引起的鴨病毒性肝炎，此卵黃具有高效、安全性好、保護(hù)率高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K16/02GK102827275SQ20121033659
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月12日
發(fā)明者徐保娟, 宮曉, 郭偉偉, 王龍, 孫健, 胡瀟 申請(qǐng)人:青島易邦生物工程有限公司