專利名稱：一種新型高效非細(xì)胞性疫苗的制備及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及一種新型高效疫苗的制備方法以及該類疫苗在各類腫瘤及感染性疾病預(yù)防和治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤及感染性疾病的主動性免疫治療是治療及預(yù)防腫瘤或感染性疾病的有效手段，自從人類采用接種牛痘預(yù)防天花以來，人類在感染性疾病的預(yù)防及控制上取得了很大的進展，目前在我國已經(jīng)基本消滅了天花、脊髓灰質(zhì)炎等感染性疾病，但在其他重大疾病的治療方面如腫瘤及艾滋病、病毒性肝炎等疾病的預(yù)防及治療方面，仍然缺乏有效的手段。
腫瘤的免疫治療是繼手術(shù)、放療、化療之后的一個新的治療模式，腫瘤免疫治療的中心環(huán)節(jié)就是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性和非特異性的抗腫瘤免疫。采用腫瘤疫苗去誘導(dǎo)特異性的抗腫瘤免疫，對于抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移更為重要，目前盡管已知一些腫瘤抗原，但對于大多數(shù)腫瘤來說，腫瘤抗原仍是未知的。目前常用的腫瘤疫苗包括采用全細(xì)胞瘤苗、腫瘤細(xì)胞的裂解物、腫瘤抗原致敏的樹突狀細(xì)胞瘤苗、基因工程疫苗等，取得了一定的療效，但也明顯存在不足。
1.腫瘤相關(guān)抗原肽疫苗。目前人類已經(jīng)獲得了四類腫瘤相關(guān)抗原，(1)腫瘤特異性抗原，包括MAGE-1、MAGE-3、GAGE、RAGE等，這類抗原在正常組織除了睪丸和胎盤外不表達(dá)，只在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)；(2)腫瘤分化抗原，包括MART-1、gp-100、酪氨酸激酶相關(guān)蛋白-1，分布于黑色素細(xì)胞瘤；(3)突變基因編碼蛋白，如MUM-1等這些基因分布廣泛，但在腫瘤組織中突變而成為腫瘤抗原；(4)在腫瘤組織高表達(dá)的一類抗原，如HER2-neu等。目前采用合成抗原肽或基因工程表達(dá)及DNA疫苗的方式制備該類疫苗。
2.樹突狀細(xì)胞瘤苗。樹突狀細(xì)胞是體內(nèi)最強的專職性抗原遞呈細(xì)胞，是抗腫瘤免疫應(yīng)答的始作俑者，采用腫瘤細(xì)胞裂解物或腫瘤相關(guān)抗原肽致敏樹突狀細(xì)胞回輸體內(nèi)，可以誘導(dǎo)抗原特異性的免疫應(yīng)答，目前該類療法已經(jīng)進入臨床I-III期試驗3.抗獨特型抗體疫苗?？躬毺匦涂贵w可以模仿蛋白和抗原肽，在部分試驗中人們已經(jīng)可以應(yīng)用抗獨特型抗體誘導(dǎo)針對腫瘤相關(guān)抗原的特異性的免疫反應(yīng)，該類疫苗的優(yōu)勢在于可以產(chǎn)生比抗原肽更強的免疫應(yīng)答。
4.基因修飾的腫瘤疫苗。采用病毒或基因修飾腫瘤細(xì)胞作為瘤苗是研究較多的一類腫瘤疫苗，主要是采用細(xì)胞因子基因、共刺激分子等、希望提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性，誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答。
然而，目前以上4種腫瘤疫苗均存在明顯不足，許多腫瘤抗原不明確，無法誘導(dǎo)腫瘤特異性的CTL，而采用樹突狀細(xì)胞瘤苗和基因修飾的腫瘤細(xì)胞瘤苗，也存在體外操作復(fù)雜、質(zhì)量難以控制、療效有限等因素。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的療效好、操作簡便的新腫瘤疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高效的用于腫瘤及感染性疾病治療及預(yù)防的疫苗成分，該疫苗成分是采用細(xì)胞經(jīng)熱誘導(dǎo)后的外排體；本發(fā)明的另一目的是提供所述外排體的制法及用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種外排體，所述外排體是由細(xì)胞經(jīng)熱誘導(dǎo)后的產(chǎn)生的分泌至細(xì)胞外的囊泡，其中所述的細(xì)胞選自下組腫瘤細(xì)胞、病原體及被病原體感染的細(xì)胞；所述的囊泡具有以下特征(a)具有直徑為50-100nm的囊泡結(jié)構(gòu)；(b)含有選自下組的免疫分子腫瘤抗原或病原體抗原、MHC分子、粘附分子和共刺激分子；(c)含有選自下組的趨化因子MIP-1α、MIP-1β、MIP-3β、MCP-1和IP-10；(d)含有熱休克蛋白分子。
在一優(yōu)選例中，所述的外排體在體外可以趨化和激活免疫細(xì)胞，并且在體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異性和非特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明的外排體是用如下方法制備的
(1)將細(xì)胞在43±3℃下熱誘導(dǎo)0.5-10小時，然后在37±2℃下孵育2-24小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，其中所述的細(xì)胞選自下組腫瘤細(xì)胞、病原體及被病原體感染的細(xì)胞；(2)300-500×g低速離心去除細(xì)胞，收集上清；(3)1000-3000×g中速離心去除細(xì)胞碎片和細(xì)胞器，收集上清；(4)7000-12000×g高速離心去除小細(xì)胞器和雜質(zhì)，收集上清；(5)80000-120000×g超高速離心0.5-5小時，收集沉淀，即為外排體。
在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，尤其是人的腫瘤細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，所述的外排體同時含有腫瘤抗原或病原體抗原、MHC分子、粘附分子、共刺激分子、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3β、MCP-1IP-10、和熱休克蛋白分子。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種藥物組合物，含有有效量的本發(fā)明所述的外排體和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物可以是治療性的或預(yù)防性的。在一優(yōu)選例中，它是疫苗。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種制備外排體的方法，包括以下步驟(1)將細(xì)胞在43±3℃下熱誘導(dǎo)0.5-10小時，然后在37±2℃下孵育2-24小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，其中所述的細(xì)胞選自下組腫瘤細(xì)胞、病原體及被病原體感染的細(xì)胞；(2)300-500×g低速離心去除細(xì)胞，收集上清；(3)1000-3000×g中速離心去除細(xì)胞碎片和細(xì)胞器，收集上清；(4)7000-12000×g高速離心去除小細(xì)胞器和雜質(zhì)，收集上清；(5)80000-120000×g超高速離心0.5-5小時，收集沉淀，即為外排體。
在一優(yōu)選例中，各步驟的條件如下(1)置于41-45℃中熱誘導(dǎo)1±0.5小時左右，然后在37℃孵育4-8小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清；(2)300-500×g離心5-10分鐘，收集上清；(3)1000-3000×g離心20±10分鐘，收集上清；(4)7,000-12,0000×g離心30±15分鐘，收集上清；(5)80,000-120,000×g離心1±0.5小時，收集沉淀，PBS洗滌，獲得熱誘導(dǎo)后外排體。
在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明外排體的用途，它被用于制備預(yù)防或治療腫瘤及感染性疾病藥物。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種預(yù)防或治療腫瘤及感染性疾病的方法，該方法包括，給個體施用安全有效量的本發(fā)明的熱誘導(dǎo)外排體。


圖1顯示了本發(fā)明高效疫苗結(jié)構(gòu)的電鏡觀察。
圖2是本發(fā)明高效疫苗的鑒定。
圖3顯示了本發(fā)明高效疫苗表達(dá)趨化因子、MHC分子及熱休克蛋白。
圖4顯示了本發(fā)明高效疫苗對樹突狀細(xì)胞及T細(xì)胞的趨化作用。
圖5顯示了本發(fā)明高效疫苗刺激T細(xì)胞或增強樹突狀細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖試驗。
圖6顯示了本發(fā)明高效疫苗對腫瘤的抑制作用。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞經(jīng)熱誘導(dǎo)后的外排體(exosome)是一種新的可用于腫瘤及感染性疾病高效疫苗，可以很好地解決疾病抗原不明確、難以誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的不足，同時可以明顯提高療效，具有制備簡便、特異性高、誘導(dǎo)免疫應(yīng)答強、療效好等特點。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
外排體是細(xì)胞所釋放的直徑為50-100nm的微小的膜性囊泡，成熟的紅細(xì)胞以外排體的形式將功能所不需要的漿膜蛋白排出細(xì)胞外，例如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)或乙酰膽堿脂酶等。通過電鏡的深入研究，證實外排體不是由細(xì)胞膜直接芽生形成的，而是來源于稱為多囊泡體(multivesicular bodies，MVBs)的由內(nèi)吞過程形成的結(jié)構(gòu)。這種小囊泡出現(xiàn)在MVBs內(nèi)腔中，很可能是由MVBs內(nèi)側(cè)面的膜芽生而來。最后通過MVBs與胞漿膜的直接融合，這些小囊泡被釋放到細(xì)胞外的基質(zhì)中，即被稱為外排體。近年來發(fā)現(xiàn)外排體并不僅僅由終期分化的網(wǎng)織紅細(xì)胞唯一分泌，有人證實了EB病毒轉(zhuǎn)染的B淋巴細(xì)胞可以分泌同樣的這種小囊泡。在B淋巴細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞中，包括MVBs在內(nèi)的這種參與內(nèi)吞過程的結(jié)構(gòu)正是多肽結(jié)合MHCII類分子的部位。EB病毒來源的含有多肽MHCII類分子復(fù)合物，并能夠?qū)⑵渲苯映蔬f給CD4+T淋巴細(xì)胞。Zitvogel等報道了DC同樣也可以分泌外排體，并且這種DC來源的外排體含有MHCI類和MHCII類分子。當(dāng)用腫瘤細(xì)胞來源的多肽沖擊DC后得到的外排體，可以誘導(dǎo)CTL介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，導(dǎo)致荷瘤小鼠的腫瘤生長明顯抑制。最近，Zitvogel實驗室又報道了人和小鼠的腫瘤細(xì)胞均能夠持續(xù)分泌外排體，這些腫瘤細(xì)胞來源的外排體含有MHCI類分子和LAMP1并且能夠?qū)⒛[瘤抗原呈遞給DC從而產(chǎn)生顯著的CD8+T細(xì)胞依賴的抗腫瘤免疫反應(yīng)，且這種免疫效應(yīng)對同系的和異系的荷瘤小鼠有交叉治療作用，提示腫瘤來源的外排體可能與腫瘤免疫密切相關(guān)。外排體可以作為腫瘤治療的制劑和腫瘤疫苗，介導(dǎo)針對同系小鼠和不同系小鼠的腫瘤免疫保護作用。
在本發(fā)明中，與未經(jīng)熱休克的腫瘤細(xì)胞釋放的外排體(EXO)相比，腫瘤細(xì)胞“經(jīng)熱休克后的外排體(HS EXO)”發(fā)生了質(zhì)的改變，含有多種高濃度的趨化因子。趨化因子作為細(xì)胞因子中的一個超家族，是對白細(xì)胞具有趨化作用的一類小分子的細(xì)胞產(chǎn)物。趨化因子及其受體在炎癥反應(yīng)，免疫應(yīng)答，抗感染，抗腫瘤中都起著非常關(guān)鍵性的作用。多種趨化因子可趨化免疫活性細(xì)胞以及抑制血管生成來抵抗腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明的熱誘導(dǎo)外排體具有一般外排體的基本特性以及自身獨特的生物學(xué)特性(1)呈50-100nm的囊泡樣結(jié)構(gòu)，大小比較均一，結(jié)構(gòu)完整；(2)含有抗原(包括腫瘤抗原、或衍生自微生物和其他感染細(xì)胞的抗原)、MHCI/II類分子、共刺激分子、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、LAMP-1和HSC70等熱休克蛋白分子；(3)含有多種趨化因子，如MIP-1α(CCL3)、MIP-1β(CCL4)、MIP-3β(CCL19)、MCP-1(CCL2)和IP-10(CXCL10)；(4)可以趨化、活化樹突狀細(xì)胞及T細(xì)胞。
本發(fā)明的實驗證實，熱休克后外排體可以顯著趨化DC和T細(xì)胞，提示外排體內(nèi)趨化因子可以發(fā)揮趨化活性。HS EXO中含有高水平的MHCI類和II類分子以及多種共刺激分子、粘附分子、腫瘤抗原提呈的伴侶分子HSP70等，而且HS EXO中所含有的大部分免疫分子與EXO相比顯著上調(diào)，提示HS EXO比EXO有更強的免疫學(xué)活性。用HS EXO和EXO治療腫瘤，發(fā)現(xiàn)HS EXO有更好的腫瘤治療效果，誘導(dǎo)出更強的CTL和特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。以HS EXO作為疫苗，可以更好地保護同系和不同系荷瘤宿主免受腫瘤細(xì)胞的攻擊，而且對荷瘤宿主已形成的腫瘤亦有明顯的治療作用。在注射HS EXO后4h腫瘤區(qū)即有DC的浸潤，至24h左右即達(dá)到比較多的水平，提示HS EXO瘤體內(nèi)注射后可以利用其中所含有的趨化因子迅速吸引DC到局部聚集，通過其表面的粘附分子與DC粘附，然后在共刺激分子的參與下，憑借自身HSP蛋白所攜帶的內(nèi)源性腫瘤多肽將腫瘤特異性抗原和腫瘤共有抗原提呈給DC，繼而促使DC的成熟并返回淋巴結(jié)，啟動特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。HS EXO的瘤體內(nèi)注射可以募集CD4+和CD8+的T淋巴細(xì)胞從而在局部形成有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。
本發(fā)明還提供這種新型高效疫苗的制備方法，它主要包括步驟(a)在熱誘導(dǎo)溫度下熱誘導(dǎo)一段時間，然后復(fù)蘇。例如，將細(xì)胞在43±3℃下熱誘導(dǎo)0.5-10小時，然后在37±2℃下孵育2-24小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，其中所述的細(xì)胞選自下組腫瘤細(xì)胞、病原體及被病原體感染的細(xì)胞；(b)分離獲得熱誘導(dǎo)外排體。較佳地，該分離包括步驟(i)低速離心去除細(xì)胞，、(ii)中速離心去除細(xì)胞碎片和細(xì)胞器、(iii)高速離心去除小細(xì)胞器和雜質(zhì)和(iv)超高速離心，收集沉淀(即外排體)。應(yīng)理解，這些步驟的具體條件可以有所保護，只要分離出外排體即可。一種優(yōu)選的分離方法條件是(i)低速離心，300-500×g低速離心去除細(xì)胞，收集上清；(ii)1000-3000×g中速離心去除細(xì)胞碎片和細(xì)胞器，收集上清；(iii)7000-12000×g高速離心去除小細(xì)胞器和雜質(zhì)，收集上清；(iv)80000-120000×g超高速離心0.5-5小時，收集沉淀，即為外排體。
在一優(yōu)選例中，各步驟的條件如下(1)將要制備外排體的細(xì)胞置于在41-45℃中熱誘導(dǎo)1小時左右，然后在37℃中孵育4-8小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清；(2)300×g離心5-10分鐘，收集上清；(3)1200×g離心20分鐘，收集上清；(4)10,000×g離心30分鐘，收集上清；(5)10,0000×g離心1小時，收集沉淀，PBS洗2次，獲得熱誘導(dǎo)后外排體。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物或免疫組合物。在所述組合物中，含有藥學(xué)上可接受的載體(包括稀釋劑、賦形劑等)以及有效量的本發(fā)明熱誘導(dǎo)外排體。熱誘導(dǎo)外排體的數(shù)量通常為10微克-100毫克/劑，較佳地為100-1000微克/劑。
本文所用的術(shù)語“有效量”指治療劑治療、緩解或預(yù)防目標(biāo)疾病或狀況的量，或是表現(xiàn)出可檢測的治療或預(yù)防效果的量。對于某一對象的精確有效量取決于該對象的體型和健康狀況、病癥的性質(zhì)和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預(yù)先指定準(zhǔn)確的有效量是沒用的。然而，對于某給定的狀況而言，可以用常規(guī)實驗來確定該有效量，臨床醫(yī)師是能夠判斷出來的。
為了本發(fā)明的目的，有效的劑量為給予個體約0.01毫克/千克至50毫克/千克，較佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克體重的熱誘導(dǎo)外排體。
藥物組合物還可含有藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑(例如腫瘤抗原)給藥的載體。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體；它們本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。
治療性組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。此外，免疫組合物中還可以含有免疫佐劑。
通常，可將治療性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。
一旦配成本發(fā)明的組合物，可將其直接給予對象。待預(yù)防或治療的對象可以是動物；尤其是人。
本發(fā)明的含熱誘導(dǎo)外排體的治療或預(yù)防性藥物組合物(包括疫苗)，可以經(jīng)口服、皮下、皮內(nèi)、腔內(nèi)、瘤內(nèi)或病變部位、淋巴結(jié)、靜脈注射或埋植等方式應(yīng)用。治療劑量方案可以是單劑方案或多劑方案。
本發(fā)明的熱誘導(dǎo)外排體可用于治療和預(yù)防腫瘤及感染性疾病發(fā)生，對已發(fā)生的腫瘤及感染性疾病具有治療作用。代表性的例子包括(但并不限于)各種腫瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤、腎癌、惡性淋巴瘤、白血病、宮頸癌、卵巢癌、鼻咽癌、口腔癌、骨肉瘤、腦膠質(zhì)瘤、膀胱癌、多發(fā)性骨髓瘤等以及各類感染性疾病如細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲感染包括艾滋病、各型病毒性肝炎等的預(yù)防及治療。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)HS EXO內(nèi)含有多種趨化因子、共刺激分子、MHC分子以及攜帶腫瘤抗原信息的HSP分子，因此其基本包含有以前所有疫苗的特征，是一種人工的抗原遞呈囊泡(artificial antigen presenting vesicles，AAPV)。由于這種外排體來自于腫瘤細(xì)胞，攜帶有腫瘤抗原，又有幾乎所有目前研制的高效腫瘤疫苗所必須的共刺激信號的特性，因此可作為一種非細(xì)胞性的新型疫苗。這種非細(xì)胞結(jié)構(gòu)性的新型疫苗，可以有效誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，有效激發(fā)起特異性和非特異性抗腫瘤免疫，對腫瘤進行治療以及預(yù)防其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
(2)這種新型高效的腫瘤疫苗，未經(jīng)基因修飾和外源基因?qū)?，因此對機體潛在危害作用小，沒有倫理的難題，無個體限制性。制備簡單易行，是一種極有臨床應(yīng)用前景的新型生物制劑和疫苗，具有重要的應(yīng)用價值和良好的市場前景，對有效控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展、改善惡性腫瘤治療現(xiàn)狀具有重要意義，將有極大的社會效益和經(jīng)濟效益。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1熱誘導(dǎo)外排體的制備取生長狀態(tài)良好的(80％鋪滿)人肺腺癌細(xì)胞A549，先進行43℃熱休克1h后，37℃恢復(fù)4h，收取培養(yǎng)上清，同時收取未經(jīng)熱休克的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清。4步離心法分離。即4℃離心300g，10分鐘；1,200g，30分鐘；10,000g，30分鐘，最后，超速離心100,000g 60分鐘，所獲得的沉淀即為熱誘導(dǎo)的細(xì)胞外排體。這種熱誘導(dǎo)外排體可以直接作為高效的腫瘤疫苗或其主要活性成分。
重復(fù)上述步驟，分別用結(jié)腸癌細(xì)胞CT26、小鼠肺腺癌細(xì)胞3LL細(xì)胞、小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16、小鼠肥大細(xì)胞瘤T815制得熱誘導(dǎo)外排體。
實施例2熱誘導(dǎo)外排體的鑒定外排體懸液用PBS洗2次，經(jīng)固定液(2％多聚甲醛，0.25％戊二醛)4℃固定1h，用PBS洗一遍制成懸液滴片，1％鋨酸固定，梯度酒精脫水，經(jīng)超薄切片鉛鈾染色后透射電鏡觀察攝片。結(jié)果如圖1所示，該外排體為均一的50-100nm的囊泡。
采用Western-blot分析其蛋白組成，結(jié)果如圖2所示，該外排體表達(dá)MHC I類分子、Mac-1、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferin receptor，TfR)、溶酶體相關(guān)膜蛋白(lysosome-associated membrane protein，LAMP)和HSC70。
實施例3熱誘導(dǎo)外排體含趨化因子、MHC分子及熱休克蛋白分子外排體經(jīng)BCA法測蛋白濃度，加入上樣緩沖液。于15％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，每孔加入外排體30ug，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(0.45u)(Bio-Rad公司)上，不同的一抗于4℃結(jié)合12h后，加入相應(yīng)的二抗結(jié)合2h，按增強化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham Life Sciences)說明書進行顯影。
結(jié)果如圖3所示，外排體中含有大量趨化因子、MHC分子及熱休克蛋白分子。
實施例4熱誘導(dǎo)外排體對樹突狀細(xì)胞及T細(xì)胞的趨化作用取1×106樹突狀細(xì)胞或T細(xì)胞重懸于含有0.5％BSA的0.1用l的RPMI 1640中，加入已事先鋪滿107B單層細(xì)胞的Transwell chamber(5μpore size；購于Costar公司)上孔中，上述外排體刺激后不同稀釋度的培養(yǎng)上清加入下孔中，總量為0.6ml。于37℃ 5％CO2孵箱孵育4h后，收集下孔中的細(xì)胞，F(xiàn)ACS標(biāo)記后，于流式細(xì)胞儀上記數(shù)。
結(jié)果如圖4所示，外排體趨化DC(CD11c+)和T細(xì)胞的數(shù)量明顯增加。
實施例5熱誘導(dǎo)外排體對樹突狀細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖的促進作用本實施例采用常規(guī)的3H-TdR摻入法進行分析，方法如下。分離正常外周血淋巴細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基懸浮，注入T細(xì)胞尼龍毛柱，置37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)1小時，沖出非粘附的細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞(即純化的T細(xì)胞)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×106/ml，加入96孔圓底培養(yǎng)板，100μl/孔；取實施例1中制備的熱誘導(dǎo)外排體20μg/ml致敏24h的第7天DC，以4000rad放射線滅活后，以2×103、6×103、2×104/孔/100μl分別加入已含有反應(yīng)細(xì)胞的各孔，總體積200μl，每組3個復(fù)孔。置37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)5天(120小時)，于培養(yǎng)結(jié)束前18小時加入3H-TdR(0.5μCi/孔)。收集細(xì)胞，液閃計數(shù)儀檢測cpm值，結(jié)果以3孔平均值表示。
結(jié)果如圖5所示。該熱誘導(dǎo)外排體可以直接刺激或增強樹突狀細(xì)胞刺激同種異體T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)。
實施例6熱誘導(dǎo)外排體對腫瘤生長的抑制作用C57BL/6小鼠右腿部皮下接種2×105CT-26小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞，隨機分組，每組10只，3天后分別于對側(cè)腿部皮下注射CT-26細(xì)胞來源的外排體，15μg/100μl/只。每間隔2天進行1次，共4次。治療4周后處死小鼠，稱瘤重結(jié)果如圖6所示。采用本發(fā)明提供的新型腫瘤高效疫苗(熱誘導(dǎo)外排體)，可以明顯抑制腫瘤的生長。
此外，對于實施例1中用結(jié)腸癌細(xì)胞CT26、小鼠肺腺癌細(xì)胞3LL細(xì)胞、小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16、小鼠肥大細(xì)胞瘤T815制得熱誘導(dǎo)外排體，也獲得了類似的結(jié)果。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種外排體，其特征在于，它是由細(xì)胞經(jīng)熱誘導(dǎo)后的產(chǎn)生的分泌至細(xì)胞外的囊泡，其中所述的細(xì)胞選自下組腫瘤細(xì)胞、病原體及被病原體感染的細(xì)胞；所述的囊泡具有以下特征(a)具有直徑為50-100nm的囊泡結(jié)構(gòu)；(b)含有選自下組的免疫分子腫瘤抗原或病原體抗原、MHC分子、粘附分子和共刺激分子；(c)含有選自下組的趨化因子MIP-1α、MIP-1β、MIP-3β、MCP-1和IP-10；(d)含有熱休克蛋白分子。
2.如權(quán)利要求1所述的外排體，其特征在于，所述的外排體在體外可以趨化和激活免疫細(xì)胞，并且在體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異性和非特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
3.如權(quán)利要求1所述的外排體，其特征在于，是用如下方法制備的(1)將細(xì)胞在43±3℃下熱誘導(dǎo)0.5-10小時，然后在37±2℃下孵育2-24小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，其中所述的細(xì)胞選自下組腫瘤細(xì)胞、病原體及被病原體感染的細(xì)胞；(2)300-500×g低速離心去除細(xì)胞，收集上清；(3)1000-3000×g中速離心去除細(xì)胞碎片和細(xì)胞器，收集上清；(4)7000-12000×g高速離心去除小細(xì)胞器和雜質(zhì)，收集上清；(5)80000-120000×g超高速離心0.5-5小時，收集沉淀。
4.如權(quán)利要求1所述的外排體，其特征在于，所述的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述的外排體，其特征在于，所述的外排體同時含有腫瘤抗原或病原體抗原、MHC分子、粘附分子、共刺激分子、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3β、MCP-1IP-10、和熱休克蛋白分子。
6.一種藥物組合物，其特征在于，含有有效量的權(quán)利要求1所述的外排體和藥學(xué)上可接受的載體。
7.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，它是疫苗。
8.一種制備外排體的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將細(xì)胞在43±3℃下熱誘導(dǎo)0.5-10小時，然后在37±2℃下孵育2-24小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，其中所述的細(xì)胞選自下組腫瘤細(xì)胞、病原體及被病原體感染的細(xì)胞；(2)300-500×g低速離心去除細(xì)胞，收集上清；(3)1000-3000×g中速離心去除細(xì)胞碎片和細(xì)胞器，收集上清；(4)7000-12000×g高速離心去除小細(xì)胞器和雜質(zhì)，收集上清；(5)80000-120000×g超高速離心0.5-5小時，收集沉淀，即為外排體。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，各步驟的條件如下(1)置于41-45℃中熱誘導(dǎo)1±0.5小時左右，然后在37℃孵育4-8小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清；(2)300-500×g離心5-10分鐘，收集上清；(3)1000-3000×g離心20±10分鐘，收集上清；(4)7,000-12,0000×g離心30±15分鐘，收集上清；(5)80,000-120,000×g離心1±0.5小時，收集沉淀，PBS洗滌，獲得熱誘導(dǎo)后外排體。
10.如權(quán)利要求1所述的外排體的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防或治療腫瘤及感染性疾病藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的腫瘤及感染性疾病的疫苗以及其制法和用途。該類疫苗為腫瘤細(xì)胞或病原體及其感染細(xì)胞經(jīng)熱誘導(dǎo)后的外排體(熱誘導(dǎo)外排體)。本發(fā)明的熱誘導(dǎo)外排體富含抗原分子、MHC分子、各類趨化因子、粘附分子、共刺激分子、熱休克蛋白等，可以顯著趨化和激活樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞等免疫細(xì)胞，有效誘導(dǎo)抗原特異性和非特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)，增強機體免疫功能。可用于腫瘤及各類感染性疾病的預(yù)防及治療，具有制備簡便、成本低、特異性強、療效顯著等特點。
文檔編號A61K39/00GK1498658SQ0214502
公開日2004年5月26日 申請日期2002年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月4日
發(fā)明者王建莉, 王青青, 陳瑋琳, 曹雪濤 申請人:杭州浙大康泰生物技術(shù)有限公司