專利名稱：具有抗氧化和抗腫瘤活性扁蒴藤素系列衍生物及合成方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種具有抗氧化和抗腫瘤活性扁蒴藤素系列衍生物及合成方法。
背景技術：
從天然藥物中得到的活性化合物只是一類創(chuàng)新藥物研究的前期階段。即使一些天然活性化合物本身可以開發(fā)成為新藥，但從成功分離、確定結構到真正開發(fā)成功也還要走很長一段道路。更何況不少天然活性化合物因為存在某些缺陷，如藥效不理想、或存在一定的毒副作用、或因含量太低，難以從天然原料中取材、或因結構過于復雜，合成也十分困難，故往往本身并無直接開發(fā)利用前途。我們只能以它們?yōu)橄葘Щ衔?，在經過一系列的化學修飾或結構改造后，對得到的衍生物進行定量構效關系的比較研究，才有可能發(fā)現比較理想的活性化合物，并開發(fā)成為新藥上市。
我們從衛(wèi)矛科植物粉背南蛇藤(Celastrus hypoleucus(Oliv.)Warb.)中分離得到天然化合物2-羰基-3-羥基-24-降碳-DA-無羈烷-1(10)，3，5，7-四烯-29-甲酸甲酯，俗名為扁蒴藤素，屬于醌甲基三萜類化合物，該化合物具有一定的生物活性，因而我們考慮對其進行結構修飾，將所得修飾后產物與其進行生物活性對照，以期得到活性更好的產物。
另一方面，我們考慮到自由基在生物體系中的作用，人類已經進行了半個多世紀的研究，從1970年到現在，收入Medline的文獻就達8萬篇以上，其研究內容幾乎涉及到生命科學的各個領域，所以我們選取了實驗室合成的四種穩(wěn)定氮氧自由基的酸與化合物扁蒴藤素的醌羥基進行酯化。
早在1820年就有體外抗氧化反應的研究發(fā)現，在水表面上的一層胡桃油八個月內消耗了三倍其體積的空氣，接著在十天之內快速消耗了60倍其體積的空氣，之后的三個月空氣消耗又減緩了，最終共消耗145倍其體積的空氣。與此同時，胡桃油變得粘稠和產生了怪味。幾年之后，著名的化學家Berzelins解釋這一現象時提出，胡桃油吸收氧氣將揭示一類重要的化學反應，這就是我們今天知道的脂質過氧化反應。一般定義不飽和脂肪酸的氧化變質為脂質過氧化。脂肪、油類和奶油的儲存，涂料、油漆、塑料和橡膠的制造和使用都存在脂質過氧化問題。之后，人們研究了脂質過氧化的基礎反應，但在生物體系中的脂質過氧化則研究的較晚，細胞膜和細胞器膜含有大量不飽和脂肪酸側鏈，很容易引起脂質過氧化，很多疾病和衰老現象都與脂質過氧化有關，因此，研究脂脂過氧化的機理也自然成為熱門領域。脂質過氧化過程是一個產生自由基和自由基參與的鏈式反應，可分為鏈啟動，鏈擴展和鏈終止，每一步都有氧自由基中間產物的產生和參與。
世界上萬事萬物都是相輔相成的，生物體內也是如此，有生有死，有抗原有抗體。有過氧化損傷，有抗氧化保護，因此生物體在氧化環(huán)境中才能得以自我保護，不至滅亡。但對每個生物個體而言，并不是都能保持氧化和抗氧化的平衡，因而才產生了各種脂質過氧化引起的損傷和疾病。當體內本身不能保持二者平衡時，外加一些抗氧化劑就是非常必要的，以協(xié)助體內維持二者的平衡，使生物體處于健康狀態(tài)。一個較嚴格和普遍被接受的定義是任何物質當以低于氧化底物濃度存在時，可以明顯推遲或抑制底物的氧化，該物質就被稱為抗氧化劑。按作用性質可以分為兩大類，第一類為預防性抗氧化劑，這一類抗氧化劑可以清除脂質過氧化鏈啟動階段的自由基引發(fā)劑，如SOD，過氧化氫酶，谷光甘肽過氧化物酶等；第二類為脂質過氧化鏈式反應的阻斷劑，這類抗氧化劑可以捕捉脂質過氧化鏈式反應中產生的自由基，減少脂質過氧化反應鏈長度，因此可以阻斷或減緩脂質過氧化的進行，如維生素C，維生素E等就屬于這一類抗氧化劑?？寡趸瘎┛梢宰饔糜谥|過氧化的以下幾個水平減少局部氧氣濃度；清除啟動脂質過氧化的引發(fā)劑；結合金屬離子，使其不能產生啟動脂質過氧化的羥基自由基或使其不能分解脂質過氧化產生的脂過氧化氫；將脂質過氧化分解為非自由基產物；阻斷脂質過氧化的反應鏈，即清除脂質過氧化中間自由基。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗氧化和抗腫瘤活性扁蒴藤素系列衍生物及合成方法。其反應式及結構式為
合成方法的步驟如下1)粉背南蛇藤根部干燥粉碎后，用丙酮室溫冷浸，回收溶劑后得到浸膏，用200-300目柱層析硅膠進行柱層析分離，以石油醚/丙酮梯度洗脫至丙酮沖柱，回收溶劑后以石油醚/丙酮作薄層條件以紫外燈檢測，GF254板以5％H2SO4/EtOH顯色后，根據Rf值分組。當石油醚/丙酮體積比為3∶1-6∶1時，Rf＝0.3-0.5的組份合并，用石油醚進行純化，得到化合物2-羰基-3-羥基-24-降碳-DA-無羈烷-1(10)，3，5，7-四烯-29-甲酸甲酯即扁蒴藤素。
2)按照原料摩爾比1∶0.6-1∶2分別以N，N’-二環(huán)己基碳亞胺為脫水劑，二氯甲烷為溶劑，電磁攪拌4h-10h，旋轉蒸發(fā)儀上減壓濃縮溶劑，再以石油醚∶丙酮＝3∶1-6∶1為展開劑，經硅膠GF254薄層制備，得到穩(wěn)定氮氧自由基與扁蒴藤素的衍生化合物。
我們進行的體外對Fe2+-VitC誘導的大鼠心、肝、腎丙二醛(MDA)生成影響的研究結果見表1。由表可以看到化合物1-4均表現了體外對Fe2+-VitC誘導的大鼠心、肝、腎組織勻漿MDA生成具有明顯的抑制作用，這表明它們可以有效的清除羥基自由基(-OH)，有抗脂質過氧化作用，可能是潛在的抗氧化藥物，有可能減少由于羥基自由基氧化引起的DNA損傷。另一方面，由扁蒴藤素衍生化得到的四個自由基衍生物1-4的抑制MDA作用均很好，尤以化合物3表現突出，其大鼠心、腎組織勻漿MDA生成抑制作用中的IC50值明顯低于母體化合物扁蒴藤素。
表1體外對Fe2+-VitC誘導的大鼠心、肝、腎MDA生成影響的研究(IC50μg/ml)化合物心 肝 腎扁蒴藤素 2.751.15 2.561 2.031.07 1.442 1.702.43 0.883 0.541.75 0.974 3.942.00 2.03HTMPO 10.20 7.10 2.03體外抗腫瘤活性的篩選研究結果見表2。由表可知扁蒴藤素的四個衍生化合物1-4的抗腫瘤作用屬于強效，普遍好于化合物扁蒴藤素。
表2體外抗腫瘤活性的篩選研究(IR％)P-388 A-549 HL-60 BEL -7402No.10-410-510-610-410-510-610-410-510-610-410-510-6扁蒴 90.8 84.9 63.5 62.6 56.5 48.2 100 94.5 0 97.4 97.2 0藤素1 95.6 94.3 90.4 60.0 57.8 59.0 100 100 99.4 98.0 97.8 97.92 96.0 92.3 88.2 71.4 69.9 55.9 100 100 14.6 97.3 95.8 55.03 95.3 95.2 88.9 58.4 53.9 27.4 99.9 100 61.3 96.6 97.8 41.34 85.5 79.4 56.7 68.9 52.3 35.7 100 100 14.6 96.9 95.7 0VP-16 99.2 70.6 25.5 97.5 50.7 45.0 96.5 68.1 35.0 96.0 38.4 5.5
化合物2-羰基-3-(2，2，5，5-四甲基四氫吡咯氮氧自由基-3-酰氧基)-24-降碳-DA-無羈烷-1(10)，3，5，7-四烯-29-甲酸甲酯(2)的合成化合物扁蒴藤素23.2mg和3-羧基-2，2，5，5-四甲基四氫吡咯氮氧自由基9.3mg在10.3mg的DCC(N，N’-二環(huán)己基碳亞胺)脫水劑存在情況下，以6.0ml的CH2Cl2(二氯甲烷)為溶劑，電磁攪拌6h，之后旋轉蒸發(fā)儀上減壓濃縮溶劑，再以石油醚∶丙酮＝5∶1為展開劑，經硅膠GF254薄層制備，得到化合物2-羰基-3-(2，2，5，5-四甲基四氫吡咯氮氧自由基-3-酰氧基)-24-降碳-DA-無羈烷-1(10)，3，5，7-四烯-29-甲酸甲酯(2)23.0mg，產率為72.78％。
試劑硫代巴比妥酸(TBA)為上海試劑二廠產品，其余試劑均為國產分析純。
動物Wistar大鼠，雌雄兼用，由蘭州醫(yī)學院動物中心提供。
方法Wistar大鼠脫頸處死，迅速剖取心臟、肝臟和腎臟，用生理鹽水制成5％的組織勻漿，實驗分空白組(加相應溶媒)，對照組(加FeSO4和抗壞血酸即Fe2+-VitC各50μmol·L-1)和給藥組(加Fe2+-VitC和各濃度藥液)，每組平行4管，每管1ml組織勻漿，以上各步均在冰浴中進行?，F在相應管中加入各濃度藥液或溶媒，37℃水浴溫育10min，再給相應管中加入Fe2+-VitC，繼續(xù)溫育30min，按TBA法測MDA。4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶氮氧自由基(HTMPO)為正對照標準(見表1)。
原理細胞膜脂質受到氧自由基攻擊時，脂質發(fā)生過氧化，生成脂質過氧化物，后者進一步降解為穩(wěn)定產物丙二醛(MDA)。MDA可與細胞膜內脂質蛋白等發(fā)生交聯(lián)，使細胞膜功能障礙。由于MDA性質穩(wěn)定、易測，常作為研究抗炎、抗衰老、抗缺血-再灌注損傷和抗輻射藥物作用的一個指標。本測定系統(tǒng)采用Fe2+-VitC作為羥基自由基(·OH)生成系統(tǒng)，用大鼠心、肝和腎細胞勻漿作為脂質供體，硫代巴比妥酸(TBA)顯色法檢測生成的MDA。TBA在堿性條件下顯紅色，在酸性條件下無色，與MDA反應生成穩(wěn)定產物，在90-100℃煮沸后酸性條件下顯紅色，可在532nm波長處檢測到吸收峰。
細胞株P-388小鼠白血病，A-549人肺癌，HL-60人白血病，BEL-7402人肝癌。
篩選方法P-388和HL-60瘤株采用四氮唑鹽還原法(MTT)；A-549和BEL-7402瘤株采用磺酰羅丹明B蛋白染色法(SRB)。作用時間72小時。VP-16(Etoposide)作為正的對照標準(見表2)。化合物測試儀器Kofler微量熔點儀(溫度計未校正)；Nicolet 5DX-FT-IR紅外光譜儀(KBr壓片)，Shimadzu UV-260紫外分光光度計；日產JASCO J-20C自動記錄旋光儀；HRMS譜采用APEXTMII Bruker 4.7TAS型質譜儀測定；ESR譜采用美國Varian E-115型ESR譜儀，工作于X-波段(～9.5GHz)和100KHz場調制，在室溫下紀錄一次微商ESR譜，以DPPH(g＝2.0036)和Mn2+/ZnS(第3-4兩條譜線間距為6.78mT)為標準確定本實驗的ESR參量(g值、ΔHp-p和aN值)；試劑溶劑均為分析純試劑，未進行處理。扁蒴藤素C30H40O4，黃色針狀晶體，mp216±2℃；EIMSm/z 464[M]+1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.53(3H，s)，1.09(3H，s)，1.17(3H，s)，1.26(3H，s)，1.44(3H，s)，2.20(3H，s)，3.55(3H，s)，6.34(1H，d，J＝7.10)，6.52(s)，7.00(1H，d，J＝7.10)；13CNMR(400 MHz，CDCl3)δ119.5(C-1)，178.4(C-2)，117.1(C-3)，127.2(C-4)，146.0(C-5)，133.8(C-6)，118.0(C-7)，164.0(C-8)，38.4(C-9)，169.8(C-10)，28.6(C-11)，29.6(C-12)，39.3(C-13)，40.3(C-14)，29.8(C-15)，30.4(C-16)，44.9(C-17)，44.2(C-18)，33.5(C-19)，30.5(C-20)，34.8(C-21)，36.3(C-22)，10.2(C-23)，38.2(C-25)，18.3(C-26)，21.5(C-27)，31.5(C-28)，178.1(C-29)，30.8(C-30)。
化合物1紅色針狀晶體，rnp108±2℃；[α]D18-21°(CH3OH，c1.5)；IRvmaxKBr3393，2929，1613，1394，1156，1061，901，771cm-1；UVλmaxMeOH208(1.30)，257(0.18)nm；HRMS[M+H]+，631.3870，C39H52O6N，理論位[M+H]+631.3867；ESR(C2H5OH，C＝10-5M)g＝2.0058，aN＝1.53mT，ΔHp-p＝0.25mT(1mT＝10G)(見說明書附圖
2)。
化合物2紅色針狀晶體，mp110±2℃；[α]D18-17°(CH3OH，c0.5)；IRνmaxKBr3397，2927，1606，1403，1055，908，559cm-1；UVλmaxMeOH209(1.75)，257(0.40)nm；HRMS[M+H]+，633.4026，C39H54O6N，理論值[M+H]+633.4024；ESR(C2H5OH，C＝10-5M)g＝2.0058，aN＝1.53mT，ΔHp-p＝0.25mT(1mT＝10G)。
化合物3紅色針狀晶體，mp102±2℃；[α]D18-13°(CH3OH，c0.3)；IRνmaxKBr3386，2924，1614，1394，1057，899，520cm-1；UVλmaxMeOH205(0.49)，261(0.13)nm；HRMS[M+H]+，645.4026，C40H54O6N，理論值[M+H]+645.4024；ESR(C2H5OH，C＝10-5M)g＝2.0058，aN＝1.53mT，ΔHp-p＝0.25mT(1mT＝10G)。
化合物4紅色針狀晶體，mp104±2℃；[α]D18-19°(CH3OH，c1.1)；IRνmaxKBr3393，2930，1645，1614，1150，1061，901，758，566cm-1；UVλmaxMeOH206(1.11)，258(0.32)nm；HRMS[M+H]+，647.4184，C40H56O6N，理論值[M+H]+647.4180；ESR(C2H5OH，C＝10-5M)g＝2.0058，aN＝1.53mT，ΔHp-p＝0.25mT(1mT＝10G)。
權利要求
1.一種具有抗氧化和抗腫瘤活性扁蒴藤素系列衍生物，其特征在于扁蒴藤素系列衍生物的合成反應式及結構式為
2.一種具有抗氧化和抗腫瘤活性扁蒴藤素系列衍生物的合成方法，其特征在于它的步驟如下1)粉背南蛇藤根部干燥粉碎后，用丙酮室溫冷浸，回收溶劑后得到浸膏，用200-300目柱層析硅膠進行柱層析分離，以石油醚/丙酮梯度洗脫至丙酮沖柱，回收溶劑后以石油醚/丙酮作薄層條件以紫外燈檢測，GF254板以5％H2SO4/EtOH顯色后，根據Rf值分組。當石油醚/丙酮體積比為3∶1-6∶1時，將Rf＝0.3-0.5的組份合并，用石油醚進行純化，得到化合物2-羰基-3-羥基-24-降碳-DA-無羈烷-1(10)，3，5，7-四烯-29-甲酸甲酯即扁蒴藤素。2)按照原料摩爾比1∶0.6-1∶2分別以N，N’-二環(huán)己基碳亞胺為脫水劑，二氯甲烷為溶劑，電磁攪拌6h，旋轉蒸發(fā)儀上減壓濃縮溶劑，再以石油醚∶丙酮＝3∶1-1-6∶1為展開劑，經硅膠GF254薄層制備，得到穩(wěn)定氮氧自由基與扁蒴藤素的衍生化合物。
3根據權利要求2所述的一種具有抗氧化和抗腫瘤活性扁蒴藤素系列衍生物的合成方法，其特征在于所說的穩(wěn)定氮氧自由基為3-羧基-2，2，5，5-四甲基吡咯啉氮氧自由基；3-羧基-2，2，5，5-四甲基四氫吡咯氮氧自由基；4-羧基-2，2，6，6-四甲基-1，2，5，6-四氫吡啶氮氧自由基；4-羧基-2，2，6，6-四甲基哌啶氮氧自由基
4根據權利要求2所述的一種具有抗氧化和抗腫瘤活性扁蒴藤素系列衍生物的合成方法，其特征在于所說的穩(wěn)定氮氧自由基與扁蒴藤素的衍生化合物為2-羰基-3-(2，2，5，5-四甲基吡咯啉氮氧自由基-3-酰氧基)-24-降碳-DA-無羈烷-1(10)，3，5，7-四烯-29-甲酸甲酯(1)；2-羰基-3-(2，2，5，5-四甲基四氫吡咯氮氧自由基-3-酰氧基)-24-降碳-DA-無羈烷-1(10)，3，5，7-四烯-29-甲酸甲酯(2)；2-羰基-3-(2，2，6，6-四甲基-1，2，5，6-四氫吡啶氮氧自由基-4-酰氧基)-24-降碳-DA-無羈烷-1(10)，3，5，7-四烯-29-甲酸甲酯(3)；2-羰基-3-(2，2，6，6-四甲基哌啶氮氧自由基-4-酰氧基)-24-降碳-DA-無羈烷-1(10)，3，5，7-四烯-29-甲酸甲酯(4)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有抗氧化和抗腫瘤活性扁蒴藤素系列衍生物及合成方法。其合成方法為粉背南蛇藤根部干燥粉碎后，丙酮提取浸膏，經硅膠柱層析分離制備后得到化合物扁蒴藤素，再經衍生化后得到扁蒴藤素系列衍生化合物。該系列化合物在體外對Fe
文檔編號A61P39/06GK1410434SQ0214513
公開日2003年4月16日 申請日期2002年11月5日 優(yōu)先權日2002年11月5日
發(fā)明者王鴻, 田暄, 潘遠江 申請人:浙江大學