專利名稱：一種人用二倍體細(xì)胞狂犬滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體地是涉及人用狂犬滅活疫苗，特別是在人用二倍
體細(xì)胞上接種狂犬病毒毒種得到的狂犬病滅活純化疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
狂犬病是一種由狂犬病毒引起的人獸共患病，該病是以侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的 急性傳染病， 一旦發(fā)病，死亡率高達(dá)100% 。盡管這是一個(gè)古老的疾病，但人類至今仍然無(wú)法 消滅它，在我國(guó)曾一度得到有效控制，但近年來(lái)狂犬病疫情快速回升，研制并推廣使用安全 高效的人用狂犬病疫苗是控制狂犬病疫情的有效手段。 1885年法國(guó)科學(xué)家巴斯德首次將狂犬病病毒在兔腦連續(xù)傳代和干燥減毒而制成 的疫苗，奇跡般的救治了一名被瘋狼嚴(yán)重咬傷的9歲小孩，開辟了人用狂犬病疫苗的新紀(jì) 元。100多年以來(lái)，特別是近二三十年現(xiàn)代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展，狂犬病疫苗 取得了重大進(jìn)展。 目前世界上大量生產(chǎn)的狂犬疫苗有四種第一種以法國(guó)為代表的Vero細(xì)胞為培 養(yǎng)狂犬病毒，制備凍干滅活疫苗，但不能保證細(xì)胞基質(zhì)的致瘤性和細(xì)胞的殘余DNA。第二種 和第三種以中國(guó)為代表的地鼠腎和日本的雞胚、鴨胚這幾種疫苗細(xì)胞來(lái)源于普通動(dòng)物，無(wú) 法保證細(xì)胞不攜帶外源因子也不能保證細(xì)胞基質(zhì)的致瘤性和細(xì)胞的殘余DNA。第四種以美 國(guó)為代表的二倍體細(xì)胞，經(jīng)過(guò)濃縮超離制備的狂犬疫苗； 人二倍體細(xì)胞疫苗(HDCV)是在人用二倍體細(xì)胞上培養(yǎng)狂犬病毒，經(jīng)澄清、加熱和 e-丙內(nèi)酯滅活、凍干制備而成。該疫苗在1974年首次獲準(zhǔn)生產(chǎn)，1978年開始商品化。該疫 苗不含任何神經(jīng)毒因子，并不含任何外源動(dòng)物雜質(zhì)，因而可以解釋它在重復(fù)注射后較好的 耐受。采用NIH法檢測(cè)疫苗的穩(wěn)定性證實(shí)，疫苗在fC和37t:放置1個(gè)月后，無(wú)明顯差異。 進(jìn)一步將5批效價(jià)4. 3-5. 6的疫苗4t:存放3年半，所有批號(hào)效價(jià)均大于2. 5IU/劑。
該疫苗已在歐洲、北美以及世界各國(guó)應(yīng)用二十年，證實(shí)是安全且高效的。早期調(diào)查 研究發(fā)現(xiàn)，HDCV預(yù)防接種后1月或3月達(dá)到抗體峰值(10IU左右)，隨后逐漸降低，但1-2 年內(nèi)滴度始終大于0. 5IU。通過(guò)1-3年內(nèi)加強(qiáng)免疫后，抗體滴度迅速增加10-15倍，肌肉注 射和皮下注射途徑相近。人二倍體細(xì)胞(HDC)為正常核型，無(wú)致癌性，具有高免疫原性和良 好的耐受性。在人體試驗(yàn)中所使用的任何疫苗的免疫原性都無(wú)法和HDCV相比。
本發(fā)明經(jīng)過(guò)研究，利用細(xì)胞工廠和微載體在這些人用二倍體細(xì)胞WI-38、 KMB17、 IMR-90、 MRC-5、2BS上培養(yǎng)狂犬病毒，所制備的疫苗價(jià)格低廉，安全性高，免疫效果好，使用 方便，純度高，適合大規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，而提供一種抗原純度高、 免疫效果好、安全性高的人用二倍體細(xì)胞狂犬病毒滅活純化疫苗。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了一種適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)且可滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)狂犬疫苗需求的人用二倍體細(xì)胞狂犬疫苗的制備方法。 為實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是該疫苗在制備過(guò)程中是在人用二倍 體細(xì)胞上接種培養(yǎng)PM狂犬病毒株，經(jīng)滅活純化得到的狂犬疫苗，所述的人用二倍體細(xì)胞是 WI-38、 KMB17、 IMR-90、 MRC_5、2BS。公知，源于人體組織的人用二倍體細(xì)胞來(lái)源清楚，包括 捐獻(xiàn)者的年齡、性別、種族、地域、體能及健康狀況、細(xì)胞直接來(lái)源的組織或器官、細(xì)胞世代 數(shù)等。人用二倍體細(xì)胞系經(jīng)過(guò)數(shù)十年研究，其生長(zhǎng)特性、遺傳穩(wěn)定的特性、外源因子(細(xì)菌、 真菌、支原體及病毒)污染檢查、致腫瘤陰性等特征被充分驗(yàn)證。更為重要的是人用二倍體 細(xì)胞本身源于人體細(xì)胞，當(dāng)用于疫苗制造時(shí)人用二倍體細(xì)胞的殘余成分不會(huì)成為超敏反應(yīng) 原，基本不會(huì)引起接種者超敏反應(yīng)。因此，從質(zhì)量控制以及安全性角度看，相較于鼠腦組織、 原代地鼠腎細(xì)胞、雞胚細(xì)胞和Vero細(xì)胞系等外源細(xì)胞系，人用二倍體細(xì)胞沒有潛在的不安 全隱患，是制備疫苗理想的細(xì)胞系。本發(fā)明采用人用二倍體細(xì)胞作為疫苗制備的病毒培養(yǎng) 所用的細(xì)胞系，顯著的提高現(xiàn)行狂犬病毒疫苗的質(zhì)量和安全性，有利于質(zhì)量控制。
為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是
(1)人用二倍體細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)及擴(kuò)增；
(2)在人用二倍體細(xì)胞上接種PM毒株；
(3)收獲病毒液；
(4)澄清超濾濃縮；
(5)病毒液滅活、純化； (6)稀釋分裝并加入保護(hù)劑后凍干制成純化疫苗。 進(jìn)一步設(shè)置是所述的人用二倍體細(xì)胞是WI-38、KMB17、 IMR-90、MRC-5、2BS。首先 建立人用二倍體細(xì)胞主種子庫(kù)和工作庫(kù)，并對(duì)細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)檢定。在制備疫苗之前， 需先進(jìn)行細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)和擴(kuò)增，使細(xì)胞量達(dá)到生產(chǎn)需要。細(xì)胞復(fù)蘇。本發(fā)明中在生長(zhǎng)成 片的人用二倍體細(xì)胞上接種狂犬病毒，狂犬病毒在人用二倍體細(xì)胞上的生長(zhǎng)繁殖可維持較 長(zhǎng)時(shí)間，因此病毒收獲可采取多次收取方式。 進(jìn)一步設(shè)置是所述的步驟(1)所使用的細(xì)胞培養(yǎng)液為199培養(yǎng)液或MEM培養(yǎng)液， 且該細(xì)胞培養(yǎng)液中含牛血清的體積分?jǐn)?shù)比為15% -20%、慶大霉素或卡那霉素24-32U/ml，
并調(diào)ra至8. o-9.2，其培養(yǎng)溫度為39-4rc。本設(shè)置，可以使用碳酸氫鈉調(diào)細(xì)胞培養(yǎng)液ra
到8. 0 8. 8之間，同時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入適量慶大霉素，以防止細(xì)菌污染。 進(jìn)一步設(shè)置是所述的步驟(3)要求收獲病毒液的病毒滴度不低于8. 0LgLD5。/ml，
本設(shè)置保證疫苗效力。 進(jìn)一步設(shè)置是所述步驟(5)疫苗的純化通過(guò)S印harose4FF柱層析法或高速區(qū)帶 離心來(lái)實(shí)現(xiàn)。 進(jìn)一步設(shè)置是步驟(1)中人二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)方式為采用細(xì)胞工廠培養(yǎng)或微載 體反應(yīng)器培養(yǎng)。由于本發(fā)明中人用二倍體細(xì)胞為附著依賴性細(xì)胞，細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程需附著 一定載體生長(zhǎng)，則本發(fā)明中細(xì)胞的培養(yǎng)方式可以采用細(xì)胞工廠培養(yǎng)，也可以使用微載體反 應(yīng)器培養(yǎng)。人用二倍體細(xì)胞在微載體反應(yīng)器中培養(yǎng)時(shí)，微載體使用量為22 27g/L，轉(zhuǎn)速為 55-120轉(zhuǎn)/分鐘。 本發(fā)明利用細(xì)胞工廠和微載體在這些人用二倍體細(xì)胞WI-38、 KMB17、 MR_90、 MRC-5、2BS上培養(yǎng)狂犬病毒，所制備的疫苗價(jià)格低廉，安全性高，免疫效果好，使用方便，純度高，適合大規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用。 下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步介紹。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō) 明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定，該領(lǐng)域的技術(shù)工程師可根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容對(duì) 本發(fā)明作出 一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。
實(shí)施例1
使用復(fù)蘇的人用二倍體細(xì)胞WI-38，細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液為MEM培養(yǎng)液，其中含有 15% -20%小牛血清和24-32u/ml的慶大霉素，調(diào)ffl至8. 0_9. 2，經(jīng)過(guò)10天后，細(xì)胞長(zhǎng)成致 密單層，棄去細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液，用0-7. 4的歐式平衡鹽液沖洗細(xì)胞面，再用吸附法接種狂犬 病毒PM株。所使用的PM株工作毒種，毒種用少量細(xì)胞維持液即含2X (w/w)人白蛋白的 MEM液稀釋，其ra為8.4-8.6。 31°C -35t:下吸附30分鐘后，再補(bǔ)加適量細(xì)胞維持液繼續(xù) 在37t: -401:下培養(yǎng)。收獲病毒液取樣進(jìn)行病毒滴度和無(wú)菌試驗(yàn)，要求收獲病毒液的病毒 滴度達(dá)到8. 0LgLD5。/ml以上。收獲的合格病毒液分裝至凍存管，lml/管，液氮保存?zhèn)溆谩?
實(shí)施例2
取體重11-13g清潔級(jí)昆明種小鼠，按本發(fā)明方法制備的人用二倍體細(xì)胞狂犬滅 活疫苗(HDCV)與市售原代地鼠腎細(xì)胞疫苗(PHKCV)、純化雞胚細(xì)胞疫苗(PCECV)和傳代 Vero細(xì)胞狂犬病疫苗進(jìn)行小鼠腹腔注射免疫2次，每次0. 5ml，間隔7天。首次免疫后14 天分別按5-100LD5。腦內(nèi)攻擊CVS病毒液0. 03ml ;同時(shí)以稀釋液腦內(nèi)注射0. 03ml攻擊的病 毒感染量于相同體重健康小鼠腦內(nèi)接種，測(cè)定病毒滴度(LDJ，攻擊后小鼠觀察14天，根據(jù) 動(dòng)物死亡數(shù)計(jì)算保護(hù)力。 表1不同疫苗免疫小鼠對(duì)腹腔攻擊的保護(hù)效果
疫苗免疫途徑免疫針次CVS毒株攻擊保護(hù)
HDCV腹腔210/10
PHKCV腹腔29/10
PCECV腹腔28/10
Vero細(xì)胞滅活疫苗腹腔29/10
未免疫對(duì)照--1/10 注存活動(dòng)物數(shù)/試驗(yàn)動(dòng)物數(shù) 從表1可看出，以腹腔途徑免疫后，HDCV能夠使小鼠對(duì)CVS株獲得完全保護(hù)，而 PHKCV、 PCECV、 Vero細(xì)胞滅活疫苗對(duì)CVS株的保護(hù)率為80% 90% ，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著 性差異(P < 0. 001)。試驗(yàn)結(jié)果初步表明，按本發(fā)明方法制備的人用二倍體細(xì)胞狂犬滅活疫 苗(HDCV)的保護(hù)效力等同或略高于其他方法生產(chǎn)的狂犬疫苗。
狂犬疫苗免疫原性及副反應(yīng)觀察 18-60歲之間，無(wú)犬、貓等動(dòng)物咬傷及抓傷史，無(wú)狂犬病疫苗與抗狂犬病血清使用
5史的健康成年人3000例，隨機(jī)分為人用純化狂犬病疫苗(HDCV)試驗(yàn)組和Vero細(xì)胞滅活純 化疫苗陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。常規(guī)5針法接種，HDCV組的抗體陽(yáng)性率為100%，陽(yáng)性對(duì) 照組的陽(yáng)性率為88. 55%，陰性對(duì)照組的陽(yáng)性率為1. 25%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異(P < 0.001)。說(shuō)明我們發(fā)明的人用純化狂犬病疫苗(HDCV)效果優(yōu)于Vero細(xì)胞滅活純化疫 苗，抗體陽(yáng)性率能達(dá)到100 % ，對(duì)人體有非常充分的保護(hù)效力。
權(quán)利要求
一種人用二倍體細(xì)胞狂犬滅活疫苗，其特征在于該疫苗在制備過(guò)程中是在人用二倍體細(xì)胞上接種培養(yǎng)PM狂犬病毒株，經(jīng)滅活純化得到的狂犬疫苗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人用二倍體細(xì)胞人用狂犬滅活疫苗，其特征在于所述的人用二倍體細(xì)胞是WI-38、KMB 17、 IMR-90、MRC-5、2BS。
3. —種人用二倍體細(xì)胞人用狂犬滅活疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1) 人用二倍體細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)及擴(kuò)增；(2) 在人用二倍體細(xì)胞上接種PM毒株；(3) 收獲病毒液；(4) 澄清超濾濃縮；(5) 病毒液滅活、純化；(6) 稀釋分裝并加入保護(hù)劑后凍干制成純化疫苗。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的人用二倍體細(xì)胞人用狂犬滅活疫苗的制備方法，其特征在 于所述的人用二倍體細(xì)胞是WI-38、KMB17、 IMR-90、MRC-5、2BS。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的人用二倍體細(xì)胞人用狂犬滅活疫苗的制備方法，其特征 在于步驟(1)中人二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)方式為采用細(xì)胞工廠培養(yǎng)或微載體反應(yīng)器培養(yǎng)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的人用二倍體細(xì)胞人用狂犬滅活疫苗的制備法，其特征在于 所述的步驟(1)所使用的細(xì)胞培養(yǎng)液為199培養(yǎng)液或MEM培養(yǎng)液，且該細(xì)胞培養(yǎng)液中含牛 血清的體積分?jǐn)?shù)比為15% -20%、慶大霉素或卡那霉素24-32U/ml，并調(diào)ffl至8. 0_9. 2，其 培養(yǎng)溫度為39-41°C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3或4或6所述的人用二倍體細(xì)胞人用狂犬滅活疫苗的制備方法，其 特征在于所述的步驟(3)要求收獲病毒液的病毒滴度不低于8. 0LgLD5。/ml。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的人用二倍體細(xì)胞人用狂犬滅活疫苗的制備方法，其特征在 于所述的步驟(3)要求收獲病毒液的病毒滴度不低于8. 0LgLD5。/ml。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的人用二倍體細(xì)胞人用狂犬滅活疫苗的制備方法，其特征在 于所述步驟(5)疫苗的純化通過(guò)S印harose 4FF柱層析法或高速區(qū)帶離心來(lái)實(shí)現(xiàn)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的人用二倍體細(xì)胞人用狂犬滅活疫苗的制備方法，其特征在 于所述步驟(5)疫苗的純化通過(guò)S印harose 4FF柱層析法或高速區(qū)帶離心來(lái)實(shí)現(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人用二倍體細(xì)胞狂犬疫苗及其制備方法，包括人用二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增，在人用二倍體細(xì)胞上培養(yǎng)狂犬病毒，其中狂犬疫苗還包括收獲病毒，病毒滅活，濃縮和純化等步驟。這種狂犬疫苗由于使用健康的人源二倍體細(xì)胞制備，不含任何外源污染因子和致瘤性，經(jīng)純化處理后疫苗純度高，具有免疫效果好、安全性高的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明所述人用二倍體細(xì)胞狂犬疫苗的制備方法是適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)且可滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)狂犬疫苗需求的制備方法。
文檔編號(hào)A61K39/205GK101716341SQ200910155068
公開日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月14日
發(fā)明者楊曉芳, 蔡勇 申請(qǐng)人:成都康華生物制品有限公司