專利名稱：人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是利用狂犬病毒PM株在人二倍體細胞上制備病毒液的方法。
背景技術(shù)：
狂犬病在100多個國家均有流行。全世界超過33億人居住在狂犬病流行地區(qū)，尤其是亞洲和非洲。人類感染狂犬病病毒后，一旦出現(xiàn)臨床癥狀幾乎100%死亡，99%的死亡由犬狂犬病造成，除家犬外很多肉食動物和蝙蝠也可以向人類傳播狂犬病病毒。亞洲是狂犬病高發(fā)地區(qū)，約占全球因犬傷所致人狂犬病死亡病例的90%。2000年，在亞洲15個狂犬病流行國家生活的31.1億人口中，約37000人死于狂犬病。大多數(shù)人由于暴露于狂犬病病毒潛在感染，而沒有接受治療或者注射任何疫苗而導(dǎo)致死亡。衛(wèi)生部2009年、2010年全國法定傳染病報告發(fā)病、死亡統(tǒng)計表中，狂犬病的死亡率第一，死亡數(shù)第三，狂犬病已成為我國最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。
根據(jù)我國人用狂犬病疫苗的使用量每年被動物傷害的人數(shù)超過1000萬人。為滿足我國國內(nèi)市場的需求，國內(nèi)很多廠家都在生產(chǎn)狂犬疫苗，主要包括原代地鼠腎細胞、原代雞胚細胞和Veix)傳代細胞疫苗。這些疫苗都存在異源蛋白，外源因子，DNA污染等各種不同的風(fēng)險因素。另外原代細胞培養(yǎng)需每批疫苗須檢查培養(yǎng)器官源的雜質(zhì)(細菌、支原體、病毒)，并且動物器官的可用量是限制工業(yè)化生產(chǎn)的因素；而Veix)細胞屬于猴源細胞，宿主 DNA殘留比較高，存在致瘤風(fēng)險。國外生產(chǎn)的人二倍體細胞狂犬病疫苗，如美國Wyeth廠，法國Sanofi Pasteur廠和德國Behring廠生產(chǎn)的二倍體疫苗,具有高免疫原性和良好的耐受性，和無異源蛋白的不良影響，目前在美國、加拿大、大多數(shù)歐洲國家和幾個亞洲國家使用。
因目前國內(nèi)人用二倍體狂犬病疫苗所使用的MRC-5細胞基質(zhì)來源于ATCC，而ATCC 明確指出僅供研究用，考慮到未來狂犬病疫苗工業(yè)化生產(chǎn)，故本研究所使用的MRC-5細胞來源于Sanofi Pasteur的細胞生產(chǎn)庫,Sanof i Pasteur的細胞生產(chǎn)庫是從NIBSC得到早代細胞建立而成的，狂犬病毒PM株亦購買于Sanofi Pasteur的病毒生產(chǎn)庫，MRC-5細胞和PM 病毒簽訂協(xié)議允許可用于狂犬病疫苗的生產(chǎn)。為本發(fā)明的大規(guī)模生產(chǎn)提供了有力的保障。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液制備方法。
本發(fā)明提供一種人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液制備方法，是在人用二倍體細胞上接種狂犬病毒PM株，培養(yǎng)病毒感染的人用二倍體細胞得到狂犬病毒液，所用的人用二倍體細胞是MRC-5。
本發(fā)明的人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液制備方法，包括如下步驟
( I) MRC-5細胞的復(fù)蘇與擴培；
(2 )在MRC-5細胞上接種狂犬病病毒PM株；
(3)接種PM毒株后的MRC-5細胞繼續(xù)傳代擴培；
(4)沖洗細胞，之后加入病毒培養(yǎng)液
(5)收獲病毒液。
其中，步驟(I)的MRC-5細胞在15 25°C的水浴中復(fù)蘇，5 9h后更換細胞培養(yǎng)液。
其中步驟(I)細胞擴增按照1:2 1:4的比例傳代擴增培養(yǎng)，得到細胞懸液。
其中，步驟(2)按照O. 05-0.1MOI接種狂犬病毒至細胞懸液，36°C _38°C水浴保溫 13-17min，之后繼續(xù)培養(yǎng)。
步驟(2)按照1:2 1:4的比例分種36 38°C培養(yǎng)20-25h后，調(diào)溫至33 36 °C繼續(xù)培養(yǎng)。
其中，步驟(3)的方法是先用PBS溶液洗滌細胞面，再用胰酶消化細胞，用細胞培養(yǎng)液重懸細胞，制成病毒細胞懸液。按照1:2 1:4的比例分種。
本發(fā)明的制備方法中，步驟(I)、(2)、(3)中MRC-5細胞培養(yǎng)液為含10°/Γ20%胎牛血清的BME培養(yǎng)液，pH值為6. 90 7. 20，滲透壓為30(T340mosm/kg，不含抗生素。
進一步地，步驟(I)、(2)、(3)細胞培養(yǎng)溫度為33 38°C。
進一步地，步驟(4)、(5)細胞培養(yǎng)溫度為33 36°C。
其中，步驟(4)中使用的沖洗液為BME液，pH值為6. 80^7. 10，滲透壓為 290-320mosm/kg,不含抗生素。
本發(fā)明方法步驟(4 )沖洗細胞分兩步，目的在于去除牛血清白蛋白，第一次沖洗細胞面，先用沖洗液沖洗表面，然后加入人白培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞16_20h后，進行第二次沖洗，用沖洗液沖洗細胞表面之后，加入病毒培養(yǎng)液培養(yǎng)3 4d,所述人白培養(yǎng)液為含O. 2%" . 5%人血白蛋白的BME液，pH值為6. 80-7. 10，滲透壓為290-320mosm/kg，不含抗生素。
本發(fā)明的制備方法中，步驟(4)中病毒培養(yǎng)液為含O. 29ΓΟ. 5%人血白蛋白的BME培養(yǎng)液，PH值為7. 30 8. 00，滲透壓為31(T350mosm/kg，不含抗生素。
本發(fā)明的步驟(5)中病毒液收獲是指經(jīng)過增殖收獲病毒細胞的上清液。單次收獲后，繼續(xù)補加O. 6-0. 9ml/cm2的病毒培養(yǎng)液繼續(xù)33°C _36°C培養(yǎng)。可連續(xù)收獲3至5次。
本發(fā)明提供的人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液制備方法，還包括病毒液收獲后進行濃縮的步驟。
其中，本發(fā)明的實施例中使用IOKB超濾膜包超濾進行濃縮，濃縮倍數(shù)為 10. (Γ20. O倍。濃縮后的濃縮液過濾后存放于2 8°C保存，不超過30天。
本發(fā)明方法中，步驟(5)中病毒液的滴度不低于6. 51gCCID5(l/ml，濃縮后病毒液的滴度不低于7. 51gCCID50/ml且效價不低于4. 0IU/ml。
本發(fā)明提供的在人用二倍體細胞MRC-5上接種狂犬病毒PM株，培養(yǎng)病毒感染的人用二倍體細胞得到狂犬病毒液的方法適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn) ，病毒液滴度穩(wěn)定。本發(fā)明的制備方法由于采用帶毒細胞連續(xù)傳代的工藝，延長了細胞的帶毒時間，提高了病毒液中病毒的收獲量，短時間內(nèi)達到希望的病毒量，從而縮短了制備工藝的時間，節(jié)省了狂犬病毒PM 株毒種的用量。另外，本發(fā)明制備得到的病毒液抗原含量高，病毒效價、滴度高，達到了本領(lǐng)域內(nèi)對人二倍體狂犬病疫苗病毒液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和效果的要求。本發(fā)明方法適合推廣使用。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
若未特別指明，實施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
實施例1人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液制備方法(I)
取含有MRC-5細胞的凍存管，迅速放入20°C水浴中融化，然后加入到預(yù)溫至25°C 的含20%胎牛血清細胞培養(yǎng)液(BME培養(yǎng)液，pH值為6. 90，滲透壓為300mosm/kg，不含抗生素)中，置于37°C培養(yǎng)，連續(xù)擴增至細胞長成致密的單層細胞。將單層細胞制備為細胞懸液，將狂犬病毒PM毒種按照O. 07M0I接種，37°C水浴保溫15分鐘后分裝按照1:3比例分裝培養(yǎng)22小時，然后調(diào)溫至35°C繼續(xù)培養(yǎng)，待病毒細胞長成單層后，先用PBS溶液洗滌細胞面，再用O. 01%胰酶消化細胞，消化病毒細胞制備成病毒細胞終懸液，按照1:2比列分裝 37°C培養(yǎng)23小時，然后調(diào)溫至35°C繼續(xù)培養(yǎng)48小時用沖洗液(BME液，pH值為7. 10，滲透壓為320mosm/kg，不含抗生素)第一次沖洗細胞面，加入人白培養(yǎng)液(含O. 5%人血白蛋白的 BME液，pH值為7. 00，滲透壓為300mosm/kg，不含抗生素)35°C培養(yǎng)19小時，再進行第二次細胞面沖洗，加入病毒培養(yǎng)液(含O. 5%人血白蛋白的BME培養(yǎng)液，pH值為7. 60，滲透壓為 320mOsm/kg，不含抗生素)35°C培養(yǎng)。病毒經(jīng)過4d增殖收集病毒細胞上清液.收集的病毒細胞上清液即為狂犬病毒液。
按以上方法，將狂犬病毒PM株連續(xù)在MRC-5細胞上傳7代，將病毒液做10倍系列稀釋至10_2后，再5倍系列稀釋，取12-14g的小鼠接種，每個稀釋度腹腔接種(IP)小鼠10 只，每只接種O.1ml ;每個稀釋度腦腔接種(IC)小鼠10只，每只接種O. 03ml。逐日觀察， 觀察14天。計算IC滴度LD5Q/0. 03ml和IP滴度LD5(l/0.1ml的比值，IC/IP比值應(yīng)不低于 1000。
將病毒液系列稀釋，在96孔微量培養(yǎng)板中和一定濃度的BHK21細胞共培養(yǎng)一段時間后，通過異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗狂犬糖蛋白的單克隆抗體檢測每孔中是否存在病毒， 通過熒光顯微鏡觀察，以計算病毒對細胞的半數(shù)感染劑量，用IgCCID5ciAil表示。
表I不同PM株代次傳代結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液制備方法，其特征在于，在人用二倍體細胞上接種狂犬病毒PM株，培養(yǎng)病毒感染的人用二倍體細胞得到狂犬病毒液，所述的人用二倍體細胞是MRC-5。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)MRC-5細胞的復(fù)蘇與擴培；(2)在MRC-5細胞上接種狂犬病病毒PM株；(3)接種PM毒株后的MRC-5細胞繼續(xù)傳代擴培；(4)沖洗細胞，之后加入病毒培養(yǎng)液(5)收獲病毒液。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)的MRC-5細胞在15-25°C的水浴中復(fù)蘇，5_9h后更換細胞培養(yǎng)液。
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)按照O.05-0.1MOI接種狂犬病毒至細胞懸液，36°C _38°C水浴保溫13-17min，之后繼續(xù)培養(yǎng)。
5.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)的方法是先用PBS溶液洗滌細胞面，再用胰酶消化細胞，用細胞培養(yǎng)液重懸細胞，制成病毒細胞懸液，培養(yǎng)2 3d。
6.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)、(2)、(3)中MRC-5細胞的培養(yǎng)液為含10% 20%胎牛血清的BME培養(yǎng)液，pH值為6. 90-7. 20，滲透壓為300-340mosm/kg， 不含抗生素。
7.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中病毒培養(yǎng)液為含O.29ΓΟ. 5% 人血白蛋白的BME培養(yǎng)液，pH值為7. 30-8. 00，滲透壓為310-350mosm/kg，不含抗生素。
8.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)沖洗細胞的方法為先用沖洗液沖洗細胞表面，所述沖洗液為BME液，pH值為6. 8(Γ7. 10，滲透壓為290-320mOsm/kg，不含抗生素；然后加入人白培養(yǎng)液培養(yǎng)16_20h，所述人白培養(yǎng)液為含O. 29ΓΟ. 5%人血白蛋白的BME液，pH值為6. 80-7. 10，滲透壓為290-320mosm/kg，不含抗生素；用沖洗液進行第二次細胞面的沖洗，之后加入病毒培養(yǎng)液培養(yǎng)3 4d。
9.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，還包括病毒液收獲后進行濃縮的步驟。
10.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，步驟5)中病毒液的滴度不低于.6.5LgCCID5Q/ml，濃縮后病毒液的滴度不低于7. 5LgCCID50/ml且效價不低于4. 0IU/ml。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液制備方法，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，是利用狂犬病毒固定毒PM-1503-3M株接種于MRC-5細胞，生產(chǎn)人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液。本發(fā)明方法工藝簡單，節(jié)約成本，制得的病毒液抗原含量高，病毒效價和滴度高，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，且可滿足國內(nèi)外市場對人二倍體狂犬病疫苗的需求。
文檔編號C12N7/00GK103060276SQ20131000968
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月10日
發(fā)明者左靜, 高正倫, 劉海文, 方群, 季振濤, 鄭森遠, 張騫, 劉勇, 張芮銘, 代凡, 吳淞, 張雪, 戴會忠, 劉雅靜, 王云達, 樊鵬 申請人:北京民海生物科技有限公司