專利名稱：：用作疫苗的融合抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種融合抗原。更具體而言，本發(fā)明涉及一種用作T-細(xì)胞疫苗的融合抗原。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)依賴T-淋巴細(xì)胞與載有T-細(xì)胞識(shí)別抗原的細(xì)胞之間的直接交互作用。在受感染的體細(xì)胞中，病毒利用細(xì)胞本身的合成機(jī)制在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，而T-細(xì)胞則識(shí)別受病毒感染的體細(xì)胞。然而，在病毒復(fù)制過程中所產(chǎn)生的抗原會(huì)出現(xiàn)在受感染細(xì)胞的表面(MHCI類)，被殺傷性T-細(xì)胞(CD8+T-細(xì)胞)識(shí)別，殺傷性T-細(xì)胞可在病毒復(fù)制完成前殺死細(xì)胞以控制感染。用于預(yù)防病毒感染的疫苗通常為活體減毒生物，其致病性雖已減弱，但可剌激保護(hù)性免疫。當(dāng)病毒復(fù)制形成內(nèi)源性加工肽時(shí)，用作減毒活疫苗的活病毒的外源蛋白在抗原呈遞細(xì)胞(APC)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)腔中被識(shí)別與加工。上述加工過程包括抗原修飾以及適度消化。然而，減毒活疫苗，尤其是RNA病毒，具有強(qiáng)烈的毒性和毒力恢復(fù)的傾向。例如，傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)的疫苗與減毒株兩者皆有毒性恢復(fù)的情形。此外，病毒必須經(jīng)歷多次傳代。因此其喚起免疫反應(yīng)的能力受到質(zhì)疑。開發(fā)減毒活疫苗是一項(xiàng)費(fèi)時(shí)的工程。為防止減毒活疫苗恢復(fù)毒性，正在開發(fā)如假狂犬病疫苗、gl基因缺失疫苗以及PRV標(biāo)記疫苗等基因缺陷疫苗。使用牛痘或禽痘的病毒或細(xì)菌作為攜帶抗原基因載體。通過DNA重組技術(shù)，可縮短優(yōu)良疫苗的研發(fā)時(shí)間，且可同時(shí)取得同一疫苗的多種血清型。這些疫苗的實(shí)例為禽痘病毒及沙門氏菌載體系統(tǒng)及美國(guó)的SyntroVet基因重組疫苗。另一方面，在使用微生物，尤其是RNA病毒，作為載體疫苗時(shí)，這些微生物會(huì)衍生新品種或新菌株。這些載體疫苗的安全性再次受到挑戰(zhàn)。此外，傳統(tǒng)重組亞單位疫苗對(duì)于觸發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)通常效果不彰。重組亞單位疫苗為外源性抗原，會(huì)被攝入巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞與B-淋巴細(xì)胞內(nèi)。這種來自外源性抗原且?guī)в忻庖咴砦坏碾氖窃诳乖高^液相胞飲作用或膜結(jié)合受體而內(nèi)化至APC之后產(chǎn)生。然后在APC的內(nèi)體區(qū)室中產(chǎn)生肽，并通過空的MHCII類分子將其分類，從而基于MHCII類分子與肽間的親合性，形成肽-MHCII類復(fù)合物。肽-MHCII類復(fù)合物然后易位至APC表面，以便被CD4+T-細(xì)胞識(shí)別。然而，由CD8+T-細(xì)胞識(shí)別的亞單位型蛋白并不能成為有效的疫苗，因?yàn)槠湟坏┦┯?，便被?nèi)化至內(nèi)體區(qū)室內(nèi)，且可能于該處大幅降解或無法與MHCI類途徑產(chǎn)生交互作用。此外，CD4+細(xì)胞(Th細(xì)胞)可分別通過Thl與Th2輔助T-細(xì)胞激活體液免疫反應(yīng)與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。Thl與Th2細(xì)胞可彼此調(diào)節(jié)以達(dá)到體液免疫與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的平衡?？筛腥救鏣-細(xì)胞、B-細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的免疫細(xì)胞的病毒已有相關(guān)發(fā)現(xiàn)與研究。這種感染豬的病毒的實(shí)例為豬生殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus)與II型環(huán)狀病毒，以及感染人的病毒的人免疫缺陷病毒。這些病毒在抗原呈遞細(xì)胞中關(guān)閉識(shí)別作為抗原的外源蛋白的能力。當(dāng)免疫細(xì)胞無法喚起免疫反應(yīng)并載運(yùn)病毒時(shí)，已被這些類型病毒感染的動(dòng)物極易受到其它病原體的二次感染。不幸的是，目前仍缺乏可針對(duì)感染病毒的免疫細(xì)胞產(chǎn)生作用的有效疫苗。尤其，豬生殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)每年皆對(duì)畜牧業(yè)造成高額損失。該病毒感染巨噬細(xì)胞(肺泡及脾臟內(nèi))、腦部小膠質(zhì)細(xì)胞及單核細(xì)胞，并存在于被感染動(dòng)物的血液及器官中?？贵w對(duì)此病毒的效果不大，甚至剌激病毒突變。在抗體依賴性增強(qiáng)作用(ADE)的機(jī)制中，抗體的使用反而引發(fā)更嚴(yán)重的感染。大約50%至80%的豬受到該種病毒感染。通常，被該病毒感染的動(dòng)物無明顯癥狀，但被感染動(dòng)物的免疫力降低。由于二次感染，這導(dǎo)致增重率降低與死亡率升高。PRRSV為一種RNA病毒。除了豬，鴨類亦可能感染PRRSV。目前已有用于抵抗PRRSV的減毒活疫苗問世。然而，病毒于活體疫苗中的突變經(jīng)常發(fā)生。所幸近期的HIV疫苗研發(fā)報(bào)告已明確指出殺傷性T-細(xì)胞(CTL)為控制HIV感染所必須(HanneG-Setal.，2000，Journalofvirology,volJ4，No.4.p.l694-1703)。開發(fā)一種安全有效的PRRS疫苗實(shí)為當(dāng)務(wù)之急。因此，如何解決現(xiàn)有技術(shù)的缺失與不足，尤其是研發(fā)可抵抗病毒感染的T-細(xì)胞疫苗，已是產(chǎn)學(xué)界刻不容緩之要?jiǎng)?wù)。
發(fā)明內(nèi)容在一個(gè)技術(shù)方案中，本發(fā)明涉及一種靶細(xì)胞特異性融合抗原，其包含(a)抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細(xì)胞上的受體反應(yīng)、識(shí)別該受體或者與該受體結(jié)合；(c)假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。該抗原部分源于豬生殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)ORFlb。在另一技術(shù)方案中，本發(fā)明涉及一種靶細(xì)胞特異性融合抗原，其主要由以下部分組成(a)抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細(xì)胞上的受體反應(yīng)、識(shí)別該受體或者與該受體結(jié)合；(c)假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。該抗原部分源于綜合征PRRSVORFlb。在又一技術(shù)方案中，本發(fā)明涉及一種靶細(xì)胞特異性融合抗原，其包含(a)抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細(xì)胞上的受體反應(yīng)、識(shí)別該受體或者與該受體結(jié)合；(c)假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。該抗原部分源于選自由馬動(dòng)脈炎病毒、II型環(huán)狀病毒、人免疫缺陷病毒、乳酸脫氫酶增高病毒以及猴出血熱病毒組成的組中的病原體。在又一技術(shù)方案中，本發(fā)明涉及一種靶細(xì)胞特異性融合抗原，其主要由以下部分組成(a)抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細(xì)胞上的受體反應(yīng)、識(shí)別該受體或者與該受體結(jié)合；(c)假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II;以及(d)羧基末端部分，其包含4具有氨基酸序列KDEL的多肽。該抗原部分源于選自由馬動(dòng)脈炎病毒、II型環(huán)狀病毒、人免疫缺陷病毒、乳酸脫氫酶增高病毒以及猴出血熱病毒組成的組中的病原體。圖IA說明PRRSVORFlb亞克隆片段Nspll(核苷酸10805核苷酸11297，上半部)與蛋白片段Nsp10及Nspll加K13的對(duì)應(yīng)的氨基酸序列(下半部)。圖IB說明圖1A中蛋白片段對(duì)應(yīng)的三字母氨基酸序列(SEQIDNO:1)。圖2說明M12-K13DNA片段的核苷酸序列(SEQIDNO:2)。圖3說明質(zhì)粒pPE-K13圖譜，其中PE代表PE(AIII)。圖4說明質(zhì)粒pPE-M12-K13圖譜，其中PE代表PE(AIII)。圖5說明融合抗原PE-M12-K13及PE-DgD-K13在免疫小鼠的脾細(xì)胞中誘發(fā)抗原特異性IFNY的分泌。圖6說明融合抗原PE-M12-K13及PE-DgD-K13在免疫小鼠的脾細(xì)胞中誘發(fā)抗原特異性TNFa的分泌。具體實(shí)施例方式本說明書通篇所用術(shù)語(yǔ)，其在本發(fā)明范圍內(nèi)及在本說明書特定上下文中的解釋大致均依照各術(shù)語(yǔ)于本領(lǐng)域中的通常涵義。本說明書中用以描述本發(fā)明之特定用語(yǔ)將于下文中或于本說明書他處加以說明，以利業(yè)界人士了解本發(fā)明的相關(guān)說明。為便于閱讀，特定用語(yǔ)可能以斜體字和/或引號(hào)等格式特別標(biāo)示。使用特別標(biāo)示并不影響該用語(yǔ)的范圍及意涵。這些用語(yǔ)不論是否經(jīng)特別標(biāo)示，其在相同上下文中之范圍及意涵仍為相同。在本文中，相同之文意可能以不同方式表達(dá)。因此，本文所述之用語(yǔ)皆可以其替代用語(yǔ)及同義詞代替，且一用語(yǔ)是否在本文中經(jīng)詳細(xì)說明或討論，并無任何特別意義。在此將提供特定用語(yǔ)的同義詞。各同義詞的使用不應(yīng)視為對(duì)其他同義詞的排除。本說明書所用的實(shí)例，包括在此所討論的任一用語(yǔ)的范例，僅供說明之用，而非用以限制本發(fā)明或任何示例用語(yǔ)的范圍與意涵。同樣地，本發(fā)明亦不限于在此所舉之實(shí)施例。除非另行定義，否則在此所用的所有技術(shù)與科學(xué)用語(yǔ)的意涵均與熟習(xí)本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域人士所普遍了解的相同。若有相互沖突之處，則以本說明書及其中所提供之定義為解釋依據(jù)。在此所述的"大約"、"約略"或"概為"一般指給出的數(shù)值或范圍的百分之二十以內(nèi)，較理想地為百分之十以內(nèi)，更理想地為百分之五以內(nèi)。在此所提供的數(shù)量為約略值，意指即便"大約"、"約略"或"概為"等用語(yǔ)未有書明之處，亦包含此等用語(yǔ)的涵義。本發(fā)明提供一種靶細(xì)胞特異性融合抗原，其包含抗原部分；配體部分，其能夠與所述靶細(xì)胞上的受體反應(yīng)、識(shí)別該受體或者與該受體結(jié)合；假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II;以及羧基末端部分，其使該融合抗原留存于該靶細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜內(nèi)。在此所用術(shù)語(yǔ)"融合抗原"指可在動(dòng)物體內(nèi)喚起免疫反應(yīng)的重組蛋白。較佳地，該融合抗原包含用于直接喚起免疫反應(yīng)的表位以及用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)(例如媒介傳遞、轉(zhuǎn)運(yùn)、加工及呈遞)或用于提供多重功能的其它部分。較佳地，該靶細(xì)胞為抗原呈遞細(xì)胞。更佳地，該靶細(xì)胞選自由T-細(xì)胞、b-細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞組成的組中。在此所用術(shù)語(yǔ)"抗原部分"指可喚起免疫反應(yīng)的肽片段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該抗原部分為表位。根據(jù)本發(fā)明，該抗原部分為致病物種的蛋白，其可高度激活免疫反應(yīng)。例如，這些蛋白質(zhì)包括但不限于外殼蛋白、核蛋白或細(xì)胞膜蛋白。該抗原部分可為直接從致病物種克隆的肽以及由本領(lǐng)域技術(shù)人員修飾以增強(qiáng)免疫反應(yīng)喚起能力的肽，從而成為方便制造與運(yùn)送的重組蛋白。較理想地，該抗原部分源于豬生殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、II型環(huán)狀病毒或人免疫缺陷病毒。較理想地，該抗原部分可為PRRSV0RF1、lb、2、3、4、5、6或7。在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施方式中，該抗原部分為PRRSVORFlb或M12冠狀區(qū)。為喚起更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，該抗原部分包含至少一個(gè)抗原單位，且以橋接區(qū)連接相鄰的抗原單位。根據(jù)本發(fā)明，該橋接區(qū)可為一小片段的肽，其喚起的免疫反應(yīng)微小至免疫系統(tǒng)無法辨別其存在的程度。在此所用術(shù)語(yǔ)"配體部分"一般指能夠與靶細(xì)胞上的受體進(jìn)行反應(yīng)、識(shí)別該受體或者與該受體結(jié)合的所有分子。這些受體的實(shí)例包括但不限于抗體受體、生長(zhǎng)因子受體、淋巴因子受體、細(xì)胞因子受體、激素受體等等。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，與配體部分結(jié)合的受體選自以下組成的組中TGFa受體、IL2受體、IL4受體、IL6受體、IGF1受體、CD4受體、IL18受體、IL12受體、EGF受體、LDL受體與a2-巨球蛋白受體。該配體部分具有與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合以將該融合抗原定位于所述靶細(xì)胞的能力。免疫系統(tǒng)系通過融合抗原與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合而啟動(dòng)。較佳地，該配體部分為假單胞菌外毒素A結(jié)合域I。假單胞菌外毒素A(PE)是由613個(gè)氨基酸組成的單一多肽鏈。PE分子的X光結(jié)晶學(xué)研究與突變分析顯示PE由三個(gè)區(qū)域組成氨基末端細(xì)胞受體結(jié)合域(區(qū)域I);中間易位結(jié)構(gòu)域(區(qū)域II);以及羧基末端活性域(結(jié)構(gòu)域III)(參見美國(guó)專利第5,705,163號(hào)，于此合并參照)。在此所用術(shù)語(yǔ)"假單胞菌外毒素A結(jié)合域I"指與假單胞菌外毒素A的氨基末端細(xì)胞受體結(jié)合域具有相同序列或者具有功能相當(dāng)片段的肽片段。假單胞菌外毒素A的氨基末端細(xì)胞受體結(jié)合域包含兩個(gè)亞域，分別命名為區(qū)域Ia及區(qū)域Ib。區(qū)域Ia及區(qū)域Ib的構(gòu)造可與細(xì)胞表面上的LDL受體或a2-巨球蛋白受體結(jié)合。在此所用術(shù)語(yǔ)"假單胞菌外毒素A結(jié)合域II"指與假單胞菌外毒素A的中間易位結(jié)構(gòu)域具有相同序列或具有功能相當(dāng)片段的肽片段。假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II具有將融合抗原易位至靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的功能。融合抗原在附著于靶細(xì)胞膜之后，易位至靶細(xì)胞中。在此所用術(shù)語(yǔ)"使融合抗原留存于靶細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)膜內(nèi)的羧基末端部分"指可使融合抗原與ER膜結(jié)合并將其留存于ER腔內(nèi)以實(shí)現(xiàn)醣基化作用并且使該融合抗原看來更接近外源蛋白的肽片段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該羧基末端部分包含以下氨基酸殘基，其沿從氨基端至羧基端的方向依序?yàn)镽、r2-R3-R4-(R5)11其中W為帶正電的氨基酸殘基；r2為帶負(fù)電的氨基酸殘基；R3為帶負(fù)電的氨基酸殘基；R4為L(zhǎng);R5為帶正電的氨基酸殘基；且n為0或1。較佳地，該羧基末端部分為KDEL家族蛋白中的成員。在此所用術(shù)語(yǔ)"KDEL家族蛋白"指一組蛋白質(zhì)，其具有與細(xì)胞ER膜結(jié)合的相似羧基端，并進(jìn)一步具有可將該蛋白質(zhì)留存于ER腔中的能力。通常，該羧基端之長(zhǎng)度介于416個(gè)殘基之間。如美國(guó)專利第5,705,163號(hào)(在此合并參照)所述，位于KDEL家族蛋白羧基端上的氨基殘基，尤其是最后五個(gè)氨基酸中的氨基殘基，占有十分重要的地位。根據(jù)針對(duì)存在于不同分子中且可執(zhí)行特定生物機(jī)能的相似序列所做的研究顯示，一種可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中留存新形成蛋白的序列為L(zhǎng)ysAspGluLeu(KDEL)(SEQIDNO:9)。此發(fā)現(xiàn)說明根據(jù)本發(fā)明的融合抗原的羧基端上的序列可作為某種類型的識(shí)別序列，協(xié)助融合抗原從內(nèi)吞區(qū)室易位至ER內(nèi)并將其留置于腔中。在一個(gè)較佳實(shí)施方式中，該羧基末端部分包含KDEL的序列(SEQIDNO:9)。在一更理想的實(shí)施方式中，該羧基末端部分包含KKDL-RDEL-KDEL的序列(SEQIDNO:5)、KKDELRDELKDEL的序列(SEQIDNO:6)或KKDELRVELKDEL的序列(SEQIDNO:7)或KKDEL-RXEL-KDEL的序列，其中R為D或V。本發(fā)明的特征在于羧基末端部分的設(shè)計(jì)，其使融合抗原能夠在靶細(xì)胞的ER內(nèi)被加工以與MHCI類分子結(jié)合，并由T-細(xì)胞加以識(shí)別。本發(fā)明的融合抗原具有觸發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的功效。根據(jù)本發(fā)明，該融合抗原用于動(dòng)物免疫。本發(fā)明的目的之一在于提供一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的融合抗原與可藥用載體。較理想地，該藥物組合物為T-細(xì)胞疫苗。在此所用術(shù)語(yǔ)"T-細(xì)胞疫苗"指可通過激活細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)來保護(hù)受試者免受感染的疫苗。殺傷性T-細(xì)胞(亦稱為殺傷性T-淋巴細(xì)胞、CD8+T-細(xì)胞和CTL)與記憶T-細(xì)胞(T。m及U為T-細(xì)胞疫苗的關(guān)鍵角色。本發(fā)明亦提供一種使動(dòng)物免疫的方法，該方法包括以下步驟(a)提供一種靶細(xì)胞特異性融合抗原，其包含抗原部分；配體部分，其能夠與所述靶細(xì)胞上的受體反應(yīng)、識(shí)別該受體或者與該受體結(jié)合；假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II;以及羧基末端部分，其使該融合抗原留存于該靶細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜中；以及(b)將該融合抗原接種于所述動(dòng)物體內(nèi)。在本方法的步驟(b)中，可以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式對(duì)動(dòng)物進(jìn)行接種。例如，可經(jīng)由注射或以口服疫苗的形式投送該融合抗原。并可視需要進(jìn)行后續(xù)補(bǔ)強(qiáng)疫苗注射。較理想地，在感染發(fā)生前進(jìn)行預(yù)防性接種。亦可對(duì)新生動(dòng)物，甚至是胚胎，進(jìn)行此融合疫苗的接種以助其提升免疫性。根據(jù)本發(fā)明，免疫反應(yīng)過程包括以下動(dòng)作(C)靶細(xì)胞膜與配體部分結(jié)合，從而將融合抗原定位于靶細(xì)胞；(d)融合抗原通過假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II易位至靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中；(e)靶細(xì)胞的ER膜與融合抗原的羧基末端部分結(jié)合，從而將融合抗原留置于ER腔中；7[OO53](f)抗原部分在ER腔中被加工；(g)加工后的抗原部分與MHCI類分子結(jié)合；(h)加工后的抗原部分由該MHCI類分子載運(yùn)至靶細(xì)胞表面；(i)由該MHCI類分子載運(yùn)的加工后的抗原部分經(jīng)CD8+T-細(xì)胞識(shí)別以取得免疫信息；以及(j)記憶T-細(xì)胞儲(chǔ)存該免疫信息以使該動(dòng)物免疫。在動(dòng)作(c)中，融合抗原的配體部分引導(dǎo)融合抗原與靶細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，以便將融合抗原定位于靶細(xì)胞。在動(dòng)作(d)中，融合抗原由假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II易位至靶細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中。此易位引導(dǎo)融合抗原進(jìn)入靶細(xì)胞。在動(dòng)作(e)中，融合抗原的羧基末端部分與靶細(xì)胞的ER膜結(jié)合，從而將融合抗原留存于ER腔中，以便加工融合抗原。在動(dòng)作(f)中，抗原部分在ER腔中接受加工。所謂加工包括但不限于在ER腔中進(jìn)行如醣基化和由酶適度消化的抗原修飾。在動(dòng)作(g)中，加工后的融合抗原可與MHCI類分子結(jié)合。MHCI類分子本身即為一種不完全折疊蛋白并且與許多伴侶蛋白結(jié)合。加工后的融合抗原與肽結(jié)合槽裂進(jìn)行結(jié)合以完成折疊，且促進(jìn)伴侶蛋白的釋放。在動(dòng)作(h)中，處理后的抗原部分通過MHCI類分子呈現(xiàn)于靶細(xì)胞表面。折疊后的MHCI類分子與加工后的抗原部分被送至細(xì)胞表面。在動(dòng)作(i)中，由MHCI類分子所載運(yùn)的加工后的抗原部分經(jīng)CD8+T-細(xì)胞識(shí)別以取得免疫信息，該免疫信息系用于殺傷性T-細(xì)胞的識(shí)別且該免疫信息系存入記憶T-細(xì)胞中。記憶T-細(xì)胞之實(shí)例為Tcm以及Tem細(xì)胞。在動(dòng)作(j)中，免疫信息被存入記憶T-細(xì)胞以使動(dòng)物免疫。當(dāng)已接受該融合抗原免疫的動(dòng)物再次感染相同抗原時(shí)，記憶T-細(xì)胞可在短時(shí)間內(nèi)喚起更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。T-細(xì)胞疫苗提供內(nèi)源加工抗原，其可在靶細(xì)胞的ER腔內(nèi)加工。在一個(gè)技術(shù)方案中，本發(fā)明提供一種靶細(xì)胞特異性融合抗原，其包含(a)抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細(xì)胞上的受體反應(yīng)、識(shí)別該受體或者與該受體結(jié)合；(c)假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。在另一技術(shù)方案中，本發(fā)明涉及一種靶細(xì)胞特異性融合抗原，其主要由以下部分組成(a)抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細(xì)胞上的受體反應(yīng)、識(shí)別該受體或者與該受體結(jié)合；(c)假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。在又一技術(shù)方案中，本發(fā)明涉及一種靶細(xì)胞特異性融合抗原，其包含(a)抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細(xì)胞上的受體反應(yīng)、識(shí)別該受體或者與該受體結(jié)合；(c)假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。該抗原部分源于選自由馬動(dòng)脈炎病毒、II型環(huán)狀病毒、人免疫缺陷病毒、乳酸脫氫酶增高病毒以及猴出血熱病毒組成的組中的病原體。在又一技術(shù)方案中，本發(fā)明涉及一種靶細(xì)胞特異性融合抗原，其主要由以下部8分組成(a)抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細(xì)胞上的受體反應(yīng)、識(shí)別該受體或者與該受體結(jié)合；(C)假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。該抗原部分源于選自由馬動(dòng)脈炎病毒、II型環(huán)狀病毒、人免疫缺陷病毒、乳酸脫氫酶增高病毒以及猴出血熱病毒組成的組中的病原體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該抗原部分源于豬生殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)ORFlb。該抗原部分可包含具有SEQIDNO:1所述的氨基酸序列的多肽。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，該抗原部分包含多肽，該多肽是包含SEQIDNO:2所述的核苷酸序列的DNA片段的翻譯產(chǎn)物。在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中，該抗原部分源于PRRSVNsplO與Nspll。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該配體部分為假單胞菌外毒素A結(jié)合域I。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，該羧基末端部分包含具有氨基酸序列KKDELRXELKDEL的多肽，其中X為V或D。該羧基末端部分可經(jīng)由限制酶切位點(diǎn)接頭而與該抗原部分連接。在另一技術(shù)方案中，本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含如上所述的融合抗原以及可藥用載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該藥物組合物包含第一融合抗原，其中第一融合抗原包含(a)源于PRRSVORFlb的抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細(xì)胞上的受體反應(yīng)、識(shí)別該受體或者與該受體結(jié)合；(c)假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。該藥物組合物可進(jìn)一步包含靶細(xì)胞特異性第二融合抗原，其中第二融合抗原包含(a)源于PRRSVORF7的抗原部分；(b)配體部分，其能夠與所述靶細(xì)胞上的受體反應(yīng)、識(shí)別該受體或者與該受體結(jié)合；(c)假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。在另一技術(shù)方案中，本發(fā)明再涉及一種在動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)免疫反應(yīng)以對(duì)抗病原體感染的方法。該方法包括以下步驟(a)提供上述之一種藥物組合物；以及(b)將該融合抗原接種于所述動(dòng)物體內(nèi)，其中該免疫反應(yīng)針對(duì)所述病原體，所述抗原部分源于該病源體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式例中，本方法提供一種包含融合蛋白的組合物，該融合蛋白以抗原呈現(xiàn)細(xì)胞為特定標(biāo)靶。例如，該靶細(xì)胞可選自由T-細(xì)胞、B-細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞組成的組中。實(shí)施例以下所述者僅為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所提供之例示用設(shè)備、器材、方法與相關(guān)結(jié)果，不應(yīng)視為本發(fā)明的限制。各實(shí)施例的標(biāo)題或子標(biāo)題僅為方便閱讀之用，亦不應(yīng)視為本發(fā)明之限制。此外，只要本發(fā)明系據(jù)其本身實(shí)施，不論基于任何特定學(xué)說或?qū)嵭蟹桨福皇茉诖怂鶖⒓暗奶囟▽W(xué)說的限制，且與所述學(xué)說正確與否無涉。材料及方法質(zhì)粒構(gòu)建pPE-M12-K13。質(zhì)粒pPE-M12-K13包含作為抗原部分的冠狀區(qū)M12;作為配體部分的PE(AIII)與易位部分；以及作為羧基末端部分的K13。該M12區(qū)序列位于PRRSVORFlb基因中。該P(yáng)RRSVORFlb序列是從EMBL/GenBank核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)登錄碼第M96262號(hào)中選取。亞克隆M12片段源于PRRSVNsplO(C末端區(qū)序列)與Nspll(N末端區(qū)序列)?？乖糠諴RRSVM12(或ORFlb亞克隆片段)是以表一所列的特定引物合成。為了產(chǎn)生質(zhì)粒pPE-M12-K13，通過AatII與EcoRl位點(diǎn)插入將PRRSVORFlbDNA片斷nt1080511297亞克隆至pPE-K13質(zhì)粒中。圖1A顯示M12加K13的蛋白片段，其中限制酶切位點(diǎn)以粗體字表示。圖1A中蛋白質(zhì)片段所對(duì)應(yīng)的三字母氨基酸序列則顯示于圖1B中(SEQIDNO:1)，其中K13序列以下方劃線的粗體字表示，而限制酶切位點(diǎn)以及Xhol與K13序列間的短橋則以粗體斜字表示。圖2顯示包含M12(亦即PRRSNsp10加Nspll基因)及K13的M12-K13DNA片段的核苷酸序列(SEQIDNO:2)。圖3顯示質(zhì)粒pPE-K13，而圖4則顯示包含M12區(qū)(亦即冠狀區(qū))的質(zhì)粒pPE-M12-K13。pPE-K13。質(zhì)粒pPE-K13包含作為配體部分加易位部分的PE(AIII);以及作為羧基末端部分的K13(圖3)。該P(yáng)E(AIII)(在圖3中標(biāo)示為PE)包含假單胞菌外毒素A結(jié)合區(qū)域I與易位結(jié)構(gòu)域II。質(zhì)粒pPE(AIII)是根據(jù)美國(guó)專利公開案第2004/0247617號(hào)所述方法構(gòu)建而成，該專利公開案的全文在此以引用的方式并入本文。該K13羧基末端部分包含肽序列KKDELRVELKDEL(SEQIDNO:7)，其由該K13片段是以上開美國(guó)專利公開案的方法稍加修改而制成，該專利公開案的全文系以引用的方式并入本文。簡(jiǎn)言之，通過連續(xù)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)合成編碼SalI位點(diǎn)-KKDELRVELKDEL-終止密碼子-XhoI-EcoRI序列的多核苷酸。該等PCR-擴(kuò)增的DNA片段以Sail及EcoRI使其切開，再以凝膠電泳及電洗脫純化。純化后的SalI-EcoRIDNA片段與pPE連接即形成質(zhì)粒pPE-K13。pPE-DgD-K13。該編碼PE-DgD-K13的質(zhì)粒是以美國(guó)專利申請(qǐng)第10/457,574號(hào)所述的方法稍加修改而制成。簡(jiǎn)言之，以PstI及XhoI消化兩種質(zhì)粒pET15-H6-PE(AIII)PRRS7-DgD與pPE-K13，從而分別產(chǎn)生包含PE(AIII)PRRS7-DgD的片段與包含羧基末端部分的片段。繼而將兩種片段純化，再通過T4連接酶進(jìn)行連接，即形成pET23-H6-PE(AIII)-DgD-K13(名為pPE-DGDK13或pPE-DgD-K13)。質(zhì)粒pET23-K3、pET-K13或pPE(AIII)-K13皆包含KDEL序列。pPE-ORF5-K13。此可編碼PE-ORF5-K13的質(zhì)粒根據(jù)上述方法制成。簡(jiǎn)言之，將PRRSVORF5基因插入pPE(AIII)-K13以構(gòu)建pPE-ORF5-K13。融合抗原的表達(dá)與純化。在37t:含有100500ppm氨芐青霉素的LuriaBertani培養(yǎng)液中培養(yǎng)用融合抗原質(zhì)粒轉(zhuǎn)化以表達(dá)融合蛋白PE-ORF5-K、PE-DgD-K13或PE-M12-K13的大腸桿菌(BL21(DE3)pLys細(xì)胞)。在大腸桿菌培養(yǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期前期(A600=0.10.4)后，在培養(yǎng)物中加入終濃度為0.5mM的異丙基-1-硫代-P-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)以發(fā)揮誘發(fā)作用。誘發(fā)兩小時(shí)后收獲細(xì)胞并立即儲(chǔ)存于零下7(TC。利用前人已披露的尿素粹取技術(shù)(Liao等人，1995，Appl.MicrobiolBiotechnol.43:498-507)，將融合抗原部分純化。將包含6組胺酸標(biāo)記(6Histag)的融合抗原分子完全曝露于變性條件下，以加強(qiáng)其與eNi-NTA基質(zhì)(Ni-NTA瓊脂糖；QiagenInc.CA)的結(jié)合。因此通過降低非特異性性結(jié)合的可能性，使純化作用達(dá)到最大效率。以下將說明如何在變性條件下為來自大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)的6組胺酸標(biāo)記融合抗原進(jìn)行分批純化。將1毫升50%Ni-TNA漿加入4毫升溶胞產(chǎn)物中，并且室溫下以輕搖方式(如200rpm)混合60分鐘以形成溶胞產(chǎn)物-樹脂混合物。將該溶胞產(chǎn)物-樹脂混合物小心裝入仍附有底蓋的空管柱中，然后移除底蓋以收集從中流過的溶液。以4毫升洗滌緩沖液(100mMNaH2PO4，10mMTris-HCl，8M尿素，pH8.0)沖洗兩次。利用0.5毫升、pH5.9的洗脫緩沖液(100mMNaH2PO4，10mMTris-HCl，8M尿素，pH5.9)洗脫蛋白質(zhì)四次，接著再以0.5毫升、pH4.5的洗脫緩沖液(100mMNaH.sub.2PO.sub.4，10mMTris-HCl，8M尿素，pH4.5)進(jìn)行洗脫四次。將收集的級(jí)分集中在一起，并以SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分析。利用標(biāo)準(zhǔn)BAS蛋白進(jìn)行定量分析。表二引物SEQIDNO:序列M12-F1105，-TGGCCGGTGGTGTCAACCCAGAACAATGAAAAGTGGCCGGATCGTCTG-3'M12-F25'^CAGTTTGCCAAACTCCCAATAGAACTTGCACCACACTGGCCGGTGGTGTCA-3'M12-F3125'國(guó)AACTTGGGTTTTTATTTTTCACCTGAGTTGACACAGTTTGCCAAACTC-3'M12-F4135'-GGGTCGAGCTCTCCGCTCCCGAAGGTCGCACACAACTTGGGTTTTTAT-3'M12-F5145，-TCTCTCCGCGCCATTTGTGCTGATCTGGAAGGGTCGAGCTCTCCG-3'M12-F6IS5'-GATAAATTTCGTGCCACAGACAAGCGTGTTGTAdATTCTCTCCGCGCCATT-3'M，2-F75'-ACGGTTGCTCAGGCTCTGGGCAACGOGGATAAATTTCGTGCC-3'Mi2-FS175'-CCCCCCGACGTCAATAACAAAGAATGCACXJGTTGCTCAGGCT-3'謹(jǐn)2-Rl185，-GCGGCTGTATTTGTCGAGAGGGCGAAGGCTGGCAACCAGACGATCCGGCCA-3'M12-R2S，-AGGGCCCACCATATAGCCGGCACCGATGCACGCGCGGCTGTATTTGTC-3'M12-R3205'-GTATGACACGACCCCTGGAGTGCCCAGAAACACCGAAGGGCCCACCATATA-3'M12"R45'-AGCCTCGCCCTTAACAAACTTTGTGAGATAGTATGACACGACCCC-3'M12-R5225，-TCGGCCGGTACTGAAGACCGTTTCC衡AAGCACTTGAGCCTCGCCCTTAAC-3'滅12-R6235'-GATATTCACGGCAGTCTACCTCAATTTOGOCGGTACTGAA-3'M12-R7245，-ACGCAGCAACTTCTCGCTCACGATCATCAAGATATTCACGGCAGTC-3'M12-RS255，-TTTTTTCTCGAGGAATTCGTGTGGGAGGGA^_CGCAGCAACTTCTCG-3'_':M12-F1及M12-R1分別代表第一對(duì)正向引物與反向引物；M12-F2及M12-R2分別代表第二對(duì)正向引物與反向引物，以此類推。實(shí)施例1由PRRSV融合抗原誘發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)本發(fā)明旨在發(fā)現(xiàn)PRRS病毒蛋白中可誘發(fā)動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的抗原或表位部位，并利用那些抗原生產(chǎn)作為疫苗的融合抗原以使動(dòng)物免疫，誘發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生足量的IFNY及TNFa，并激活T-細(xì)胞免疫與殺傷性T-細(xì)胞路徑。本發(fā)明披露可誘發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫機(jī)制的融合抗原PE-DgD-K13(或PE-PRRSV0RF7)以及PE-M12-K13。在免疫小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校l(fā)現(xiàn)PE-DgD-K13和/或PE-M12-K13可誘發(fā)脾細(xì)胞的細(xì)胞免疫機(jī)11制。分別接種PE-M12-K13與PE-DgD-K13的小鼠與對(duì)照組的小鼠相比較，均產(chǎn)生IFNY與TNFa分泌增加的情形。由ORF5及ORF6N-端-K13組成的融合抗原PE-PQGAB-K13對(duì)于誘發(fā)IFNY與TNFa分泌的效果不大(圖5及圖6)。ORFlb基因在病毒細(xì)胞增殖前的之復(fù)制過程中起重要作用。融合抗原PE-DgD-K13或PE-DgD-K3及PE-M12-K13或PE-M12-K3為PRRSV疫苗最重要的主要成份。根據(jù)先前的PRRSV攻擊研究與血液樣本測(cè)試結(jié)果，發(fā)現(xiàn)PE-DgD-K3能夠激活幼豬免疫保護(hù)，預(yù)防幼豬感染病毒血癥。實(shí)施例2PRRS融合抗原的劑量幼豬于一周、兩周及五周大時(shí)分別施用l毫克抗原，總共免疫接種三次。最后一次免疫接種之后兩周，測(cè)量特異性抗體IgG、IgA與IgM的滴定度。發(fā)現(xiàn)，抗體的滴定度在兩次免疫接種后到達(dá)高峰。三次免疫接種后的抗體滴定度相較于兩次接種后并未產(chǎn)生明顯變化。若對(duì)幼豬施以0.050.5毫克，而更理想地為0.10.3毫克含有融合抗原PE-M12-K13的疫苗組合物，在二次免疫接種后發(fā)生顯著的抗體反應(yīng)，且抗體在三次免疫接種后到達(dá)高峰。實(shí)施例3以PE-M12-K13與其它融合抗原混合調(diào)配而成的疫苗組合物針對(duì)PRRS病毒攻擊的預(yù)防動(dòng)物。豬只取自無特定病原體(SPF)的農(nóng)場(chǎng)的畜群，該農(nóng)場(chǎng)定期以RT-PCR技術(shù)檢測(cè)PRRSV，且已知無此病毒。實(shí)驗(yàn)前，SPF農(nóng)場(chǎng)的母豬已確認(rèn)無病毒血癥。此外，SPF農(nóng)場(chǎng)母豬的Index-RRRS診斷試劑測(cè)試結(jié)果亦呈陰性。RNA提取。為檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)是否存有PRRSV，收集動(dòng)物血漿成分并利用NUCLEOSPINRNA11頂試劑盒提取RNA以進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)(Macherey-NagelGmbH&Co.KG，德國(guó))。簡(jiǎn)言之，將350微升RAl溶液與3.5iUI3-巰乙醇加入100iU血漿成分中。在粘度降低并經(jīng)過濾使溶胞產(chǎn)物澄清后，將溶胞產(chǎn)物與350iU的70X乙醇混合。以離心方式將RNA吸附于NucleospinRNA管柱中，之后加以洗滌。將95微升的DNA酶溶液加入管柱中進(jìn)行DNA消化。重復(fù)洗滌與離心作業(yè)數(shù)次后，再以60iU不含RNA酶的水洗脫出RNA。病毒的RT-PCR檢領(lǐng)U。利用OnestepRT-PCRKit(QiagenInc.,美國(guó)加州)進(jìn)行RT-PCR來檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)是否存有PRRSVRNA。提供正向引物5'-CCAGCCAGTCAATCAGCTGTG-3'(SEQIDNO:3)與反向引物5'-GCGGATCAGGCGCAC-3'(SEQIDNO:4)以合成293-bp的片段。以瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RT-PCR的檢測(cè)極限約為10個(gè)拷貝的PRRSV(TCID5。/毫升)。免疫作用。從SPF農(nóng)場(chǎng)中挑選三至四只母豬所產(chǎn)的新生幼豬，分別標(biāo)定身分、稱重及判定性別。將幼豬隨機(jī)分為六組，每組包括來自各母豬的共五或六只幼豬。以含有一種或多種融合抗原(亦即混合或未混合)的疫苗組合物或載體對(duì)幼豬以體重分層的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行接種。分別在哺乳階段中4天大與至8天大時(shí)，以肌肉注射方式免疫接種2ml疫12苗組合物，共接種兩次，其中該疫苗組合物含有l(wèi)毫升乳化于lmlISA206(SEPPIOD，法國(guó))中的融合抗原(50100yg每抗原成分/劑)。對(duì)照組則未接種，如常飼養(yǎng)。在斷奶階段時(shí)(約三至四周齡)，將各組幼豬移往設(shè)有空調(diào)與通風(fēng)設(shè)備的單獨(dú)的隔離室。PRRSV攻擊。最后一次接種之后兩周，分別利用氯胺酮(Ketamine)(100mg，IM注射)與2^利多卡因(Lidocaine)(lml，鼻腔滴注)對(duì)幼豬進(jìn)行鎮(zhèn)靜及咳嗽反射抑制，而后透過鼻腔進(jìn)行PRRSV攻擊。將lml包含PRRSVMD-1新鮮病毒株(其每毫升50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCIDJ為1X10"的接種物，經(jīng)由鼻腔路徑施用于每組中五只幼豬。病毒攻擊后的RT-PCR。為檢測(cè)病毒攻擊后血液中PRRSV的水平，在第二次免疫接種的兩周后以RT-PCR法檢測(cè)幼豬的血液白血球樣本(從全血中層析而得)。在攻擊后第三、七及十四天分別取幼豬的血液白血球樣本再次進(jìn)行PRRSV的RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果。在病毒攻擊前，所有幼豬的RT-PCR血液樣本測(cè)試結(jié)果均呈PRRSV陰性。因此，在PRRSV攻擊前，對(duì)照組并未發(fā)生病毒血癥。在PRRSV攻擊的五天后(DPI-5)，對(duì)照組幼豬的血液樣本開始出現(xiàn)病毒血癥的征象。在PRRSV攻擊大約兩周后，對(duì)照組所有幼豬皆出現(xiàn)病毒血癥(表二，BK-1中五只全數(shù)患病，BK-2中六只全數(shù)患病)。明顯的病毒血癥癥狀持續(xù)一段時(shí)間。幼豬血液樣本在PRRSV攻擊兩周后是否出現(xiàn)病毒血癥為評(píng)估疫苗效力的重要指標(biāo)。若未測(cè)得病毒血癥，表示疫苗發(fā)揮作用。詳言之，在接種含有PE-M12-K13、PE-ORF5-K13與PE-DgD-K13混合物的疫苗組合物的組中共有六只幼豬，僅一只的血液樣本呈PRRSV陽(yáng)性反應(yīng)。部分接受PE-M12-K13疫苗接種的組在病毒攻擊后第十四天(DPI-14)開始呈現(xiàn)病毒血癥清除反應(yīng)，如表二所示。表二顯示動(dòng)物組在PRRSV攻擊后的檢測(cè)結(jié)果。接受PE-M12-K13疫苗接種的幼豬于PRRSV攻擊后之第七天，三只中即有一只攻擊出現(xiàn)病毒血癥，但病毒血癥在攻擊后第21天已被清除。在接種含有PE-M12-K13、PE-DgD-K13與PE-ORF5-K13混合物的疫苗組合物的組中，六只中有一只于PRRSV攻擊后的第7天出現(xiàn)病毒血癥，而病毒血癥在攻擊后第21天也已被清除。因此，可能PE-DgD-K13(或-K3)及PE-M12-K13(或-K3)對(duì)于動(dòng)物的病毒感染保護(hù)有其效果，但PE-ORF5-K13(或-K3)在此條件下并未能提升保護(hù)效果。表二SPF幼豬模型中PRRSV攻擊后的病毒血癥測(cè)試結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>'"BK"代表未接種疫苗的對(duì)照組。實(shí)施例4由PRRSV攻毒所引致之肺部病變以變異數(shù)分析法(ANOVA)判定接種與未接種疫苗的動(dòng)物組在間質(zhì)性肺炎指標(biāo)差異的統(tǒng)計(jì)顯著性。統(tǒng)計(jì)分析顯示，接種以單一PE-PRRSV融合抗原PE-M12-K13構(gòu)成的疫苗組合物的動(dòng)物，其肺部組織切片呈現(xiàn)輕微的間質(zhì)性肺炎嚴(yán)重度。就含有一種以上單一PRRSV融合抗原的疫苗組合物而言，含有PE-DgD-K13與PE-M12-K13混合物的疫苗組合物對(duì)于肺病癥狀具有有效的防護(hù)作用。從接受PE-DgD-K13與PE-M12-K13疫苗接種的幼豬所取得的肺部組織切片，其間質(zhì)性肺炎的嚴(yán)重度較輕。歸納上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可證實(shí)包含PE-M12-K13的疫苗組合物具有以下功效L產(chǎn)生有效的病毒血癥清除反應(yīng)。II.不含其它PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白的疫苗組合物有效減少可能由PRRS病毒所引發(fā)的副作用。III.具有誘發(fā)細(xì)胞免疫機(jī)制的效用。利用ORFlb，可產(chǎn)生融合蛋白抗原PE-M12-K13，并有效誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生INFY與TNFa細(xì)胞因子，發(fā)揮清除病毒感染的作用。本案所參照的所有前案，其全文均以引用的方式并入本文。以上說明為本發(fā)明的實(shí)施范例，其作用僅在于說明，其所揭示者并未窮盡本發(fā)明之所有可能型態(tài)，且本發(fā)明的實(shí)施亦不限于所述型態(tài)。依據(jù)以上教示，可能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的多種修改及變化。此處所述實(shí)施方式與實(shí)施例的選用及敘述為闡明本發(fā)明的原理與這些原理的應(yīng)用，以便使本領(lǐng)域技術(shù)人員利用本發(fā)明及依據(jù)實(shí)際需要以不同實(shí)施方式或各種領(lǐng)域修改實(shí)現(xiàn)本發(fā)明之技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在不違本案精神之情況下，輕易想見多種替代實(shí)施例。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)取決于所附權(quán)利要求書，而非由上述實(shí)施例加以界定。序列表<110>生寶生物科技股份有限公司財(cái)團(tuán)法人臺(tái)灣動(dòng)物科技研究所<120>用作疫苗的融合抗原<130>TI08-1898-XC37<140>200810178914.1<141>2008-ll-27<150>US11/948,327<151>2007-ll-30<160>25<170>PatentInversion3.3<210>1<211>186<212>PRT<213>人工序列<220>14<223>PRRSVORFlbM12區(qū)(部分NsplO和Nspll)加K13的氨基酸序列<400>1AspValAsnAsnLysGluCysThrValAlaGinAlaLeuGlyAsnGly151015AspLysPheArgAlaThrAspLysArgValValAspSerLeuArgAla202530lieCysAlaAspLeuGluGlySerSerSerProLeuProLysValAla354045HisAsnLeuGlyPheTyrPheSerProAspLeuThrGinPheAlaLys505560LeuProlieGluLeuAlaProHisTrpProValValSerThrGinAsn65707580AsnGluLysTrpProAspArgLeuValAlaSerLeuArgProLeuAsp859095LysTyrSerArgAlaCyslieGlyAlaGlyTyrMetValGlyProSer100105110ValPheLeuGlyThrProGlyValValSerTyrTyrLeuThrLysPhe115120125ValLysGlyGluAlaGinValLeuProGluThrValPheSerThrGly130135140ArglieGluValAspCysArgGluTyrLeuAspAspArgGluArgGlu145150155160ValAlaAlaSerLeuProHisGluPheLeuGluTyrLeuLysLysAsp165170175GluLeuArgValGluLeuLysAspGluLeu180185<210>2<211>549<212>DNA<213>人工序列<220><223>PRRSVORFlbM12區(qū)(部分NsplO和Nspll)加K13的核苷酸序列:0169]<400>2:0170]gacgtcaataacaaagaatgcacggttgctcaggctctgggcaacggggataaatttcgt60:0171]gccacagacaagcgtgttgtagattctctccgcgccatttgtgctgatctggaagggtcg120:0172]agctctccgctcccgaaggtcgcacacaacttgggtttttatttttcacctgacttgaca180:0173]cagtttgccaaactcccaatagaacttgacccacactggccggtggtgtcaacccagaac240:0174]aatgaaaagtggccggatcgtctggttgccagccttcgccctctcgacaaatacagccgc300:0175]gcgtgcatcggtgccggctatatggtgggcccttcggtgtttctgggcactccaggggtc36015<400>11c敏ttgccaaactcccaatagaacttgcaccacactggccggtggtgtca<210>12<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物M12-F3<400>12aacttgggtttttatttttcacctgacttgacacagtttgccaaactc<210>13<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物M12-F4<400>13gggtcgagctctccgctcccgaaggtcgcacacaacttgggtttttat<210>14<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物M12-F5<400>14tctctccgcgccatttgtgctgatctggaagggtcgagctctccg<210>15<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物M12-F6<400>15gataaatttcgtgccacagacaagcgtgttgtagattctctccgcgccatt<210>16<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物M12-F7<400>16acggttgctcaggctctgggcaacggggataaatttcgtgcc42<210>17<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物M12-F8<400>17ccccccgacgtcaataacaaagaatgcacggttgctcaggct42<210>18<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物M12-R1<400>18gcggctgtatttgtcgagagggcgaaggctggcaaccagacgatccggcca51<210>19<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物M12-R2<400>19agggcccaccatatagccggcaccgatgcacgcgcggctgtatttgtc48<210>20<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物M12-R3<400>20gtatgacacgacccctggagtgcccagaaacaccgaagggcccaccatata51<210>21<211>45<212>DNA<213>人工序列19]<220><223>反向引物M12-R4<400>21agcctcgcccttaacaaactttgtgagatagtatgacacgacccc<210>22<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物M12-R5<400>22tcggccggtactgaagaccgtttccggaagcacttgagcctcgcccttaac51<210>23<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物M12-R6<400>23gatattcacggcagtctacctcaattcggccggtactgaa40<210>24<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物M12-R7<400>24acgcagcaacttctcgctcacgatcatc^gatattcacggc紹tc46<210>25<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物M12-R8<400>25ttttttctcgaggaattcgtgtgggagggacgcagcaacttctcg4520權(quán)利要求一種靶細(xì)胞特異性融合抗原，包含a.抗原部分；b.配體部分，其能夠與所述靶細(xì)胞上的受體反應(yīng)、識(shí)別該受體或者與該受體結(jié)合；c.假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II；以及d.羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽；其中，所述抗原部分源于豬生殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)ORF1b。2.如權(quán)利要求1所述的融合抗原，其中，所述抗原部分源于PRRSVNsplO與Nspll。3.如權(quán)利要求1所述的融合抗原，其中，所述抗原部分包含具有SEQIDNO:l所述氨基酸序列的多肽。4.如權(quán)利要求1所述的融合抗原，其中，所述抗原部分包含多肽，該多肽是具有SEQIDNO:2所述核苷酸序列的DNA片段的翻譯產(chǎn)物。5.如權(quán)利要求1所述的融合抗原，其中，所述羧基末端部分包含具有氨基酸序列KKDELRXELKDEL的多肽，其中X為V或D。6.如權(quán)利要求1所述的融合抗原，其中，所述配體部分為假單胞菌外毒素A結(jié)合域I。7.—種靶細(xì)胞特異性融合抗原，包含a.抗原部分；b.配體部分，其能夠與所述靶細(xì)胞上的受體反應(yīng)、識(shí)別該受體或者與該受體結(jié)合；C.假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II;以及d.羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽；其中，所述抗原部分源于選自由馬動(dòng)脈炎病毒、II型環(huán)狀病毒、人免疫缺陷病毒、乳酸脫氫酶增高病毒以及猴出血熱病毒組成的組中的病原體。8.如權(quán)利要求7所述的融合抗原，其中，所述羧基末端部分包含具有氨基酸序列KKDELRXELKDEL的多肽，其中X為V或D。9.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求l所述的融合抗原以及可藥用載體；其中，含有PRRSVORFlb的融合抗原為第一融合抗原。10.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包含靶細(xì)胞特異性第二融合抗原，其中，第二融合抗原包含a.抗原部分，其源于PRRSVORF7;b.配體部分，其能夠與所述靶細(xì)胞上的受體反應(yīng)、識(shí)別該受體或者與該受體結(jié)合；c.假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II;以及d.羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽。全文摘要本發(fā)明關(guān)于一種用作疫苗的融合抗原。該融合抗原包含配體部分、假單胞菌外毒素A易位結(jié)構(gòu)域II、抗原部分以及羧基末端部分。該配體部分能夠與靶細(xì)胞上的受體反應(yīng)、識(shí)別該受體或者與該受體結(jié)合。該羧基末端部分包含具有KDEL序列的多肽。該抗原部分源于選自由PRRSV、馬動(dòng)脈炎病毒、II型環(huán)狀病毒、人免疫缺陷病毒、乳酸脫氫酶增高病毒以及猴出血熱病毒組成的組中的病原體。本發(fā)明還公開了使用該融合抗原的藥物組合物與使用該融合抗原誘發(fā)免疫反應(yīng)的方法。文檔編號(hào)A61P37/02GK101691405SQ20081017891公開日2010年4月7日申請(qǐng)日期2008年11月27日優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日發(fā)明者廖朝暐,章修綱,翁仲男申請(qǐng)人:生寶生物科技股份有限公司;財(cái)團(tuán)法人臺(tái)灣動(dòng)物科技研究所