專利名稱：一種過(guò)量表達(dá)的同源抗原疫苗及其制備方法
這里描述的發(fā)明是在美國(guó)農(nóng)業(yè)部的資助下完成的，因此美國(guó)政府對(duì)此發(fā)明可能具有一些權(quán)利。
本發(fā)明涉及一種過(guò)量表達(dá)同源抗原疫苗，一種制備該疫苗的方法以及將該疫苗應(yīng)用于治療病原性微生物引起的脊椎動(dòng)物疾病，或用于預(yù)防脊椎動(dòng)物獲得上述疾病。該疫苗是減毒的或無(wú)毒的病原性微生物，上述微生物過(guò)量表達(dá)一種或多種病原基因，因此它提供的抗原性比未過(guò)量表達(dá)基因的同種病原體的疫苗誘導(dǎo)的抗原性要強(qiáng)。
背景技術(shù)：
疫苗是用來(lái)抵抗病原體造成的疾病。這些病原體是影響動(dòng)物，包括人，的微生物，如細(xì)菌或病毒。疫苗是通過(guò)生產(chǎn)和施用a)減毒或無(wú)毒類型的病原體；b)滅活的病原體；c)從病原提取的保護(hù)性抗原或抗原混合物；或d)表達(dá)一種或多種由克隆自不同于疫苗株的微生物病原體的基因編碼的保護(hù)性抗原(異源性抗原)的微生物。
如K．Jones和M．Sheppard在疫苗設(shè)計(jì)，CRC Press(1997)中所描述，細(xì)菌和病毒疫苗都是從表達(dá)一種或多種保護(hù)性抗原的微生物設(shè)計(jì)得到的。疫苗的目的是在接受體中產(chǎn)生至少由一種抗體介導(dǎo)的或由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答組成的免疫應(yīng)答，從而防止將來(lái)的病原性感染，或抵抗目前的病原性感染。針對(duì)生長(zhǎng)在被感染宿主細(xì)胞內(nèi)的兼性細(xì)胞內(nèi)病原體的疫苗需要誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)募?xì)胞介導(dǎo)強(qiáng)免疫應(yīng)答。與此相反，針對(duì)專性細(xì)胞外病原體的疫苗需要誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)目贵w介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。通常，不管病原體是那種，適當(dāng)?shù)目贵w介導(dǎo)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答一起充分地抵抗或減輕感染。為了達(dá)到這種抵抗或減輕感染，疫苗可表達(dá)一種或多種同源抗原，異源抗原或聯(lián)合表達(dá)兩種抗原。
可對(duì)脊椎動(dòng)物施用疫苗防止或治療病原體的感染。因此，經(jīng)常施用疫苗以防止病原體導(dǎo)致的疾病傳播。尤其是，畜群，如奶牛、山羊、綿羊和豬經(jīng)常接種疫苗以防止疾病在畜群的成員之間的傳播。進(jìn)而，由于一些疾病可能在脊椎動(dòng)物之間傳播，包括在不同種動(dòng)物之間和動(dòng)物和人之間傳播，所以通常通過(guò)對(duì)鄰近的感染動(dòng)物或未感染動(dòng)物施用疫苗，從而用疫苗防止疾病在各種種屬之間的傳播。但是，作為一種預(yù)防手段，該地區(qū)的其它不太可能感染該疾病的動(dòng)物也可接種疫苗。例如，可對(duì)一只感染的奶牛和它的尚未感染的牛群接種疫苗以治療疾病和防止疾病的進(jìn)一步傳播。作為一種預(yù)防措施，其它可能從感染的奶牛感染該疾病的動(dòng)物，如鄰近的奶牛、綿羊或人，也可接種疫苗。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)病原體的減毒或無(wú)毒株在防止或抵抗由該病原體引起的疾病上是非常有效的。特別是，已知這種減毒或無(wú)毒的病原體可被改造以表達(dá)異源性抗原(源自不同物種的病原體的抗原)。為了在所需要的減毒或無(wú)毒病原體上表達(dá)異源性抗原，從一種異源種屬的脫氧核糖核酸中鑒定了一種編碼抗原的基因，該抗原能提供對(duì)病原體的抵抗力。分離了所需的基因并將其插入到能在減毒或無(wú)毒病原體中表達(dá)的質(zhì)粒中。然后將該質(zhì)粒導(dǎo)入減毒或無(wú)毒病原體，并在施用到目的脊椎動(dòng)物時(shí)使異源抗原表達(dá)。
這樣表達(dá)異源抗原的一個(gè)例子是表達(dá)鏈球菌spaA蛋白的細(xì)菌疫苗沙門氏菌(Salmonella)。參見(jiàn)美國(guó)專利4，888，170。這種疫苗包括沙門氏菌屬的一種病原性微生物的無(wú)毒衍生物，該衍生物表達(dá)源自Streptococcus mutans種的病原體的重組基因，從而產(chǎn)生能在脊椎動(dòng)物中誘導(dǎo)抗病原體免疫應(yīng)答的抗原。
異源表達(dá)的另一例子是霍亂弧菌(Vibrio cholera)疫苗。許多活的霍亂弧菌減毒株已被開(kāi)發(fā)成為人類抗霍亂的疫苗。參見(jiàn)Kaper，J．B．，et al．，在新產(chǎn)生的疫苗中抗霍亂的新改進(jìn)疫苗(MM Levin et al．編著)Marcel Deker，Inc．，紐約，1997。這些菌株中的一部分過(guò)量表達(dá)異源抗原。參見(jiàn)Butterton，J．R．a(chǎn)nd S．B．Calderwood，在新產(chǎn)生的疫苗中減毒的霍亂弧菌作為活載體表達(dá)外來(lái)抗原(MM Levinet al．編著)Marcel Deker，Inc．，紐約，1997。由減毒疫苗株誘導(dǎo)的免疫性是由于誘導(dǎo)了具有抗細(xì)菌或抗毒性活性的抗體。一些菌株通過(guò)缺失大量編碼毒源性成分的基因而被減毒，包括由ctxA基因編碼的霍亂毒素A亞基。但是，為了使霍亂毒素疫苗株具有完整的保護(hù)性，它需要表達(dá)編碼B亞基(A亞基與其結(jié)合)的ctxB基因，從而允許產(chǎn)生中和霍亂毒素的抗體。在霍亂弧菌中ctxB基因被過(guò)量表達(dá)，以產(chǎn)生大量的霍亂毒素B(CTB)抗原。收集過(guò)量表達(dá)的抗原CTB，純化并用作亞基疫苗，即提取的CTB抗原。參見(jiàn)Lebens M．，et al．，1993，生物技術(shù)(紐約)12月；111574-1578。但是，盡管過(guò)量表達(dá)的抗原自身已被用作疫苗，過(guò)量表達(dá)ctxB基因或任何其他同源基因的霍亂弧菌減毒或無(wú)毒株還未被用作活體疫苗。
異源表達(dá)的另一例子是用于防止人類肺結(jié)核的分支桿菌(Mycobacterium)spp．疫苗。當(dāng)轉(zhuǎn)染到巨噬細(xì)胞中的groEL基因表達(dá)時(shí)結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)GroEL蛋白誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫力(Silva，C．L．a(chǎn)nd Lowrie，D．B．，1994，免疫學(xué)84244-248)，這表明GroEL蛋白由這種類型的抗原遞呈細(xì)胞(APC)遞呈給T細(xì)胞時(shí)是保護(hù)性抗原。利用編碼多種抗原(hsp 70，85KDa，65KDa，36KDa)的分支桿菌基因的裸DNA疫苗能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。參見(jiàn)Lowrie，D．B．et al．，1997，疫苗15834-838；Tascon，E．etal．，1996，自然醫(yī)學(xué)2888-892；and Lozes，E．et al．，1997，疫苗15880-833。有人認(rèn)為裸DNA之所以起作用是由于它們轉(zhuǎn)染了APC(Chattergon，M．et al．，1997，F(xiàn)ASEB J．11753-763)，APC將抗原適當(dāng)?shù)剡f呈給T細(xì)胞，從而誘導(dǎo)了保護(hù)性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。牛結(jié)核分支桿菌BCG，分支桿菌的一種活的減毒株，被用于誘導(dǎo)人類抗結(jié)核桿菌感染的保護(hù)性免疫。Fine，PM．1988，Br．Med．Bull．4491。
抗布魯氏菌病的抗原疫苗為同源抗原表達(dá)提供了例子，其中抗原是源自于同種減毒病原體。布魯氏菌病是一種感染性的細(xì)菌疾病，它可通過(guò)動(dòng)物傳染至人類。它可由布魯氏菌(Brucella)屬的多種病原性需氧細(xì)菌中的任何一種引起。在動(dòng)物中布魯氏菌病可引起流產(chǎn)和不育。在人類中它導(dǎo)致發(fā)燒、不適和頭痛。這種疾病已被廣泛地研究，并發(fā)展了多種疫苗。
已知存在布魯氏菌的疫苗株，如流產(chǎn)布魯氏菌(B．a(chǎn)bortus)菌株19和RB51，以及馬耳他布魯氏(B．melitensis)菌株REV1，它們能抵抗它們所來(lái)源的布魯氏菌種的感染，并交叉抵抗其它種，如流產(chǎn)布魯氏菌，馬耳他布魯氏，羊布魯氏菌(B．ovis)，豬布魯氏菌(B．suis)，狗布魯氏菌(B．canis)、和木鼠布魯氏菌(B．neotomal)的感染。參見(jiàn)Winter，A．J．et al．，1996，Am．J．Vet．Res．，57677；P．Nicoletti in動(dòng)物布魯氏菌病(Animal Brucellosis)，CRC Press(1990)，pp．184-296；J．M．Blasco in動(dòng)物布魯氏菌病，CRC Press(1990)，PP．368-370；and G．C．Alton in動(dòng)物布魯氏菌病，CRC Press(1990)，pp．395-400。新馬耳他布魯氏菌株VTRM1和豬布魯氏菌菌株VTRS1也交叉抵抗各種布魯氏菌種。參見(jiàn)Winter，A．J．et al．，Am．J．Vet．l Res．，57677。
如P．Nicoletti在動(dòng)物布魯氏菌病，CRC Press(1990)Page284-296頁(yè)中所描述的那樣，過(guò)去用來(lái)預(yù)防牛布魯氏菌病的一種最常用的疫苗是流產(chǎn)布魯氏菌菌株19。這種流產(chǎn)布魯氏菌的特殊菌株在牛中提供了范圍在65-75％的保護(hù)，保護(hù)的范圍依賴于許多變量，如接種時(shí)牛的年齡、施用的劑量、施用的途徑和布魯氏菌病在牛群中流行的程度。
流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51，一種新的減毒布魯氏菌疫苗(標(biāo)記為RB-51)，是一種被批準(zhǔn)在美國(guó)使用的穩(wěn)定疫苗。參見(jiàn)Sehurig，G．G．etal，1991，Vet．Microbiol．26359；and Colby，L．，1997，M．Sc．Thesis，Virgina Tech，Blacksburg，V．在小鼠、山羊和牛中進(jìn)行的研究顯示RB51菌株的減毒作用。參見(jiàn)Schurig，G．G．，1991，Vet．Microbiol．28171Palmer R．M．et al．，1997，Am．J．Vet Res．58472；Roop，R．M．et al．，1995，Res．Vet．Science，51359；and Zambrano，A．J．et al．，1995，Archives de MedicinaVeterinaria ⅩⅩⅧ，No．extraordinario119-121。和菌株19提供的保護(hù)相比，菌株RB51通過(guò)單一接種步驟即在牛中表現(xiàn)出類似的保護(hù)性。參見(jiàn)Cheville，N．F．et al．，1993，Amer．J．Vet Research531881；and Cheville，N．F．et al．，1996，Amer．J．Vet Research，571153。進(jìn)而，在小鼠和牛中表明通過(guò)口服施用菌株RB51產(chǎn)生了保護(hù)性免疫。參見(jiàn)Stevens，M．G．et al．，1996，傳染病免疫Immun．64534。尤其是，小鼠模型表明菌株RB51誘導(dǎo)的對(duì)布魯氏菌病的保護(hù)性免疫是單一T細(xì)胞介導(dǎo)的，因?yàn)楸粍?dòng)輸入RB51誘導(dǎo)的抗體并不產(chǎn)生對(duì)疾病的抵抗力，而過(guò)繼T細(xì)胞轉(zhuǎn)移則產(chǎn)生。參見(jiàn)Bagchi，T．，1990，M．Sc．Thesis，Virginia Tech，Blacksburg，Va；Jimenez deBagues，M．P．et al．，1994，傳染病免疫624990。人們認(rèn)為RB-51接種誘導(dǎo)了干擾素γ，干擾素γ激活巨噬細(xì)胞和特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，細(xì)胞毒性T細(xì)胞能殺死布魯氏菌感染的巨噬細(xì)胞，從而產(chǎn)生保護(hù)性免疫。
盡管源自流產(chǎn)布魯氏菌菌株2308的RB-51是目前抵抗動(dòng)物布魯氏菌病的最好疫苗，它仍然不是100％有效的。目前還沒(méi)有完全有效的布魯氏菌病疫苗。因此關(guān)于有潛力的菌株，如流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51的研究仍然在繼續(xù)。例如，S．Cravero，et al．，1995，Proceedings4thIntl．Vet．Immunol．Symposium，July，Davis，Ca．，Abstract#276；and S．Cravero et al．，1996，動(dòng)物疾病研究人員會(huì)議，Nov．，芝加哥，Abstract#150描述了通過(guò)流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51表達(dá)異源抗原。在流產(chǎn)布魯氏菌的HtrA蛋白的研究中已有報(bào)道在布魯氏菌中過(guò)量表達(dá)同源抗原，以之作為補(bǔ)充特異缺失突變體的一種研究工具(P．H．Elzer，傳染病免疫，1994，624131)，以及，如R．Wright1997年11月9日在芝加哥，Ill，召開(kāi)的布魯氏菌研究會(huì)議上所作的口頭報(bào)告上所討論，作為研究生理功能的研究工具。
但是過(guò)量表達(dá)布魯氏菌或其它病原體的同源抗原，同時(shí)表達(dá)或不表達(dá)異源抗原，還未被研究用于疫苗。如上所述，同源抗原的表達(dá)過(guò)去主要被用作研究工具。被改造來(lái)過(guò)量表達(dá)同源抗原的減毒或無(wú)毒病原體還未被用作活疫苗。然而，我們發(fā)現(xiàn)，過(guò)量表達(dá)一種或多種同源抗原，如此處所描述，的減毒或無(wú)毒病原體提供的抗病原性疾病的抵抗力要比表達(dá)野生型水平的同種同源抗原的減毒病原體提供的抵抗力高很多。
因此，本發(fā)明是針對(duì)一種疫苗，生產(chǎn)該疫苗的一種方法，以及該疫苗在病原性疾病的預(yù)防和治療中的應(yīng)用；其中疫苗是一種過(guò)量表達(dá)至少一種同源抗原的減毒或無(wú)毒病原體，從而在受感染的脊椎動(dòng)物中提供了對(duì)由于未減毒的病原體導(dǎo)致的疾病的更強(qiáng)抵抗力和更好療效。
發(fā)明概述本發(fā)明是關(guān)于一種活體疫苗，該疫苗為過(guò)量表達(dá)病原體的一種或多種同源抗原的減毒或無(wú)毒病原體，生產(chǎn)該疫苗的方法以及用該疫苗治療動(dòng)物，包括人，的方法。與表達(dá)野生型水平的病原體同源抗原的減毒病原體相比，這種疫苗提高了對(duì)未減毒病原體的抵抗力。通過(guò)這種方式，過(guò)量表達(dá)同源抗原的疫苗將在接種疫苗的受試者中誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和／或體液抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的目的尤其是提供一種產(chǎn)生疫苗的方法，該疫苗是過(guò)量表達(dá)同源抗原的減毒或無(wú)毒病原體，以及用該疫苗免疫動(dòng)物，包括人，的方法，使得該疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病毒性病原體的強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，從而提供抵抗病毒性病原體攻擊的全面保護(hù)，無(wú)菌免疫。
本發(fā)明的目的進(jìn)而為提供一種生產(chǎn)疫苗的方法，該疫苗為過(guò)量表達(dá)同源抗原的一種減毒的或無(wú)毒的病原體，以及用該疫苗免疫動(dòng)物，導(dǎo)致同源抗原的過(guò)量表達(dá)以及異源抗原的表達(dá)方法，在接種疫苗的受試動(dòng)物中兩種抗原都提供抗病毒性病原體的抵抗力。
本發(fā)明的目的進(jìn)而為提供一種過(guò)量表達(dá)的同源疫苗，一種制造這樣疫苗的方法以及將該疫苗用于預(yù)防或治療動(dòng)物，尤其是牛類動(dòng)物，的布魯氏菌病。
附圖簡(jiǎn)述附圖是用于幫助解釋以及更具體地指出此處描述的本發(fā)明。具體而言

圖1是描述從布魯氏菌種中獲得同源抗原，并將該抗原插入到布魯氏菌種疫苗株；圖2描述用于在流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51中過(guò)量表達(dá)銅／鋅SOD(A)和GroES和GroEL(B)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
圖3示明用過(guò)量表達(dá)銅／鋅SOD(A)或GroES／EL的流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51免疫接種的小鼠脾臟中清除了流產(chǎn)布魯氏菌菌株2308。
圖4示明用過(guò)量表達(dá)銅／鋅SOD(A)或GroES／EL的流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51免疫接種的小鼠的淋巴細(xì)胞對(duì)感染布魯氏菌的細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。
發(fā)明詳述本發(fā)明是關(guān)于一種用于免疫脊椎動(dòng)物使之抵抗由病原體導(dǎo)致的疾病的疫苗。其中該疫苗包括一種過(guò)量表達(dá)一種或多種同源抗原的減毒或無(wú)毒病原體，上述同源抗原由至少一種源自上述病原體的基因編碼，其中每種抗原能誘導(dǎo)抵抗該病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
這種過(guò)量表達(dá)的同源抗原疫苗是通過(guò)將活的減毒微生物進(jìn)行遺傳工程產(chǎn)生的，該方法包括以下步驟a)選擇一種編碼同源抗原的基因，該基因能直接或間接刺激抗病原微生物(病原體)的保護(hù)性免疫，以及b)將上述基因插入到一種減毒或無(wú)毒的病原體中使該同源抗原過(guò)量表達(dá)。得到的過(guò)量表達(dá)同源抗原疫苗(OHAV)的制備具體如下(a)從病原微生物中提取脫氧核糖核酸；
(b)從上述脫氧核糖核酸中鑒定一個(gè)基因，上述基因編碼至少一個(gè)能刺激抗上述病原微生物的保護(hù)性免疫應(yīng)答的抗原；(c)將上述基因插入到能在上述病原微生物中復(fù)制和表達(dá)的質(zhì)粒中；(d)將上述質(zhì)粒導(dǎo)入到減毒或無(wú)毒型的上述病原微生物中。
得到的疫苗合成上述抗原是位于至少兩個(gè)位點(diǎn)，即基因組和質(zhì)粒，的上述基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的結(jié)果。尤其優(yōu)選的是，上述質(zhì)粒是多拷貝型的，這樣它就能產(chǎn)生大量的保護(hù)性抗原，而不是只產(chǎn)生單一基因組拷貝。
上述方法可被用于制備許多疾病的過(guò)量表達(dá)同源抗原疫苗。抗原的過(guò)量表達(dá)通常同時(shí)增強(qiáng)T細(xì)胞和抗體免疫應(yīng)答，從而大大地增強(qiáng)受試者的保護(hù)水平。由于兩種類型的免疫應(yīng)答都增強(qiáng)了，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的病原體都受影響，從而提供了對(duì)病原體更強(qiáng)的抵抗。
例如，可制備抗病原微生物布魯氏菌的疫苗。尤其是，該病原體可選自布魯氏菌的任何種，包括流產(chǎn)布魯氏菌，馬耳他布魯氏，羊布魯氏菌，豬布魯氏菌，狗布魯氏菌和木鼠布魯氏菌。用于制造疫苗的病原體優(yōu)選地選自一種特殊的布魯氏菌菌株，如流產(chǎn)布魯氏菌菌株19，流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51，馬耳他布魯氏菌株VTRM1，豬布魯氏菌株VTRS1和馬耳他布魯氏菌株REV1。
具有流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51的一種或多種銅／鋅SOD基因、GroES基因或GroEL基因疫苗是尤其有利的。尤其優(yōu)選的是上述基因來(lái)自流產(chǎn)布魯氏菌菌株2308的pUC19基因組文庫(kù)。
根據(jù)上述說(shuō)明制備的疫苗對(duì)于預(yù)防和治療諸如布魯氏菌病這樣的疾病是尤其有效的。例如，根據(jù)本發(fā)明用于預(yù)防或治療?？苿?dòng)物布魯氏菌病的一種有效疫苗是一種減毒或無(wú)毒的流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51衍生物，它能過(guò)量表達(dá)至少一種同源抗原。尤其優(yōu)選的是該抗原由一種或多種銅／鋅SOD基因、GroES基因或GroEL基因編碼，優(yōu)選地上述基因選自流產(chǎn)布魯氏菌菌株2308的pUC19基因組文庫(kù)。甚至更為優(yōu)選的是減毒或無(wú)毒的衍生物還表達(dá)能誘導(dǎo)抗流產(chǎn)布魯氏菌的保護(hù)性免疫的異源抗原。
預(yù)防或治療脊椎動(dòng)物感染病原性微生物的方法如下(a)從上述病原微生物中提取脫氧核糖核酸；
(b)從上述脫氧核糖核酸中鑒定至少一個(gè)基因，上述基因編碼至少一個(gè)能刺激抗上述病原微生物的保護(hù)性免疫應(yīng)答的抗原；(c)將至少一個(gè)基因插入到能在上述病原微生物中復(fù)制和表達(dá)的質(zhì)粒中；(d)將上述質(zhì)粒導(dǎo)入到減毒或無(wú)毒型的上述病原微生物中以形成疫苗。
(e)對(duì)脊椎動(dòng)物施用有效劑量的上述疫苗。
用于預(yù)防或治療方法的疫苗可以是原始的疫苗菌株或一種存在的改進(jìn)疫苗株。例如，流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51可被改進(jìn)為過(guò)量表達(dá)一種同源抗原，從而產(chǎn)生一種能用于預(yù)防或治療布魯氏菌病，特別是牛科動(dòng)物的布魯氏菌病，的疫苗的新菌株。
具體而言，新的布魯氏菌疫苗可這樣制備1)從布魯氏菌菌株中選擇一種編碼保護(hù)性抗原的基因；2)將上述源自病原體的基因插入到能在布魯氏菌中復(fù)制和表達(dá)的多拷貝質(zhì)粒中；并且3)通過(guò)例如轉(zhuǎn)化這樣的方法將上述質(zhì)粒導(dǎo)入到布魯氏菌中。可通過(guò)這種方式過(guò)量表達(dá)一種或多種同源抗原。此外，可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法在上述疫苗中表達(dá)一種或多種異源抗原。
從減毒或無(wú)毒的病原體制備得到的疫苗通過(guò)過(guò)量表達(dá)病原體的一種或多種同源抗原，在用疫苗治療的脊椎動(dòng)物中刺激產(chǎn)生了抵抗該病原體的更強(qiáng)的T細(xì)胞和／或抗體免疫應(yīng)答，提供了針對(duì)未減毒病原體的更強(qiáng)的抵抗力。通過(guò)本領(lǐng)域中已知的常規(guī)技術(shù)利用減毒或無(wú)毒病原體額外表達(dá)一種或多種異源抗原可以提供更進(jìn)一步的保護(hù)作用。
可以對(duì)需要接種的脊椎動(dòng)物施用一定劑量的通過(guò)過(guò)量表達(dá)同源抗原而制備的疫苗，上述劑量能有效促進(jìn)對(duì)由病原體引起的疾病的預(yù)防和治療。根據(jù)本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)可知，應(yīng)根據(jù)體重，年齡，環(huán)境等因素調(diào)節(jié)每一受試者的劑量。可通過(guò)任何根據(jù)待治療動(dòng)物的類型、年齡和狀況的有效方式施用該有效劑量。
實(shí)施例實(shí)施例1通過(guò)在流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51中過(guò)量表達(dá)Cu／Zn SOD基因或GroES和GroEL基因構(gòu)建了兩種OHAVs。Cu／Zn SOD、(GroES和GroEL基因最初是從流產(chǎn)布魯氏菌菌株2308的pUC19基因庫(kù)中得到的。如圖2所示，從pBA113(SOD)和pBA2131(GroES GroEL)區(qū)域上切割了包括這些基因以及它們自身的啟動(dòng)子的插入片段，并亞克隆到pBBR1MCS，這是一種通常用于布魯氏菌研究的廣譜宿主質(zhì)粒。得到的重組質(zhì)粒被命名為pBBSOD和pBBGroES／EL(Fig．2)。用這些質(zhì)粒通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化了流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51。將轉(zhuǎn)化細(xì)菌涂布到含30μl／ml氯霉素的的胰胨豆胨培養(yǎng)基平板上選擇含這些質(zhì)粒的布魯氏菌。為了檢測(cè)克隆基因的過(guò)量表達(dá)，將抗生素抗性的菌落單獨(dú)在胰胨豆胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將細(xì)菌抽提物用作抗原進(jìn)行免疫印跡分析。與僅含pBBR1MCS的RB51菌株(RB51pBB)相比，含pBBSOD(RB51SOD)和pBBGroES／EL(RB51GroESL)的菌株分別過(guò)量表達(dá)Cu／Zn SOD和GroEL。
小鼠中的保護(hù)性研究通過(guò)腹膜內(nèi)接種對(duì)由8只小鼠組成的實(shí)驗(yàn)組接種了懸浮于0．5ml溶液的4×108菌落形成單位(cfu)的菌株RB51SOD，RB51GroEL，RB51pBB或RB51。一組小鼠用0．5ml鹽溶液接種作為對(duì)照。6星期后每組的5只小鼠用2．5×104cfu的毒性菌株2308攻擊。每組中剩下的3只小鼠用于研究免疫應(yīng)答特征。用毒性菌株2308攻擊兩星期后殺死小鼠并檢測(cè)了每個(gè)脾臟中菌株2308的cfu數(shù)。和用菌株RB51免疫的小鼠相比，用RB51SOD免疫的小鼠細(xì)菌數(shù)要低很多。用RB51GroESL免疫的小鼠中觀察到的細(xì)菌數(shù)在檢測(cè)方法的下限(＜20cfu／脾臟)。
免疫應(yīng)答的特征研究接種免疫6星期后，從每組的3只小鼠中收集了血清以分析體液抗體免疫應(yīng)答。殺死這些小鼠后從它們的脾臟獲得了淋巴細(xì)胞用于研究細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。如圖3所示，用菌株RB51接種的小鼠產(chǎn)生了抗GroEL的抗體，但未產(chǎn)生抗Cu／Zn SOD的抗體。而用菌株RB51SOD接種的小鼠產(chǎn)生了很強(qiáng)的抗Cu／Zn SOD抗體應(yīng)答，用菌株RB51GroESL接種的小鼠則產(chǎn)生了比RB51接種的小鼠更強(qiáng)的抗GroEL蛋白(圖3)的抗體應(yīng)答。這些結(jié)果表明OHAV增強(qiáng)了抗體應(yīng)答。
通過(guò)檢測(cè)淋巴細(xì)胞對(duì)感染布魯氏菌的細(xì)胞的細(xì)胞毒活性研究了細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的特性。通過(guò)和作為刺激細(xì)胞的絲裂霉素C處理的布魯氏菌感染巨噬細(xì)胞體外共培養(yǎng)，增強(qiáng)了特異性脾臟淋巴細(xì)胞的活性。利用增強(qiáng)的淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞(E)，感染布魯氏菌的巨噬細(xì)胞作為靶細(xì)胞(T)進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)。在該檢測(cè)中，E和T細(xì)胞以兩種比例混合，10∶1和5∶1。用常規(guī)方法計(jì)算了每種E∶T比例的靶細(xì)胞特異性裂解百分比(圖4)。與來(lái)自鹽溶液或菌株RB51接種的小鼠的淋巴細(xì)胞相比，來(lái)自用RB51SOD或RB51GroESL免疫小鼠的淋巴細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞毒活性增強(qiáng)。這種淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒活性的增強(qiáng)(表現(xiàn)為特異裂解百分比增加)和觀察到的小鼠對(duì)毒性流產(chǎn)布魯氏菌菌株2308的抵抗力的增強(qiáng)直接相關(guān)，保護(hù)水平越高，特異細(xì)胞毒活性越高。
實(shí)施例2通過(guò)在霍亂弧菌中過(guò)量表達(dá)ctxB基因構(gòu)建了一種OHAV。該基因來(lái)自于該病原體的脫氧核糖核酸，并被插入的一種能在病原體中復(fù)制和表達(dá)的質(zhì)粒中。得到的重組質(zhì)粒被通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化霍亂弧菌。通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法涂布和篩選質(zhì)粒。得到的過(guò)量表達(dá)同源抗原疫苗菌株促進(jìn)了中和霍亂毒素的抗體的額外產(chǎn)生，從而提供了預(yù)防和治療人霍亂病的更強(qiáng)抵抗力。
實(shí)施例3通過(guò)在分支桿菌種中過(guò)量表達(dá)結(jié)核分支桿菌的groEL基因構(gòu)建了一種OHAV。該基因來(lái)自于該病原體的脫氧核糖核酸，并被插入的一種能在病原體中復(fù)制和表達(dá)的質(zhì)粒中。得到的重組質(zhì)粒被通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化分支桿菌種。通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法涂布和篩選質(zhì)粒。得到的過(guò)量表達(dá)同源抗原疫苗菌株促進(jìn)了GroEL蛋白的額外產(chǎn)生，從而提供了預(yù)防和治療人結(jié)核病的更強(qiáng)抵抗力。尤其是，在牛分支桿菌BCG中g(shù)roEL基因的過(guò)量表達(dá)提供了抵抗結(jié)核更強(qiáng)的保護(hù)性免疫，因?yàn)橐阎狟CG疫苗的靶為抗原保護(hù)細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞，從而提供了一種將抗原導(dǎo)向T細(xì)胞的方式，誘導(dǎo)保護(hù)性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。
以上的實(shí)施例僅僅是例證性的。本發(fā)明的范圍并不限制于這些實(shí)施例，而是在說(shuō)明書(shū)和隨后的權(quán)利要求書(shū)中得以描述。本領(lǐng)域中具有普通技術(shù)人員能鑒別以上描述的方法和材料的替代方法和材料，應(yīng)該認(rèn)為上文的說(shuō)明書(shū)和隨后的權(quán)利要求書(shū)覆蓋這些方法和材料。
權(quán)利要求
1．一種用于免疫脊椎動(dòng)物，使之抵抗病原體導(dǎo)致的疾病的疫苗，其中所述的疫苗包括上述病原體的一種減毒或無(wú)毒的衍生物，該衍生物過(guò)量表達(dá)至少一種由至少一種源自上述病原體的基因編碼的同源抗原，其中上述至少一種抗原能誘導(dǎo)抵抗該病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
2．權(quán)利要求1中的疫苗，其中所述的該病原體的減毒或無(wú)毒衍生菌進(jìn)而表達(dá)一種或多種異源抗原。
3．權(quán)利要求1中的疫苗，其中該病原體選自由布魯氏菌，分支桿菌和霍亂桿菌組成的一組病原體。
4．一種用于預(yù)防或治療脊椎動(dòng)物，使之抵抗布魯氏菌病的疫苗，其中所述的疫苗包括布魯氏菌的一種減毒或無(wú)毒的病原體，該減毒或無(wú)毒病原體過(guò)量表達(dá)至少一種由至少一種源自上述病原體的基因編碼的同源抗原，其中上述至少一種抗原能誘導(dǎo)抵抗布魯氏菌病的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
5．權(quán)利要求4中的疫苗，其中病原體選自由流產(chǎn)布魯氏菌，馬耳他布魯氏菌，豬布魯氏菌和狗布魯氏菌組成的一組病原體。
6．權(quán)利要求4中的疫苗，其中布魯氏菌是流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51。
7．權(quán)利要求6中的疫苗，其中至少一種基因?yàn)镃u／Zn SOD基因。
8．權(quán)利要求7中的疫苗，其中Cu／Zn基因是從流產(chǎn)布魯氏菌菌株2308的pUC19基因組文庫(kù)里得到的。
9．權(quán)利要求6中的疫苗，其中至少一種基因是GroES基因和GroEL基因中的一種或兩種。
10．權(quán)利要求9中的疫苗，其中GroES基因和GroEL基因是從流產(chǎn)布魯氏菌菌株2308的pUC19基因組文庫(kù)里得到的。
11．權(quán)利要求4中的疫苗，其中脊椎動(dòng)物為牛。
12．過(guò)量表達(dá)至少一種抗原的流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51的一種減毒或無(wú)毒型的菌株，其中上述抗原能刺激抵抗布魯氏菌病的保護(hù)性免疫。
13．權(quán)利要求12中流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51的一種減毒或無(wú)毒型菌株，其中至少一種同源抗原是由至少一種選自Cu／Zn SOD基因、GroES基因和GroEL基因的基因編碼。
14．一種預(yù)防或治療由病原性微生物導(dǎo)致的脊椎動(dòng)物疾病的方法，包括施用有效劑量的過(guò)量表達(dá)同源抗原疫苗，其中上述疫苗是過(guò)量表達(dá)至少一種上述病原性微生物的同源抗原的上述病原性微生物的減毒或無(wú)毒型菌株。
15．權(quán)利要求14中的方法，其中疫苗進(jìn)而表達(dá)一種異源抗原。
16．權(quán)利要求14中的方法，其中病原性微生物是分支桿菌或霍亂桿菌。
17．權(quán)利要求16中的方法，其中脊椎動(dòng)物是人。
18．一種預(yù)防或治療脊椎動(dòng)物布魯氏菌病的方法包括施用有效劑量的疫苗，其中上述疫苗是一種減毒或無(wú)毒的布魯氏菌病原體，該病原體過(guò)度表達(dá)至少一種由來(lái)自所述的減毒或無(wú)毒的病原體的至少一種基因所編碼的同源抗原。
19．權(quán)利要求18中的方法，其中所述的減毒或無(wú)毒型病原體進(jìn)而表達(dá)一種異源抗原。
20．權(quán)利要求18中的方法，其中至少一種基因是流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51中的Cu／Zn SOD基因。
21．權(quán)利要求18中的方法，其中Cu／Zn基因是從流產(chǎn)布魯氏菌菌株2308的pUC19基因組文庫(kù)里得到的。
22．權(quán)利要求18中的方法，其中至少一種基因?yàn)榱鳟a(chǎn)布魯氏菌株RB51的GroES基因和GroEL基因中之一或兩者。
23．權(quán)利要求22中的方法，其中GroES基因和GroEL基因是從流產(chǎn)布魯氏菌菌株2308的pUC19基因組文庫(kù)里得到的。
24．一種預(yù)防或治療病原性微生物導(dǎo)致的脊椎動(dòng)物疾病的方法，包括以下步驟a)從病原性微生物中提取脫氧核糖核酸；b)從上述脫氧核糖核酸中鑒定至少一種編碼至少一種抗原的基因，其中上述至少一種抗原能刺激抵抗該病原性微生物的保護(hù)性免疫。c)將上述至少一種基因插入到能在該病原性微生物中復(fù)制和表達(dá)的多拷貝質(zhì)粒中；d)用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化病原性微生物的減毒或無(wú)毒型以形成疫苗；e)將有效量的上述疫苗施用到脊椎動(dòng)物上。
25．權(quán)利要求24中的方法，其中所述的減毒或無(wú)毒型的病原性微生物進(jìn)而表達(dá)一種或多種異源抗原。
26．權(quán)利要求24中的方法，其中病原性微生物選自由布魯氏菌，分支桿菌和霍亂桿菌組成的一組病原性微生物。
27．權(quán)利要求26中的方法，其中病原性微生物選自由流產(chǎn)布魯氏菌，馬耳他布魯氏菌，豬布魯氏菌，羊布魯氏菌，木鼠布魯氏菌和狗布魯氏菌組成的一組病原性微生物。
28．權(quán)利要求27中的方法，其中病原性微生物是流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51。
29．權(quán)利要求28中的方法，其中至少一種基因是Cu／Zn SOD基因。
30．權(quán)利要求28中的方法，其中至少一種基因是GroES基因或GroEL基因之一或兩者。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種過(guò)量表達(dá)同源抗原疫苗,一種制備該疫苗的方法以及將該疫苗應(yīng)用于治療病原性微生物引起的脊椎動(dòng)物疾病,或用于預(yù)防脊椎動(dòng)物獲得上述疾病。該疫苗是減毒的或無(wú)毒的病原性微生物,上述微生物過(guò)量表達(dá)至少一種同源抗原,上述同源抗原由至少一種源自病原性微生物的基因編碼;上述微生物可能也表達(dá)一種異源性抗原。
文檔編號(hào)C07K14/23GK1290173SQ97182517
公開(kāi)日2001年4月4日 申請(qǐng)日期1997年12月5日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月5日
發(fā)明者S·M·波伊勒, S·克拉維洛, L·科爾貝爾, G·G·舒里格, N·斯里爾納加納坦, R·維穆拉帕利 申請(qǐng)人:弗吉尼亞科技知識(shí)產(chǎn)權(quán)有限公司, 加州大學(xué)評(píng)議會(huì)