專利名稱：遲緩愛德華氏菌疫苗抗原及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說是遲緩愛德華氏菌疫苗抗原及 其制備方法。
背景技術(shù)：
遲緩愛德華氏菌為革蘭氏陰性桿菌，具有廣泛的宿主范圍，包括人類 及各種水、陸生動物。在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中，該菌能夠感染多種重要淡、海 水魚類，如鯉魚、羅非魚、牙鲆、鰻魚、鰭魚等。由于遲緩愛德華氏菌能 夠在所感染的水生動物中誘發(fā)一種嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病-愛德華氏菌病
(Edwardsiellosis ),因而對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
目前對于愛德華氏菌病的防治主要依賴于抗生素(包括各種化學(xué)藥物) 和疫苗免疫兩條途徑。由于抗生素對動物、人類以及環(huán)境所造成的長期性 危害，其應(yīng)用已逐漸在國際上受到限制。疫苗免疫雖然已證明為最為有效 的病害防治措施，但就遲緩愛德華氏菌而言，由于其免疫相關(guān)基礎(chǔ)研究仍 在起始階段，目前世界上應(yīng)用于水產(chǎn)業(yè)的愛德華氏菌疫苗主要為簡單的滅 活全菌疫苗，尚未有高效的分子疫苗如重組亞單位疫苗等。滅活疫苗雖然 安全但往往由于抗原成分和結(jié)構(gòu)在制備過程中被部分破壞而達(dá)不到理想的 免疫效果。相對而言分子疫苗(重組亞單位疫苗、DNA疫苗等)則具有特異 性強(qiáng)、免疫效應(yīng)較高等特點。因而篩選和獲得具免疫保護(hù)效應(yīng)的分子疫苗 抗原是愛德華氏菌病免疫防治的關(guān)鍵之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供兩種遲緩愛德華氏菌疫苗抗原及其制備方法。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案為 遲緩愛德華氏菌疫苗抗原具有序列表SEQ ID No. 1。 制備方法
1 )質(zhì)粒pET258構(gòu)建將經(jīng)BglII/Ndel雙酶切的質(zhì)粒pET25回收的104bp 片段與經(jīng)BglII/Ndel雙酶切的質(zhì)粒pET28回收的5. 3kb片段用T4DNA連接 酶連接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中并在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上 培養(yǎng)18-24小時，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為pET258;
2 )質(zhì)粒構(gòu)建以菌株TX1為模板,釆用EDF1和EDR1為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，純化產(chǎn)物后與載體pBS-T載體于室溫連接2-4小時，連接混合液轉(zhuǎn) 化大腸桿菌后在含卡那霉素、Xgal、異丙基-p-D-硫代半乳糖苷的LB培養(yǎng) 基上培養(yǎng)18 - 24小時，篩選出白色轉(zhuǎn)化子為質(zhì)粒pBSED;而后將質(zhì)粒pBSED 用Ndel/Xho1雙酶切回收0. 58kb，同時將步驟1 )的質(zhì)粒pET258用Ndel/Xho1 雙酶切回收5. 3kb片段；將質(zhì)粒pBSED用Ndel/Xho1雙酶切回收0. 58kb與質(zhì)粒pET258用Ndel/Xhol雙酶切回收5. 3kb片段用T4DNA連接酶于室溫連 接2 - 4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 a后在含有Kn ( 50ug/ml )的LB 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，挑取2個轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒為質(zhì)粒pETED;
其中所述菌株TX1保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心CGMCC，地址為北京巿朝陽區(qū)大屯路，保藏編號為CGMCC No. 2330， 分類命名為遲緩愛德華氏菌胸油ieiia M油;保藏曰期:2008年1月9日;
所述弓l物EDF1 5， — CATATGACGACTATCGACAGCG —3，和EDR1 (5，丄 CTCGAGGGACATGCGTACGCTGC -3，；
3)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)將步驟2)的質(zhì)粒pETED轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，在 合有Kn的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時，篩選轉(zhuǎn)化子即為BL21/pETED;將 BLH/pETED于含有Kn的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；而后再將培養(yǎng)液加入到新 鮮的含有Kn的LB液體培養(yǎng)基中，于37'C搖動培養(yǎng)至OD固為0. 6，加入終 濃度為lmM的異丙基-D-硫代半乳糖苷，37。C繼續(xù)搖動培養(yǎng)4-5小時， 裂解菌體，離心收集上清，純化重組蛋白，即為具有序列表SEQ IDNol的 堿基序列的重組保護(hù)性疫苗抗原EseD; ,
其中培養(yǎng)液與新鮮的含有Kn的LB液體培養(yǎng)基體積比為1:100; BL21/pETED與含有Kn的LB培養(yǎng)基體積比1: 100。
遲緩愛德華氏菌疫苗抗原具有序列表No.2中的堿基序列。
制備方法
1 )質(zhì)粒pET258構(gòu)建將經(jīng)BglII/Ndel雙酶切的質(zhì)粒pET25回收的104bp 片段與經(jīng)BglII/Ndel雙酶切的質(zhì)粒pET28回收的5. 3kb片段用T4DNA連接 酶連接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中并在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上 培養(yǎng)18-24小時，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為pET258;
2 )質(zhì)粒構(gòu)建以菌株TX1為模板,釆用ETF1和ETR1為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，純化產(chǎn)物后與載體PBS-T載體于室溫連接2-4小時，連接混合液轉(zhuǎn) 化大腸桿菌后在含卡那霉素、Xgal、異丙基-P-D-硫代半乳糖苷的LB培養(yǎng) 基上培養(yǎng)18-24小時，篩選出白色轉(zhuǎn)化子為質(zhì)粒pBSET18;而后將質(zhì)粒 pBSET18用Ndel/Xho1雙酶切回收0. 58kb，同時將步驟1 )的質(zhì)粒pET258用 Ndel/Xho1雙酶切回收5. 3kb片段；將質(zhì)粒pBSEH8用Ndel/Xho1雙酶切回 收0. 58kb與質(zhì)粒pET258用Ndel/Xho1雙酶切回收5. 3kb片段用T4DNA連 接酶于室溫連接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5ot后在含有Kn
(50ug/ml )的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，挑取2個轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒 為質(zhì)粒pET18;
其中所述菌株TX1保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心CGMCC,保藏編號為CGMCC No. 2330，分類命名為遲緩愛德華氏菌；
所述引物ETF1 5， - CATATG ACGATGCGTTTTCCCT -3，，和ETR1 5， -CTCGAGCTTCAGCAGCGAGAACGCG -3，；
5質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)將步驟2)的pET18轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，在含有Kn的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，篩選轉(zhuǎn)化子即為BL21/pET18;將 BL21/pET18于含有Kn的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；而后再將培養(yǎng)液加入到新 鮮的含有Kn的LB液體培養(yǎng)基中，于37i:搖動培養(yǎng)至OD,為0. 6，加入終 濃度為lmM的異丙基-|3-D-硫代半乳糖苷，37X:繼續(xù)搖動培養(yǎng)4-5小時， 裂解菌體，離心收集上清，純化重組蛋白，即為具有序列表SEQ ID No. 2 中的堿基序列的重組保護(hù)性疫苗抗原ET18;
其中培養(yǎng)液與新鮮的含有Kn的LB液體培養(yǎng)基體積比為1:100; BL21/pET18與含有Kn的LB培養(yǎng)基體積比1: 100。
所述步驟2)中PCR條件為94°C60s預(yù)變性模板DM,然后948C 40s， 54°C 60s，72°C 60s, 5個循環(huán)后改為94°C 40s, 57°C 60s, 72°C 60s, 25個循 環(huán)后再在72"C延伸反應(yīng)10min。所述步驟2)含卡那霉素、Xgal、異丙基-(3-D-硫代半乳糖苦的LB培養(yǎng)基中含有50ug/ml卡那霉素、40ug/ml Xgal 和24ug/ml異丙基-P -D-硫代半乳糖苷。所述將步驟3 )離心所得抗原蛋白 純化時將離心收集的大腸桿菌總蛋白與鎳親和膠混合于4°C保溫1-2h,然 后以5000g, 4°C離心10-15min,回收沉淀將其與10-20 ml洗滌緩沖液混 合離心洗滌2-4次，回收沉淀將其與2 nil洗脫緩沖液混合于4t保溫20-30 Min,而后離心收集上清，其中鎳親和膠與大腸桿菌總蛋白按體積比1:5混 合。所述洗滌緩沖液組成成分為50mM NaH2P04, 300mM NaCl， 20mM咪唑，pH 8. 0;洗脫緩沖液組成成分為50mMNaH2PO4, 30關(guān)NaCl， 250 mM咪唑，pH 8. 0。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點
1. 免疫保護(hù)性。本發(fā)明的疫苗抗原皆能保護(hù)牙鲆抵御遲緩愛德華氏菌侵染。
2. 高效表達(dá)。本發(fā)明可使目的疫苗抗原蛋白表達(dá)量占大腸桿菌總蛋白 的90%以上。
3. 高回收率。本發(fā)明的抗原蛋白回收方法簡單，回收率高于85%。
4. 本發(fā)明所得疫苗抗原廣泛存在于病原性遲緩愛德華氏菌中，具高度 保守性;其原核高效表達(dá)系統(tǒng)能夠用于大量表達(dá)上述保護(hù)抗原，由此制備的 抗原蛋白保有其組成抗原的天然免疫活性，可以直接用于免疫防治。


圖1為本發(fā)明重組EseD在大腸桿菌中的表達(dá)電泳圖(其中泳道l:分 子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2:大腸桿菌總蛋白)。
圖2為本發(fā)明純化后的重組EseD電泳圖(其中泳道1:分子量標(biāo)準(zhǔn)； 泳道2:純化后的重組EseD)。
圖3為本發(fā)明重組Etl8在大腸桿菌中的表達(dá)電泳圖(其中泳道l:分 子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2:大腸桿菌總蛋白)。
圖4為本發(fā)明純化后的重組Et18電泳圖(其中泳道l:分子量標(biāo)準(zhǔn)； 泳道2:純化后的重組Et18)。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進(jìn) 行舉例描述，而非以任何形式對本發(fā)明進(jìn)行限制。
在本發(fā)明實施例中所涉及到的常規(guī)性實驗方法均采用如下方法
1. 質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化、DNA片段從凝膠中回收、細(xì)菌基因組 DNA提取皆使用"天根生化科技(北京)有限公司"的相應(yīng)試劑盒。
2. 質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell: Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001》，
3. 所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于"紐英倫生物技術(shù)有限公司"， 北京。
實施例1
遲緩愛德華氏菌疫苗抗原具有序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列(參 見序列表l)。
遲緩愛德華氏菌疫苗抗原的制備方法 1)質(zhì)粒pET258的構(gòu)建將質(zhì)粒pET25 (購自于美國Novogen公司)用 BglII/Ndel雙酶切后回收104bp片段；將質(zhì)粒pET28 (購自于美國Novogen 公司)用BglII/Ndel雙酶切后回收5. 3kb片段；將上述兩段DNA片段連接 用T4DNA連接酶于室溫連接2小時，連接液用Hanahan方法轉(zhuǎn)化入大腸桿 菌DH5cc后在含有卡那霉素(Kn, 50ug/ml )的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小 時，挑取抗卡那霉素的2個轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，測序驗證為正確重組質(zhì)粒。 將該質(zhì)粒命名為pET258。
2)質(zhì)粒構(gòu)建以遲緩愛德華氏菌TX1為模板，釆用EDF1和EDR1為引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94t60s預(yù)變性模板DNA,然后94。C40s， 54°C 60s, 72。C 60s, 5個循環(huán)后改為94°C 40s， 57°C 60s, 72。C 60s, 25個循環(huán) 后再在72flC延伸反應(yīng)10min。PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與 PCR克隆載體pBS-T (購自于"天根生化科技有限公司"，北京)于室溫連 接2小時，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后在含有100 ug/ml安卡青霉 素(Ap)、 40ug/ml XgaH5-溴-4-氯-3-吲哚-P-D-乳糖苷)和24 ug/ml異 丙基-(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時，篩選出 白色轉(zhuǎn)化子為質(zhì)粒pBSED。將質(zhì)粒pBSED用Ndel/Xhol雙酶切回收0. 58kb， 同時將步驟l)的質(zhì)粒pET258用Ndel/XhoI雙酶切回收5. 3kb片段;將質(zhì) 粒pBSED用Ndel/Xhol雙酶切回收0. 58kb與質(zhì)粒pET258用Ndel/Xhol雙 酶切回收5. 3kb片段用T4DNA連接酶于室溫連接2小時，連接液轉(zhuǎn)化入大 腸桿菌DH5a后在含有Kn ( 50ug/ml )的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時，挑 取2個轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒為質(zhì)粒pETED (參見序列表1 )。
所述LB組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0% 氯化鈉，97.5%蒸餾水；其中所述菌株TXl保存于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心CGMCC,保藏編號為CGMCC No. 2330，分類命名為遲緩愛德華氏菌MirardsieHa M油。
所述引物為EDF1 5， — CATATGACGACTATCGACAGCG -3，和EDM 5，-
CTCGAGGGACATGCGTACGCTGC -3，。
序列表1
CAGCAGCGTACGCATGTCCTGA
(a) 序列特征 *長度582bp
*類型堿基序列 *鏈型單鏈 參拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型雙鏈DNA
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源遲緩愛德華氏菌TX1
(f) 特異性名稱EseD
3 )質(zhì)粒pETED的誘導(dǎo)表達(dá)將上述步驟2 )的質(zhì)粒pETED轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)(購自于"天根生化科技有限公司",北京)，在含有Kn(50ug/ml) 的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時，挑取一個抗Kn的轉(zhuǎn)化子，即為BL21/pETED。 將BL21/pETED于含有Kn (50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取lml過 夜后的培養(yǎng)液將其加入100ml新鮮的含有Kn(50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中， 于37°C下轉(zhuǎn)速120rpm搖動培養(yǎng)至OD鋼為0. 6,加入終濃度為lmM的IPTG, 37。C繼續(xù)以轉(zhuǎn)速120rpm搖動培養(yǎng)5hr。而后將細(xì)菌培養(yǎng)液以5000g， 2°C， 離心10min,收集菌液，加入5ml裂解液，在室溫于搖床上緩慢搖動1小時， 直至菌懸液變澄清為止，而后再將菌液離心以10000g， 4°C，離心30min, 回收上清，純化重組蛋白即得具有序列表SEQ ID Nol的堿基序列的重組保 護(hù)性疫苗抗原EseD。
取1 Ou 1所獲得的上清加入等體積的2x蛋白上樣緩沖液，并在沸水中加 熱5min。而后將上述處理后的上清加入到0. 1%SDS-12%聚丙烯酰胺凝膠中， 用120伏電壓進(jìn)行垂直蛋白電泳1-2小時。取下凝膠，用考馬氏亮蘭染色 (參見圖1)。
根據(jù)上述蛋白條帶的亮度計算EseD在大腸桿菌中的表達(dá)量占宿主細(xì)菌 總蛋白的90%以上。
其中2x蛋白上樣緩沖液成分為100 mM Tris (pH6. 8), 4% (質(zhì)量百分比)SDS, 0. 2% (質(zhì)量百分比)溴酚藍(lán)，20% (體積百分比)甘油，2% (體積 百分比)P-疏基乙醇;裂解液成分50 mM NaH2P04， 300 mM NaCl， 10 mM咪 唑，pH8. 0;上述電泳緩沖液成分為0. 3% Tris, 1. 88°/。甘氨酸，0. 1% SDS。
所述重組保護(hù)性疫苗抗原EseD的純化將上述所得含有重組保護(hù)性疫 苗抗原EseD的大腸桿菌總蛋白與lml鎳親和膠(nickel-ni tr i lotr iacet ic acid)(購于美國Qiagen公司)混合，蛋白與鎳親和膠的體積比為5:1, 4°C 保溫lh,然后以5000g， 4"C離心lOniin,回收鎳親和膠將其與10ml洗滌緩 沖液混合，以5000g，4"C離心10min，而后再次用洗滌緩沖液重復(fù)清洗兩次， 最后回收鎳親和膠,將其與2 ml洗脫緩沖液混合，4。C保溫20 min，然后以 5000g, 4°C離心10min。收集上清，即為純化后的重組保護(hù)性疫苗抗原EseD。
取純化后的重組保護(hù)性疫苗抗原EseD lOul加入等體積的2x蛋白上樣 緩沖液，并在沸水中加熱5min。而后將上述處理后的上清加入到 0. P/。SDS-12y。聚丙烯酰胺凝膠中，用120伏電壓進(jìn)行垂直蛋白電泳1-2小時。 取下凝膠，用考馬氏亮蘭染色(參見圖2)。
根據(jù)上述蛋白條帶的亮度計算EseD的回收率為85%以上。
其中洗滌緩沖液組成成分為50 mM NaH2P04, 300 mM NaCl, 20 mM咪 唑，pH 8. 0;洗脫緩沖液組成成分為50 mM NaH2P04， 300 mM NaCl， 250 mM 咪哇，pH 8. 0。
實施例2
遲緩愛德華氏菌疫苗抗原具有序列表SEQ ID No.2中的堿基序列(參 見序列表2)。
遲緩愛德華氏菌疫苗抗原的制備方法 l)質(zhì)粒pET258的構(gòu)建將質(zhì)粒pET25 (購自于美國Novogen公司)用 BglII/Ndel雙酶切后回收104bp片段；將質(zhì)粒pET28 (購自于美國Novogen 公司)用BglII/Ndel雙酶切后回收5. 3kb片段；將上述兩段DNA片段連接 用T4DNA連接酶于室溫連接4小時，連接液用Hanahan方法轉(zhuǎn)化入大腸桿 菌DH5oc后在含有卡那霉素(Kn， 50ug/ml )的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小 時，挑取抗卡那霉素的2個轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，測序驗證為正確重組質(zhì)粒。 將該質(zhì)粒命名為pET258。
2)質(zhì)粒構(gòu)建以遲緩愛德華氏菌TX1為模板，釆用ETF1和ETR1為引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94"C60s預(yù)變性模板DNA，然后94°C 40s， 54°C 60s, 72°C 60s，5個循環(huán)后改為94。C 40s, 57。C 60s， 72。C 60s，25個循環(huán)后再 在72。C延伸反應(yīng)10min。 PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與PCR 克隆載體pBS-T (購自于"天根生化科技有限公司"，北京)于室溫連接4 小時，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5cc后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap )、 40ug/mi Xgal(5-溴_4_氯_3-吲哚-D-乳糖苷)和24 ug/ml異丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時，篩選出白色轉(zhuǎn)化子 為質(zhì)粒pBSET18。將質(zhì)粒pBSET18用Ndel/Xhol雙酶切回收0. 58kb，同時將步驟l )的質(zhì)粒pET258用Ndel/XhoI雙酶切回收5. 3kb片段；將質(zhì)粒pBSET18 用Ndel/Xhol雙酶切回收0. 58kb與質(zhì)粒pET258用Ndel/Xhol雙酶切回收 5. 3kb片段用T4DNA連接酶于室溫連接4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 a后在含有Kn ( 50ug/ml )的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時，挑取2個轉(zhuǎn)化 子提取質(zhì)粒為質(zhì)粒pET18 (參見序列表2)。
所述LB組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0% 氯化鈉，97.5%蒸餾水；其中所述菌株TX1保存于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心CGMCC,保藏編號為CGMCC No. 2330，分類命名為 遲緩愛德華氏菌丑dirardsieHa ta油。
所述引物為ETF1 5， - CATATG ACGATGCGTTTTCCCT —3，，和ETR1 5， 一 CTCGAGCTTCAGCAGCGAGAACGCG -3，。 序列表2:
TGTCACTACCGCGTTCTCGCTGCTGAAGTAA
U)序列特征 *長度591bp *類型堿基序列 *鏈型單鏈 參拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型雙鏈DM
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源遲緩愛德華氏菌TX1
(f) 特異性名稱Etl8
3 )質(zhì)粒pET18的誘導(dǎo)表達(dá)將上述步驟2 )的質(zhì)粒pET18轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)(購自于"天根生化科技有限公司",北京)，在含有Kn(50ug/ml) 的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時，挑取一個抗Kn的轉(zhuǎn)化子，即為BL21/pET18。 將BL21/pET18于含有Kn(50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取lml過 夜后的培養(yǎng)液將其加入100ml新鮮的含有Kn (50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中， 于37"C下轉(zhuǎn)速120rpm搖動培養(yǎng)至OD刷為0. 6，加入終濃度為lmM的IPTG， 37。C繼續(xù)以轉(zhuǎn)速120rpm搖動培養(yǎng)4hr。而后將細(xì)菌培養(yǎng)液以5000g, 4。C, 離心15min,收集菌液，加入5ml裂解液，在室溫于搖床上緩慢搖動2小時， 直至菌懸液變澄清為止，而后再將菌液離心以10000g， 4"C，離心30min， 回收上清，純化重組蛋白即得具有序列表SEQ ID No. 2中的堿基序列的重 組保護(hù)性疫苗抗原ET18。取lOul所獲得的上清加入等體積的2x蛋白上樣緩沖液，并在沸水中 加熱5min。而后將上述處理后的上清加入到0. 1%SDS-12%聚丙烯酰胺凝膠 中，用120伏電壓進(jìn)行垂直蛋白電泳1-2小時。取下凝膠，用考馬氏亮蘭 染色(參見圖3)。
根據(jù)上述蛋白條帶的亮度計算ET18在大腸桿菌中的表達(dá)量約占宿主細(xì) 菌總蛋白的15%。
其中2x蛋白上樣緩沖液成分為100 mM Tris (pH6. 8) ， 4% (質(zhì)量百分 比)SDS, 0.2% (質(zhì)量百分比)溴酚藍(lán)，20% (體積百分比)甘油，2% (體 積百分比)(3-疏基乙醇;裂解液成分50 mM NaH2P04， 300 mM NaCl， 10 mM 咪唑，pH8. 0;上述電泳緩沖液成分為0. 3°/。Tris， 1. 88%甘氨酸，0. 1% SDS。
所述重組保護(hù)性疫苗抗原ET18的純化將上述所得重組保護(hù)性疫苗抗 原EseD或ET18的大腸桿菌總蛋白與lml Ni-NTA( nickel-nitrilotriacetic acid) beads (購于美國Qiagen公司)混合蛋白與Ni-NTA的體積比為5: 1, 4"C保溫lh,然后以5000g， 4°C離心15min，回收Ni-NTA beads將其與20ml 洗滌緩沖液混合，以5000g， 4°C離心15min，而后再次用洗滌緩沖液重復(fù)清洗 4次，最后回收Ni-NTA beads,將其與2 ml洗脫緩沖液混合，4°C保溫20 min， 然后以5000g， 4°C離心10min。收集上清，即為純化后的重組保護(hù)性疫苗 抗原ET18。
取純化后的重組保護(hù)性疫苗抗原ET18 lOul加入等體積的2x蛋白上樣 緩沖液，并在沸水中加熱5min。而后將上述處理后的上清加入到 0. 1%SDS-12%聚丙烯酰胺凝膠中，用120伏電壓進(jìn)行垂直蛋白電泳1-2小時。 取下凝膠，用考馬氏亮蘭染色(參見圖4)。
根據(jù)上述蛋白條帶的亮度計算ET18回收率為90%以上。 其中洗滌緩沖液組成成分為50 mM NaH2P04， 300 mM NaCl,20 mM咪唑， pH 8. 0;洗li緩沖液組成成分為50 mM NaH2P04, 300 mM NaCl， 250 mM咪唑， pH 8. 0。 實施例3
與實施例l與2制備重組保護(hù)性疫苗抗原EseD和ET18不同之處在于 1 )質(zhì)粒pET258構(gòu)建將經(jīng)BglII/Ndel雙酶切的質(zhì)粒pET25回收的104bp 片段與經(jīng)BglII/Ndel雙酶切的質(zhì)粒pET28回收的5. 3kb片段用T4DNA連接 酶連接3小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中并在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上培 養(yǎng)20小時，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為pET258;
2)質(zhì)粒構(gòu)建PCR擴(kuò)增后純化產(chǎn)物與載體pBS-T載體于室溫連接3小 時，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌后在含卡那霉素、xgai、異丙基-p-D-硫代半 乳糖苷的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)20小時，篩選出白色轉(zhuǎn)化子；而后將篩選出白色 轉(zhuǎn)化子用Ndel/Xhol雙酶切回收0. 58kb，同時將步驟1)的質(zhì)粒pET258用 Ndel/Xhol雙酶切回收5. 3kb片段；將篩選出白色轉(zhuǎn)化子用Ndel/Xhol雙酶 切回收0. 58kb與質(zhì)粒pET258用Ndel/Xhol雙酶切回收5. 3kb片段用T4DNA連接酶于室溫連接3小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5oc后在含有Kn (50ug/ml )的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)20小時，挑取2個轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒；
3)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)將步驟2)的所得轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，在 含有Kn的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)20小時篩選轉(zhuǎn)化子；將轉(zhuǎn)化子于含有Kn的LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；而后再將培養(yǎng)液加入到新鮮的含有Kn的LB液體培養(yǎng) 基中，于37。C搖動培養(yǎng)至OD,為0.6，加入終濃度為lmM的異丙基-P-D-硫代半乳糖苷，37C繼續(xù)搖動培養(yǎng)4.5小時，裂解菌體，離心收集上清， 純化重組蛋白，即為重組保護(hù)性疫苗抗原。
所述將步驟3)離心所得抗原蛋白純化時將離心收集的大腸桿菌總蛋白 與鎳親和膠混合于4。C保溫1.5h，然后以5000g， 4t離心12min,回收沉 淀將其與15 ml洗滌緩沖液混合離心洗滌2次，回收沉淀將其與2 ml洗脫 緩沖液混合與4t保溫25 niin,而后離心收集上清。SEQUENCE LISTING < 110〉 中國科學(xué)院海洋研究所 <120>遲緩愛德華氏菌疫苗抗原及其制備方法 <130〉
<160〉 2
<170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1
<211〉 582
<212〉 DNA
<213>遲緩愛德華氏菌TXl <220>
<221〉 EseD
〈222〉 (1),.(582) 〈223〉
<400> 1
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〈212〉 DNA
<213〉遲緩愛德華氏菌TXl <220〉<221> EU8 〈222〉 (1). . (591) <223>
〈400> 2
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aaagtcagcgtgtcactaccgcgttctcgctgctgaagtaa59權(quán)利要求
1.一種遲緩愛德華氏菌疫苗抗原，其特征在于具有序列表SEQ IDNo.1。
2. —種按權(quán)利要求l所述的遲緩愛德華氏菌疫苗抗原的制備方法，其 特征在于1)質(zhì)粒pET258構(gòu)建將經(jīng)BglII/Ndel雙酶切的質(zhì)粒pET25回收的104bp 片段與經(jīng)BglII/Ndel雙酶切的質(zhì)粒pET28回收的5. 3kb片段用T4DNA連接 酶連接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中并在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上 培養(yǎng)18-24小時，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為pET258;2)質(zhì)粒構(gòu)建以菌株TX1為模板，釆用EDF1和EDR1為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，純化產(chǎn)物后與載體PBS-T載體于室溫連接2 - 4小時，連接混合液轉(zhuǎn) 化大腸桿菌后在含卡那霉素、xgai、異丙基-p-D-硫代半乳糖苷的LB培養(yǎng) 基上培養(yǎng)18 - 24小時，篩選出白色轉(zhuǎn)化子為質(zhì)粒pBSED;而后將質(zhì)粒pBSED 用Ndel/Xhol雙酶切回收0. 58kb，同時將步驟1 )的質(zhì)粒pET258用Ndel/Xhol 雙酶切回收5. 3kb片段；將質(zhì)粒pBSED用Ndel/Xhol雙酶切回收0. 58kb與 質(zhì)粒pET258用Ndel/Xhol雙酶切回收5. 3kb片段用T4DNA連接酶于室溫連 接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5oc后在含有Kn (50ug/ml )的LB 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，挑取2個轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒為質(zhì)粒pETED;其中所述菌株TX1保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心CGMCC,保藏編號為CGMCC No. 2330，分類命名為遲緩愛德華氏菌；所述引物EDF1 5， - CATATGACGACTATCGACAGCG -3，和EDR1 (5，-CTCGAGGGACATGCGTACGCTGC -3，；5質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)將步驟2)的質(zhì)粒pETED轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，在 含有Kn的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，篩選轉(zhuǎn)化子即為BL21/pETED;將 BL21/pETED于含有Kn的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；而后再將培養(yǎng)液加入到新 鮮的含有Kn的LB液體培養(yǎng)基中，于37'C搖動培養(yǎng)至0D,為0. 6，加入終 濃度為lmM的異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷，37。C繼續(xù)搖動培養(yǎng)4-5小時， 裂解菌體，離心收集上清，純化重組蛋白，即為具有序列表SEQ IDNol的 堿基序列的重組保護(hù)性疫苗抗原EseD;其中培養(yǎng)液與新鮮的含有Kn的LB液體培養(yǎng)基體積比為1:100; BL21/pETED與含有Kn的LB培養(yǎng)基體積比1: 100。
3.—種遲緩愛德華氏菌疫苗抗原，其特征在于具有序列表No.2中的 堿基序歹'j。
4.一種按權(quán)利要求3所述的遲緩愛德華氏菌疫苗抗原的制備方法，其 特征在于1)質(zhì)粒pET258構(gòu)建將經(jīng)BglII/Ndel雙酶切的質(zhì)粒pET25回收的104bp片段與經(jīng)BglII/Ndel雙酶切的質(zhì)粒pET28回收的5. 3kb片段用T4DNA連接 酶連接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中并在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上 培養(yǎng)18-24小時，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為pET258;2)質(zhì)粒構(gòu)建以菌株TX1為模板,釆用ETF1和ETR1為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，純化產(chǎn)物后與載體PBS-T載體于室溫連接2-4小時，連接混合液轉(zhuǎn) 化大腸桿菌后在含卡那霉素、Xgal、異丙基-D-硫代半乳糖苷的LB培養(yǎng) 基上培養(yǎng)18-24小時，篩選出白色轉(zhuǎn)化子為質(zhì)粒pBSET18;而后將質(zhì)粒 pBSET18用Ndel/Xho1雙酶切回收0. 58kb，同時將步驟1 )的質(zhì)粒pET258用 脂/XhoI雙酶切回收5. 3kb片段；將質(zhì)粒pBSET18用Ndel/Xho1雙酶切回 收0. 58kb與質(zhì)粒pET258用Ndel/Xho1雙酶切回收5. 3kb片段用T4DNA連 接酶于室溫連接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5oc后在含有Kn (50ug/ml )的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，挑取2個轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒 為質(zhì)粒pET18;其中所述菌株TX1保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心CGMCC,保藏編號為CGMCC No. 2330，分類命名為遲緩愛德華氏菌；所述引物ETF1 5， - CATATG ACGATGCGTTTTCCCT -3，，和ETR1 5，-CTCGAGCTTCAGCAGCGAGAACGCG -3，；5質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)將步驟2)的pET18轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，在含有 Kn的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，篩選轉(zhuǎn)化子即為BL21/pET18;將 BL21/pET18于含有Kn的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；而后再將培養(yǎng)液加入到新 鮮的含有Kn的LB液體培養(yǎng)基中，于37'C搖動培養(yǎng)至0D,為0. 6，加入終 濃度為lmM的異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷，37。C繼續(xù)搖動培養(yǎng)4-5小時， 裂解菌體，離心收集上清，純化重組蛋白，即為具有序列表SEQ ID No. 2 中的堿基序列的重組保護(hù)性疫苗抗原ET18;其中培養(yǎng)液與新鮮的含有Kn的LB液體培養(yǎng)基體積比為1:100; BL21/pET18與含有Kn的LB培養(yǎng)基體積比1: 100。
5. 按權(quán)利要求2或4所述的遲緩愛德華氏菌疫苗抗原的制備方法，其 特征在于所述步驟2)中PCR條件為94°C 60s預(yù)變性模板DNA，然后 94°C 40s， 54°C 60s, 72°C 60s, 5個循環(huán)后改為94。C 40s， 57°C 60s, 72°C 60s, 25個循環(huán)后再在72t延伸反應(yīng)lOmin。
6. 按權(quán)利要求2或4所述的遲緩愛德華氏菌疫苗抗原的制備方法，其 特征在于所述步驟2)含卡那霉素、Xgal、異丙基-p-D-硫代半乳糖苷的 LB培養(yǎng)基中含有50ug/ml卡那霉素、40ug/ml Xgal和24ug/ml異丙基-|3 -D-硫代半乳糖苷。
7. 按按權(quán)利要求2或4所述的保護(hù)性疫苗抗原制備方法，其特征在于 所述將步驟3)離心所得抗原蛋白純化時將離心收集的大腸桿菌總蛋白與鎳 親和膠混合于4t保溫1-2h，然后以5000g, 4。C離心10-15min,回收沉淀 將其與10-20 ml洗滌緩沖液混合離心洗滌2-4次，回收沉淀將其與2 ml洗脫緩沖液混合與4t保溫20-30 min，而后離心收集上清，其中鎳親和膠 與大腸桿菌總蛋白按體積比1: 5混合。
8.按按權(quán)利要求7所述的保護(hù)性疫苗抗原制備方法，其特征在于所 述洗滌緩沖液組成成分為50mM NaH2P04， 300mM NaCl, 20mM咪唑，pH 8. 0; 洗脫緩沖液組成成分為50mM NaH2P04， 300mM NaCl， 250 mM咪唑，pH 8. 0。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說是遲緩愛德華氏菌疫苗抗原及其制備方法。具體為所述疫苗抗原具有序列表SEQ ID No.1或No.2中的堿基序列。構(gòu)建方法以遲緩愛德華氏菌TX1為模板，用引物EDF1/EDR1或ETF1/ETR1進(jìn)行PCR；PCR產(chǎn)物與pET258質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌得pETED和pET18，而后誘導(dǎo)表達(dá)得抗原EseD和ET18。本發(fā)明所得疫苗抗原廣泛存在于病原性遲緩愛德華氏菌中，具高度保守性；其原核高效表達(dá)系統(tǒng)能夠用于大量表達(dá)上述保護(hù)抗原，由此制備的抗原蛋白保有其天然免疫活性，可以直接用于免疫防治。
文檔編號A61P31/04GK101319009SQ20081001612
公開日2008年12月10日 申請日期2008年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月9日
發(fā)明者侯進(jìn)慧, 黎 孫 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所