專利名稱：牛乳腺炎疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗的制備方法，特別是涉及一種牛乳腺炎疫苗的制備方法。
臨床的牛乳腺炎的病例是由環(huán)境中細(xì)菌引起的，而且細(xì)菌牛乳腺炎的發(fā)病率最近幾年的總的百分?jǐn)?shù)有急劇上升的趨勢(shì)。細(xì)菌是一種存在于環(huán)境中的微生物，。但是在奶牛產(chǎn)奶后，由于乳腺孔是開放的，極易引起乳腺的細(xì)菌的感染，進(jìn)而引起牛乳腺炎的發(fā)生。革蘭氏陰性菌是使牛奶產(chǎn)量減少，損害牛的健康，引起奶牛死亡的主要原因，而革蘭氏陰性菌細(xì)菌引起牛乳腺炎的病例中又以大腸桿菌(E.coli)所引起的臨床病例最為常見，大約60％的牛乳腺炎是由大腸桿菌(E.coli)所引起的。
目前國(guó)內(nèi)外對(duì)牛乳腺炎的治療是抗生素和疫苗，然而抗生素治療牛乳腺炎存在諸多不利的因素(1)易出現(xiàn)抗藥性和耐藥性；(2)單一藥物抗菌譜不夠廣，影響療效；(3)易造成牛奶中藥物殘留及奶牛體內(nèi)藥物蓄積，危及人類健康；(4)易引起其它的副作用，如奶牛的腸道菌群失調(diào)，影響食欲、胃腸功能以及生產(chǎn)性能等?；诖?，許多年以來全世界的畜牧獸醫(yī)研究人員一直致力于一種安全，有效，價(jià)格低廉的預(yù)防和治療牛乳腺炎的藥物的研究和開發(fā)。經(jīng)過廣泛的試驗(yàn)，各種牛乳腺炎疫苗在世界各地相繼被開發(fā)和投入到生產(chǎn)使用中。這些牛乳腺炎疫苗均是采用傳統(tǒng)的生產(chǎn)疫苗的方法，如加熱、化學(xué)滅活(甲醛或酚)和照射等制備的，而這些方法均可對(duì)免疫原性造成一些損害，對(duì)于正確地刺激動(dòng)物免疫系統(tǒng)必需的重要的表位/抗原有傷害。同時(shí)又產(chǎn)生一些替代的或“非天然”的疫苗抗原，這些化學(xué)物質(zhì)必須從疫苗中除去，否則會(huì)造成環(huán)境健康和安全性的問題。同時(shí)這些用傳統(tǒng)方法制備的牛乳腺炎疫苗的內(nèi)毒素含量高，副作用大。
利用疫苗防治牛乳腺炎最常見的一個(gè)問題是細(xì)菌抗原的變異，即細(xì)菌利用免疫系統(tǒng)的抗體只識(shí)別非常特異的抗原并依次接合到細(xì)胞表面的特性，細(xì)菌不停地改變它們的表面結(jié)構(gòu)，使得免疫系統(tǒng)在產(chǎn)生新的抗體時(shí)總是落后于細(xì)菌，造成了牛乳腺炎疫苗在第一年時(shí)效果良好，在第二年卻不幸的失敗。解決上述問題是提高免疫系統(tǒng)的能力，包括(1)識(shí)別細(xì)菌不易改變的部分；(2)選擇革蘭氏陰性細(xì)菌(大腸桿菌、沙門氏菌和白喉?xiàng)U菌等)的通用結(jié)構(gòu)。在對(duì)牛乳腺炎疫苗的研究開發(fā)的過程中，人們發(fā)現(xiàn)在所有的革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁的內(nèi)層都存在一個(gè)區(qū)域，內(nèi)含通用核心通用抗原，在細(xì)菌生長(zhǎng)的最快的時(shí)期(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)，這個(gè)部位暴露于免疫系統(tǒng)，且它含有革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素部分-脂質(zhì)A，這樣可以通過抗體結(jié)合內(nèi)毒素達(dá)到減少內(nèi)毒素的作用。利用這個(gè)原理，J5大腸桿菌(E.Coli)是最初采用核心通用抗原來制備牛乳腺炎疫苗。但是由于J5大腸桿菌(E.Coli)疫苗制備時(shí)采用的是傳統(tǒng)的制備疫苗的方法，仍然有傳統(tǒng)方法所有的一些弊端，并沒有充分發(fā)揮出核心通用抗原大腸桿菌(E.Coli)疫苗的優(yōu)勢(shì)。
在微生物學(xué)的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陰性菌在蔗糖-6果糖轉(zhuǎn)移酶(sacB)存在，在蔗糖為底物誘導(dǎo)的情況下，可以殺滅自身，這種自殺方式并不需要改變自身的外膜蛋白(疫苗抗原或表位)，同時(shí)用來誘發(fā)這種滅活性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)是無毒的蔗糖。
本發(fā)明牛乳腺炎疫苗的制備方法包括以下步驟a.提取含有蔗糖-6果糖轉(zhuǎn)移酶(sacB)基因的質(zhì)粒；
b.制備革蘭氏陰性菌感受態(tài)細(xì)胞；c.轉(zhuǎn)化步驟a中提取含有的蔗糖-6果糖轉(zhuǎn)移酶(sacB)基因的質(zhì)粒進(jìn)入步驟b所制備的革蘭氏陰性菌感受態(tài)細(xì)胞中；d.鑒定，獲得轉(zhuǎn)化的革蘭氏陰性菌；e.已轉(zhuǎn)化的革蘭氏陰性菌在細(xì)菌培養(yǎng)基中生長(zhǎng)直到濃度達(dá)到105-1012CFU/ml；f.收集步驟e中的已轉(zhuǎn)化的革蘭氏陰性菌，室溫，400g，離心20分鐘；g.棄上清液，用1-10％(體積比)的蔗糖和清洗物質(zhì)清洗疫苗，重懸浮，在37℃下，混合20分鐘，誘導(dǎo)自殺性蔗糖-6果糖轉(zhuǎn)移酶(sacB)基因表達(dá)，混合物在400g，4℃下再次離心，棄上清液；h.重復(fù)步驟g兩次；i.疫苗在清洗物質(zhì)中被懸浮，按佐劑和疫苗體積比為3∶2的比例加入佐劑，使疫苗每一次免疫量的濃度為8.0×105CFU或以上。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明牛乳腺炎疫苗的制備方法，由于采用核心通用抗原與自殺性革蘭氏陰性菌結(jié)合的制備方法，不會(huì)對(duì)疫苗的免疫原性造成損害，不會(huì)傷害正確地刺激動(dòng)物免疫系統(tǒng)必需的重要的表位/抗原，不會(huì)產(chǎn)生替代的或非天然的疫苗抗原，所用的化學(xué)誘導(dǎo)物質(zhì)是食用的無毒的蔗糖，不必從疫苗中除去這些誘導(dǎo)物。同時(shí)制備的疫苗大大減少了傳統(tǒng)制備疫苗方法象加熱，或化學(xué)滅活(甲醛或酚)及照射可能產(chǎn)生的致癌疫苗的機(jī)會(huì)。同時(shí)可以大大減少疫苗中的內(nèi)毒素，減少副作用，刺激免疫系統(tǒng)抵御全部的大腸桿菌，沙門氏菌等革蘭氏陰性菌所引起的牛乳腺炎，進(jìn)而有效的預(yù)防牛乳腺炎的發(fā)生。
(c)分別同時(shí)轉(zhuǎn)移上述4瓶混合物到4個(gè)在冰上預(yù)冷電穿孔的小槽中；(d)在200歐姆的電阻下，用1.8千伏電壓電穿孔5微秒；(e)迅速加1ml室溫下的培養(yǎng)基SOC到電穿孔的小槽中，輕輕地，但迅速地重懸浮細(xì)胞；(f)轉(zhuǎn)移重懸浮的細(xì)胞到4個(gè)新的離心管中，在37℃，水浴搖床中溫育1小時(shí)；(g)將上述轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂抹平鋪在合適的選擇性培養(yǎng)基中，在37℃下溫育過夜；(1)40ml大腸桿菌(E.coli)J5的感受態(tài)細(xì)胞和2mlpHSS21質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂抹平鋪在具有卡那霉素抗性的TSA培養(yǎng)基中；(2)40ml大腸桿菌(E.coli)J5的感受態(tài)細(xì)胞和2mlpUC19質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂抹平鋪在具有氨卡青霉素抗性的TSA培養(yǎng)基中；(3)40ml大腸桿菌(E.coli)J5的感受態(tài)細(xì)胞和2ml的重蒸無菌水的轉(zhuǎn)化細(xì)胞分別涂抹平鋪在具有卡那霉素抗性和氨卡青霉素抗性的TSA培養(yǎng)基中；(4)40ml的大腸桿菌(E.coli)J5感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化細(xì)胞分別涂抹平鋪在具有卡那霉素抗性和氨卡青霉素抗性的TSA培養(yǎng)基中。4.利用蔗糖敏感性檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞1.分別加入3個(gè)懷疑是轉(zhuǎn)化細(xì)胞的大腸桿菌(E.coli)克隆到3個(gè)50ml含有卡那霉素的TSB的培養(yǎng)基中，37℃下溫育20小時(shí)；2.轉(zhuǎn)移1ml過夜的培養(yǎng)物到50ml含有卡那霉素的TSB的培養(yǎng)基中；3.記錄培養(yǎng)物的OD580值，把培養(yǎng)物放在37℃的水浴搖床中培養(yǎng)；4.當(dāng)OD580增加10倍時(shí)，在2000g，離心10分鐘；5.棄上清液，在13ml的10mM Na3PO4(PH7.4)的緩沖液中重懸浮沉淀；6.在2000g，離心10分鐘，沉淀菌體；7.在10ml的10mM Na3PO4(PH7.4)的緩沖液中重懸浮沉淀。
8.加34.5ul樣品到1ml的10mM Na3PO4(PH7.4)的緩沖液中，測(cè)培養(yǎng)物的OD620值。
9.調(diào)整所得到的液體培養(yǎng)物達(dá)到1×107CFU/ml；10.取10ml樣品，用10mM Na3PO4(PH7.4)的緩沖液稀釋10倍，加入蔗糖使蔗糖的最終濃度為1.0，2.5，5.0，10.0％。
11.在37℃培養(yǎng)，在30，60，90，120分鐘時(shí)取樣，放在TSB平板中檢測(cè)，若沒有克隆菌落生長(zhǎng)，可初步斷定是轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
12.取上述初步判定的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，在500ml卡那霉素的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)；13.在搖床中溫育上述培養(yǎng)物，直到培養(yǎng)物達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài)，即可見光的吸收密度值OD600不再增加；
14.在每個(gè)樣品中加入蔗糖使蔗糖的最終濃度為1.0，2.5，5.0，10.0％；15.在37℃的水浴搖床中培養(yǎng)。
16.在30，60，90，120分鐘時(shí)取樣0.25ml加入2ml的含有卡那霉素的濃度為35g/ml的TSB培養(yǎng)基中。
17. 37℃，溫育樣品過夜，第二天測(cè)樣品的可見光的吸收密度值OD600，進(jìn)一步判斷轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
結(jié)果表明在轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，加入誘導(dǎo)自殺的蔗糖的最終濃度范圍是1-10％，優(yōu)選的蔗糖最終的濃度范圍是2.5％-5.0％，制備疫苗的最佳的時(shí)間是加入蔗糖以后30-120分鐘，優(yōu)選的制備疫苗的最佳的時(shí)間是加入蔗糖以后60-90分鐘。5.挑選上述判定的已轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(E.coli)J8，在胰酶解酪蛋白-大豆培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，當(dāng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(E.coli)J8濃度達(dá)到105-1012；6.收集步驟5中的J8大腸桿菌，室溫，400g，離心20分鐘；7.棄上清液，用2.5-5％(體積比)的蔗糖和無菌的非熱的鹽，重懸浮疫苗，在37℃下，混合20分鐘，混合物在400g，4℃下再次離心，棄上清液；8.重復(fù)步驟7兩次；9.疫苗在無菌的非熱的鹽被懸浮，按佐劑和疫苗體積比為3∶2的比例加入佐劑，使疫苗每一次免疫量的濃度為6.0×109CFU。
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面結(jié)合具體的試驗(yàn)來說明本發(fā)明牛乳腺炎疫苗的制備方法在減少內(nèi)毒素、副作用、抗革蘭氏陰性菌的廣普性、疫苗的安全性及預(yù)防牛乳腺炎方面的有益效果。試驗(yàn)1用鱟阿米巴樣細(xì)胞裂解物檢測(cè)(LAL)方法檢測(cè)疫苗中內(nèi)毒素(EU)的含量在疫苗自殺滅活后，用無菌的非熱源的鹽(sterile，nonpyrogenic saline)洗制備的疫苗3次，用鱟阿米巴樣細(xì)胞裂解物檢測(cè)(LAL)方法檢測(cè)本發(fā)明制備疫苗在用無菌的非熱源的鹽(sterile，nonpyrogenic saline)洗前洗后及與3種常用的牛乳腺炎革蘭氏陰性菌疫苗中內(nèi)毒素(EU)的含量的平均值。
檢測(cè)結(jié)果如表1表1幾種牛乳腺炎疫苗的內(nèi)毒素(EU)的含量

試驗(yàn)結(jié)果表明用本發(fā)明的方法制備的牛乳腺炎的疫苗的內(nèi)毒素通過用無菌的非熱源的鹽(sterile，nonpyrogenic saline)洗3次以后，游離的內(nèi)毒素的含量減少了大約90％左右。每毫升的疫苗中內(nèi)毒素的含量不到50,000EU，且大大低于傳統(tǒng)制備疫苗方法中內(nèi)毒素的平均水平。試驗(yàn)2牛乳腺炎疫苗的免疫保護(hù)試驗(yàn)選用6頭奶牛為試驗(yàn)組，3頭奶牛做對(duì)照，用本發(fā)明制備的疫苗免疫接種，接種時(shí)間分別是干奶期，干奶中期，和產(chǎn)小牛后兩周內(nèi)每次皮下注射2ml，之后接種大腸桿菌(E.Coli)300CFU，進(jìn)行免疫保護(hù)試驗(yàn)。在接種病原菌7天后，立刻觀察臨床癥狀和培養(yǎng)有無細(xì)菌出現(xiàn)，若有細(xì)菌出現(xiàn)，通過標(biāo)準(zhǔn)的微生物學(xué)技術(shù)鑒定。
試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組的3頭奶牛都出現(xiàn)了臨床癥狀，且其中一頭在免疫保護(hù)7天后，因?yàn)閲?yán)重的癥狀，不得不實(shí)施安樂死。而試驗(yàn)組在接種12小時(shí)后，出現(xiàn)了臨床癥狀，其中5頭奶?；謴?fù)正常狀況，沒有一頭奶牛死亡。對(duì)照組的3頭奶牛在病圈中平均天數(shù)是7天，而試驗(yàn)組在病圈中的天數(shù)是3天，利用抗生素治療使患乳腺炎的奶?；謴?fù)健康的天數(shù)是14天，而利用疫苗治療的天數(shù)是8天。具體的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果見表2表2免疫保護(hù)7天后牛乳腺炎疫苗的免疫效果

試驗(yàn)3牛乳腺炎疫苗減少副作用(安全性)試驗(yàn)a.用3頭4個(gè)月的奶牛，它們?cè)谂R床上是健康的，即正常的體溫，正常的白細(xì)胞數(shù)，食欲良好，正常的糞便。在免疫接種前記錄它們的直腸的體溫。皮下接種疫苗標(biāo)簽劑量的10倍，72小時(shí)觀察奶牛有無不良反應(yīng)。在72小時(shí)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)被試驗(yàn)的奶牛有異常的現(xiàn)象。
b.用3組，每組6頭懷孕6-7月的小母牛以疫苗標(biāo)簽數(shù)量皮下接種疫苗，每周接種疫苗一次，連續(xù)三周。在第三次接種一周以后，通過直腸觸診確認(rèn)試驗(yàn)的動(dòng)物是否仍在懷孕，結(jié)果表明，3組試驗(yàn)中，只有一組有1頭懷孕6-7月的小母牛流產(chǎn)。
試驗(yàn)結(jié)果表明，本疫苗是安全的。試驗(yàn)4利用酶連免疫吸附反應(yīng)(ELISA)檢測(cè)J8疫苗的血清學(xué)反應(yīng)選用20頭12個(gè)月，健康的正常食欲的母牛，4組，每組5頭，用牛乳腺炎疫苗J8進(jìn)行陽性血清學(xué)反應(yīng)試驗(yàn)。在免疫接種前，取每頭試驗(yàn)動(dòng)物的血清，每份血清3等份，在40℃或更底溫度下冷藏。以不同的劑量皮下接種疫苗，每周接種疫苗一次，連續(xù)三周。在最后一次免疫后一周，取每頭試驗(yàn)動(dòng)物的免疫后血清，每份血清3等份，通過酶連免疫吸附反應(yīng)檢測(cè)免疫后免疫球蛋白(IgG和IgM)的ELISA值。表3酶連免疫吸附反應(yīng)(ELISA)檢測(cè)疫苗的血清學(xué)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明在4組免疫動(dòng)物中都產(chǎn)生了免疫球蛋白的抗體，接種J8疫苗后，免疫球蛋白IgG的ELISA值最多是免疫前的90倍。可以看出，J8疫苗能產(chǎn)生有效免疫效果的CFU最小的含量是8.0×105，優(yōu)選的CFU含量范圍是8.0×105-5.0×1010，更優(yōu)選的CFU含量范圍是6.0×109。試驗(yàn)5交叉反應(yīng)免疫吸附試驗(yàn)取來自于試驗(yàn)4的第3組的J8免疫血清，用酶連免疫吸附反應(yīng)(ELISA)測(cè)定抗大腸桿菌抗體與革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌的交叉反應(yīng)免疫吸附。試驗(yàn)結(jié)果見表4
表4J8牛乳腺炎疫苗和革蘭氏陰性菌的交叉反應(yīng)免疫吸附(IgG ELISA)試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，通過本發(fā)明方法制備疫苗產(chǎn)生的抗體可以和其它廣闊范圍的革蘭氏陰性菌產(chǎn)生交叉反應(yīng)抗體，證明了通過本發(fā)明試驗(yàn)方法制備的牛乳腺炎J8疫苗對(duì)革蘭氏陰性菌是通用的。
權(quán)利要求
1.一種制備牛乳腺炎疫苗的方法，包括如下步驟a.提取含有蔗糖-6果糖轉(zhuǎn)移酶(sacB)基因的質(zhì)粒；b.制備革蘭氏陰性菌感受態(tài)細(xì)胞；c.轉(zhuǎn)化步驟a中提取含有的蔗糖-6果糖轉(zhuǎn)移酶(sacB)基因的質(zhì)粒進(jìn)入步驟b所制備的革蘭氏陰性菌感受態(tài)細(xì)胞中；d.鑒定，獲得轉(zhuǎn)化的革蘭氏陰性菌；e.已轉(zhuǎn)化的革蘭氏陰性菌在細(xì)菌培養(yǎng)基中生長(zhǎng)直到濃度達(dá)到105-1012CFU/ml；f.收集步驟e中的已轉(zhuǎn)化的革蘭氏陰性菌，室溫，400g，離心20分鐘；g.棄上清液，用1-10％(體積比)的蔗糖和清洗物質(zhì)清洗疫苗，重懸浮，在37℃下，混合20分鐘，誘導(dǎo)自殺性蔗糖-6果糖轉(zhuǎn)移酶(sacB)基因表達(dá)，混合物在400g，4℃下再次離心，棄上清液；h.重復(fù)步驟g兩次；i.疫苗在清洗物質(zhì)中被懸浮，按佐劑和疫苗體積比為3∶2的比例加入佐劑，使疫苗每一次免疫量的濃度為8.0×105CFU或以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備牛乳腺炎疫苗的方法，其特征在于步驟a中所用的質(zhì)粒是pHSS21。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備牛乳腺炎疫苗的方法，其特征在于步驟b中所用的革蘭氏陰性菌是大腸桿菌(E.coli)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備牛乳腺炎疫苗的方法，其特征在于其中所用的大腸桿菌是J5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備牛乳腺炎疫苗的方法，其特征在于步驟d中所用的轉(zhuǎn)化的革蘭氏陰性菌是J8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備牛乳腺炎疫苗的方法，其特征在于步驟g中誘導(dǎo)物蔗糖的最佳濃度是2.5％-5％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備牛乳腺炎疫苗的方法，其特征在于步驟f和i中所用清洗物質(zhì)是無菌的非熱的鹽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備牛乳腺炎疫苗的方法，其特征在于步驟i中優(yōu)選的制備疫苗的每次免疫量的濃度是8.0×105-5.0×1010。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備牛乳腺炎疫苗的方法，其特征在于最優(yōu)選的制備疫苗的每次免疫量濃度是6.0×109。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牛乳腺炎疫苗的制備方法。本發(fā)明提供了利用含有核心通用抗原的革蘭氏陰性菌，通過含有蔗糖－6果糖轉(zhuǎn)移酶(sacB)基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，在蔗糖的誘導(dǎo)下，使革蘭氏陰性菌自殺，收集這些含有核心通用抗原的革蘭氏陰性菌，制備牛乳腺炎的疫苗的方法。本發(fā)明牛乳腺炎疫苗的制備方法不會(huì)對(duì)疫苗的免疫原性造成損害，不會(huì)產(chǎn)生替代的或非天然的疫苗抗原，所用的化學(xué)誘導(dǎo)物質(zhì)是食用的無毒的蔗糖。同時(shí)可以大大減少疫苗中的內(nèi)毒素，減少副作用，刺激免疫系統(tǒng)抵御全部的大腸桿菌，沙門氏菌等革蘭氏陰性菌所引起的牛乳腺炎。
文檔編號(hào)A61K39/02GK1432408SQ0210230
公開日2003年7月30日 申請(qǐng)日期2002年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月15日
發(fā)明者詹古拉 申請(qǐng)人:恒信環(huán)球農(nóng)業(yè)科技有限公司