專利名稱：一種在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖、而在正常細(xì)胞內(nèi)基本不增殖、并在腫瘤細(xì)胞高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒，及其構(gòu)建和增殖的方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤嚴(yán)重危及人類的生命健康。目前對惡性腫瘤的常規(guī)治療仍為手術(shù)及放、化療，這種常規(guī)治療對極大多數(shù)腫瘤的療效仍不十分理想，對于極大多數(shù)化療藥物而言，其治療指數(shù)仍較低，即其治療劑量與毒性劑量較為接近。故這種治療方案通常伴有明顯的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制等。因此，研究選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞的方法對腫瘤治療非常重要，這種選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞的方法主要依賴于腫瘤細(xì)胞的特異性標(biāo)記，其療效也決定于該腫瘤標(biāo)記是否嚴(yán)格限制于腫瘤細(xì)胞內(nèi)。
大約90％腫瘤細(xì)胞具有端粒酶活性，而極大多數(shù)正常細(xì)胞端粒酶均為陰性，這表明端粒酶可作為腫瘤細(xì)胞一種特征性標(biāo)記，到目前為止，人的端粒酶由三個(gè)部分組成，1.RNA組份(hTERC)，它作為端粒重復(fù)合成的內(nèi)源性模板；2.端粒酶結(jié)合蛋白(TEP1)；3.端粒酶催化亞基(telomerase catalytic subunit，簡寫hTERT)，也有人稱為端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(telomerase reverse transcriptasegene)。RNA組份和端粒酶催化亞基是端粒酶活性所必需的成份。最近研究表明端粒酶催化亞基(hTERT)在端粒酶活性中起決定作用，在極大多數(shù)腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞株中端粒酶催化亞基呈高水平表達(dá)，而正常細(xì)胞中不表達(dá)或低水平表達(dá)。因此端粒酶催化亞基啟動(dòng)子在極大多腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈激活狀態(tài)。
基因治療是近年興起的一種新的治療惡性腫瘤方法。其基因轉(zhuǎn)染方法分病毒法及非病毒法兩種。病毒法通常采用逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒及痘苗病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒在體外具有較高的轉(zhuǎn)染率，但病毒滴度偏低，在體內(nèi)轉(zhuǎn)染率較低，而且只能感染分裂期的細(xì)胞，同時(shí)具有整合至染色體，存在癌變的可能性的缺點(diǎn)。腺相關(guān)病毒具有轉(zhuǎn)染分裂及靜止細(xì)胞的能力，能持久的表達(dá)。非病毒法包括脂質(zhì)體及基因槍等方法，其轉(zhuǎn)染基因表達(dá)時(shí)間較短，轉(zhuǎn)染率較低。腺病毒是目前腫瘤基因治療中最常見病毒載體，已廣泛地應(yīng)用于人體基因治療方案中，具有容易生產(chǎn)及純化的特點(diǎn)，它在體內(nèi)及體外均能有效轉(zhuǎn)染分裂及靜止細(xì)胞，無致癌性。
目前腫瘤基因治療的主要障礙是不能有效地將目的基因特異性轉(zhuǎn)染所有的腫瘤細(xì)胞，而基因治療的療效與腫瘤細(xì)胞受基因轉(zhuǎn)染的數(shù)量密切相關(guān)，因此，研究與發(fā)展特異性轉(zhuǎn)染所有腫瘤細(xì)胞的病毒載體系統(tǒng)在腫瘤基因治療中至關(guān)重要。
解決這一個(gè)問題的一個(gè)關(guān)鍵性方法之一是應(yīng)用在腫瘤細(xì)胞選擇性復(fù)制的病毒。近三十年來，由于病毒學(xué)、分子生物學(xué)及腫瘤學(xué)的飛速發(fā)展，人們已完成了多個(gè)病毒全部基因組的測序工作，并對其基因的一結(jié)構(gòu)及其功能進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，能有效地對病毒基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。病毒具有感染、復(fù)制增殖和溶解細(xì)胞的能力，經(jīng)過修飾的病毒這種效應(yīng)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)得到有效加強(qiáng)，病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行選擇性復(fù)制，當(dāng)病毒感染腫瘤細(xì)胞后可數(shù)千倍甚至數(shù)百萬倍增加病毒的數(shù)量，從而裂解腫瘤細(xì)胞，釋放出新的病毒，再次感染腫瘤細(xì)胞，再次復(fù)制增殖，直至將全部腫瘤細(xì)胞殺滅，由于這種病毒不能在正常細(xì)胞內(nèi)增殖，故對正常細(xì)胞影響不太，這種病毒被稱為腫瘤細(xì)胞特異性增殖病毒但迄今為止，尚未見到應(yīng)用端粒酶啟動(dòng)子控制病毒早期基因的增殖病毒的報(bào)告發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一類能在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒及其構(gòu)建方法，即該病毒能選擇性地在具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制及增殖，而在無端粒酶活性的正常細(xì)胞內(nèi)基本不復(fù)制或基本不增殖，從而特異性抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞。
基因轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)節(jié)受反式作用因子(如轉(zhuǎn)錄因子)與順式作用元件相互作用的影響。當(dāng)缺乏或出現(xiàn)某些轉(zhuǎn)錄因子時(shí)會影響基因的轉(zhuǎn)錄水平。端粒酶催化亞基啟動(dòng)子及端粒酶RNA組份基因啟動(dòng)子在具有端粒酶活性的細(xì)胞內(nèi)特異性激活，從而使該啟動(dòng)子控制的基因產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明應(yīng)用端粒酶催化亞基啟動(dòng)子或端粒酶RNA組份基因啟動(dòng)子控制病毒增殖及復(fù)制的必需基因，從而使病毒增殖必需基因只能在上述具有端粒酶活性的的細(xì)胞中表達(dá)，導(dǎo)致病毒只能在上述病毒具有端粒酶活性的細(xì)胞內(nèi)增殖，而在上述無端粒酶活性的細(xì)胞內(nèi)基本不增殖。這種修飾后的病毒載體可被用于在某些細(xì)胞混合物中殺滅具有端粒酶活性的特殊靶細(xì)胞，通過給予修飾后的病毒能選擇性地在該種靶細(xì)胞中增殖，從而使這種靶細(xì)胞被增殖的病毒選擇性的殺滅；在體外培養(yǎng)或在動(dòng)物體內(nèi)通過將修飾后的病毒與細(xì)胞復(fù)合物混合，病毒只能在靶細(xì)胞增殖，也就是說除了靶細(xì)胞，其它細(xì)胞不能被這種病毒殺死。由于病毒在靶細(xì)胞內(nèi)增殖及擴(kuò)增，從而使混合細(xì)胞中的該靶細(xì)胞被殺滅，一旦靶細(xì)胞被破壞，病毒不再能夠再增殖。
本發(fā)明采用細(xì)胞專一的反應(yīng)元件是端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子，端粒酶RNA組份基因啟動(dòng)子。
本發(fā)明提出的能特異性殺滅具有端粒酶活性腫瘤細(xì)胞的增殖型重組病毒，它至少有一個(gè)病毒增殖所必需的基因的表達(dá)受端粒酶啟動(dòng)子。它由在病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域插入順式作用元件而構(gòu)成。該順式作用元件特異性在具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)激活，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性，而在無端粒酶活性正常細(xì)胞內(nèi)基本不激活，不能產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性。該順式作元件至少含有以下順序之一端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動(dòng)子，端粒酶RNA組份基因啟動(dòng)子。上述病毒增殖所必需的為病毒早期表達(dá)基因，如單純皰疹病毒早早期表達(dá)基因ICE4。
本發(fā)明中，上述病毒可以采用腺病毒。其病毒增殖必需基因至少含有以下一個(gè)腺病毒的早期表達(dá)基因E1A、E1B、E2、E4。
人類腺病毒有6個(gè)不同亞屬，分為A、B、C、D、E及F。它們對宿主細(xì)胞的親嗜性、致瘤性及疾病史并不相同。本發(fā)明以腺病毒C亞屬中的5型(Ad5)作為例證對本發(fā)明加以進(jìn)一步具體說明，但不限于該例證。腺病毒基因分為兩類，早期基因與晚期基因，早期基因包括E1A、E1B、E2、和E4。
E1A基因在病毒感染后即表達(dá)(0-2小時(shí))，是最早表達(dá)腺病毒蛋白，它作為反式激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是其它病毒早期基因蛋白表達(dá)所必需的，同時(shí)它反式激活其它病毒啟動(dòng)子。因此，缺乏E1A基因的表達(dá)，腺病毒DNA復(fù)制的必需基因產(chǎn)物不能產(chǎn)生，腺病毒不能有效復(fù)制及增殖。
E1B基因的轉(zhuǎn)錄受E1A蛋白的激活，其蛋白功能是晚期病毒基因mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞漿中所必需的，E1B基因表達(dá)缺失可導(dǎo)致病毒后期基因表達(dá)不佳及不能關(guān)閉宿主細(xì)胞蛋白的合成。
E4基因位于病毒基因組的右未端，其開放閱讀框3(ORF3)和ORF6能提高腺病毒主要晚期基因mRNA的水平。缺乏ORF3及ORF6蛋白功能，其病毒滴度比野生滴度低106倍。
腺病毒系統(tǒng)是由兩個(gè)載體組成，一個(gè)載體提供腺病毒的左臂部分，另一個(gè)載體提供右臂，這兩個(gè)載體至少有500nt的同源重組區(qū)，然而其轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生重組腺病毒，載體系統(tǒng)質(zhì)粒pXC1(Mckinnon，Gene 1982，1939-42)，含有野生型Ad5左臂。pBHG10提供缺乏E3區(qū)Ad5右臂或pBHGE3提供Ad5右臂(含E3區(qū))。
Ad5 E1A的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)分別位于病毒基因組約560nt及610nt，在這個(gè)區(qū)域插入某種順式作用元件，如端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動(dòng)子，端粒酶RNA組份基因啟動(dòng)子。首先，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)在這區(qū)域構(gòu)建限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，PCR引物將被限制于Ad5基因組或攜帶Ad5部分基因組的質(zhì)粒中，如有pBR322為背景的引物。應(yīng)用含有EcoR I位點(diǎn)pBR322序列及含有Xba I位點(diǎn)Ad5序列，通過二次疊加PCR方法，在該區(qū)域創(chuàng)建一個(gè)新的唯一個(gè)酶切位點(diǎn)，該確切位點(diǎn)將用于插入病毒順式作用元件。
相似的方案也被用于插入病毒順式作用元件，來調(diào)節(jié)E1b Ad5的E1B啟動(dòng)子，由一個(gè)對Sp1單一高親和為識別物和一個(gè)TATA box組成這區(qū)域位于1636到Sub-1701nt。通過插入病毒順式作用元件在這個(gè)區(qū)域，將提供給E1B在細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明提供的能在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒，其修飾病毒基因組中非增殖必需區(qū)域插入有目的基因。該目的基因?yàn)?1)抑癌基因，(2)血管抑制基因，(3)細(xì)胞因子基因，(4)前藥轉(zhuǎn)換酶基因，(5)細(xì)胞凋亡基因中任一種。
本發(fā)明提供的上述重組病毒攜帶的目的基因?yàn)?1)抑癌基因，抑癌基因能抑制腫瘤細(xì)胞生長，抑癌基因包含以下任一個(gè)基因P53，Rb，NF1，VHL，APC。
本發(fā)明提供的上述重組病毒攜帶的目的基因?yàn)?2)血管抑制基因，血管抑制基因抑制腫瘤新生血管形成，可阻斷腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞因營養(yǎng)不足而死亡，腫瘤明顯萎縮乃至完全消褪。同時(shí)抑制腫瘤新生血管的形成，也達(dá)到阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移的通路的目的。血管抑制基因是以下任一個(gè)基因膠原蛋白XVIIII的C-末端片段的內(nèi)皮抑素基因，血管生成抑素基因?yàn)檠獫{纖維蛋白溶酶原中Kringle1-4結(jié)構(gòu)，Kringle1-5結(jié)構(gòu)，Kringle1-3結(jié)構(gòu)及Kringle1-3加上Kringle5結(jié)構(gòu)，血小板反應(yīng)蛋白基因，血小板因子4基因，纖溶酶原激活因子抑制劑(PAI)基因，膠原蛋白XV的C-末端片段的內(nèi)皮抑素，干擾素誘生蛋白10，干擾素-γ誘生的單核因子，可溶性血管生長因子受體1，可溶性血管生長因子受體2，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子，抗凝血酶III，尿激酶N末端片段基因，纖維結(jié)合素基因。
血管抑制基因中含有編碼分泌型信號肽。該分泌型信號肽可以是下述中的任何一種血管生成抑制因子自身信號肽，M-成瘤蛋白信號肽，免疫球蛋白K鏈信號肽。
本發(fā)明提供的上述重組病毒攜帶的目的基因?yàn)榧?xì)胞因子基因，細(xì)胞因子基因具有激活免疫細(xì)胞，增加造血功能等，細(xì)胞因子基因包含以下任一個(gè)基因白細(xì)胞介素2，白細(xì)胞介素12，粒-單集落刺激因子，腫瘤壞死因子，干擾素-α，干擾素-β，干擾素-γ，Light或Flt3配體。
本發(fā)明提供的上述重組病毒攜帶的目的基因?yàn)榍八庌D(zhuǎn)換酶基因，前藥轉(zhuǎn)換酶基因可使無毒性藥物轉(zhuǎn)變成毒性藥物，從而增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷。前藥轉(zhuǎn)換酶基因包含以下任一個(gè)基因單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶，水痘-帶狀皰疹病毒胸腺嘧啶激酶或大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶。
本發(fā)明提供的上述重組病毒攜帶的目的基因?yàn)榧?xì)胞凋亡基因，細(xì)胞凋亡基因可導(dǎo)致真核細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡基因包含以下任一個(gè)基因ICE，capase-3，capase-8，capase-9。
隨著病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，目的基因拷貝數(shù)增加，使腫瘤細(xì)胞高效表達(dá)目的基因。
本發(fā)明提出的能在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒構(gòu)建方法如下，將兩個(gè)分別含有腺病毒左臂及右臂的載體共轉(zhuǎn)染給會產(chǎn)生重組腺病毒的細(xì)胞，這兩個(gè)腺病毒載體中至少有一個(gè)載體中腺病毒增殖非必需區(qū)插入目的基因，同時(shí)這兩個(gè)腺病毒載體中至少有一個(gè)載體中腺病毒早期表達(dá)基因E1A、E1B、E2及E4區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域插入某種順式作用元件，該順式作用元件至少含有以下順序之一端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子，端粒酶RNA組份基因啟動(dòng)子。在具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性，而無端粒酶活性的正常細(xì)胞內(nèi)不激活，不能產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性。
將具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞中特異性激活的端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子插入腺病毒早期基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域可以通過以下方法完成通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)在腺病毒早期基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域做一個(gè)酶切位點(diǎn)，通過酶切，將上述順式作用元件插入該位點(diǎn)，從而使腺病毒早期基因受控于端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子或端粒酶RNA組份基因啟動(dòng)子。
本發(fā)明還提出前述能在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒的增殖方法，即將重組病毒(如重組腺病毒)感染端粒酶陽性的哺乳類細(xì)胞，從而使重組病毒特異性地在端粒酶陽性的哺乳類細(xì)胞中增殖。
使用只能具有端粒酶活性的特殊靶細(xì)胞內(nèi)增殖的腺病毒，在靶細(xì)胞允許腺病毒增殖并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在體外培養(yǎng)或在動(dòng)物體內(nèi)通過將修飾后的腺病毒與細(xì)胞復(fù)合物混合，腺病毒只能在具有端粒酶活性的細(xì)胞內(nèi)增殖，也就是說除了具有端粒酶活性的細(xì)胞外，其他細(xì)胞不能被這種腺病毒殺死，由于腺病毒在具有端粒酶活性的細(xì)胞內(nèi)增殖及擴(kuò)增，從而使混合細(xì)胞中具有端粒酶活性的細(xì)胞被殺滅，一旦該具有端粒酶活性的細(xì)胞被破壞，腺病毒不再能夠再增殖。
本發(fā)明提出上述重組病毒實(shí)際應(yīng)用。例如將該重組病毒(如重組腺病毒)用于體外感染具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞毒性。將重組病毒(例如重組腺病毒)用于抑制具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞生長。將重組病毒(例如重組腺病毒)用于體內(nèi)選擇性殺滅具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明提出的在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒與化學(xué)治療藥物(如順鉑、5-氟脲嘧啶、絲裂霉素C、碳鉑、環(huán)磷酰胺等)一起可以組成復(fù)合物，其作為抗腫瘤藥物效果更好。
本發(fā)明具有如下有益效果
1.本發(fā)明提供一類治療具有端粒酶活性的腫瘤的增殖型重組病毒，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，這種重組病毒可用于治療具有端粒酶活性的腫瘤。
2.本發(fā)明提供一類治療具有端粒酶活性的腫瘤的增殖型重組病毒的構(gòu)建方法。該方法簡便易行可用于構(gòu)建多種治療具有端粒酶活性的增殖型重組病毒。
3.本發(fā)明提供一種在體內(nèi)及體外殺滅具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞、而不影響無端粒酶活性的正常細(xì)胞的方法。
具體實(shí)施例方式
例1攜帶端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子的克隆載體的構(gòu)建。
自新鮮的正常人肝組織中抽提基因組DNA，應(yīng)用巢式多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子(方法參見PCRProtools Current Methods and Applications，White BA主編，HumanaPress Inc.1993年出版-文獻(xiàn)1)，在啟動(dòng)子5’端入EcoR I、Not I及Bgl I三個(gè)酶切位點(diǎn)，在啟動(dòng)子3’端加入Swa I、BamH I兩個(gè)酶切位點(diǎn)。
引物1CGG GCT CCC AGT GGA TTC引物2AAC GTG GCC AGC GGC AGC ACC TC引物3GGA ATT CGC GGC CGC AGA TCT CAC AGA CGC CCA GGA ACC引物4CGG GAT CCA TTT AAA TTG GCC GGG GCC AGG GCT TC引物1與引物2進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，回收370bp片段，再用引物3與引物4對370片段進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，回收270bp片段，應(yīng)用EcoR I+BamH I對酶切，將該基因插入pUC19載體(購于美國ATCC公司)中進(jìn)行測序，其測序結(jié)果見下gaattcgcgg ccgcagatct cacagacgcc caggaccgcg cttcccacgtggcggaggga ctggggaccc gggcacccgt cctgcccctt caccttccagctccgcctcc tccgcgcgga ccccgccccg tcccgacccc tcccgggtccccggcccagc cccctccggg ccctcccagc ccctcccctt cctttccgcggccccgccct ctcctcgcgg cgcgagtttc aggcagcgct gcgtcctgctgcgcacgtgg gaagccctgg ccccggccaa tttaaatgga tcc結(jié)果表明端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子正確，將其命名為pUC-hTERTp。
例2可攜帶抗癌基因的端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子控制E1A表達(dá)的減毒增殖腺病毒載體的構(gòu)建。
pXC.1載體購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。在該載體中552bp處創(chuàng)立7個(gè)新的、唯一的酶切位點(diǎn)，分別為Age I、Bst BI、Not I、Spe I、Sal I、Xho I和Swa I，該位點(diǎn)位于E1A起始密碼前12bp，其方法采用定位突變雙次PCR技術(shù)(方法參見前述文獻(xiàn)1)。其引物分別為引物55’-引物(含有EcoR I酶切位點(diǎn))TTC AAG AAT TCT CAT GTTTG引物63’-引物(在5’端加入ATT TAA ATC TCG AGT CGA CAC TAGTGC GGC CGC TTC GAA CCG GT)ATT TAA ATC TCG AGT CGA CAC TAG TGCGGC CGC TTC GAA CCG GTG TCG GAG CGG CTC GGA
引物75’-引物(在5’端加入ACC GGT TCG AAG CGG CCG CAC TAGTGT CGA CTC GAG ATT TAA ATC CGG)ACC GGT TCG AAG CGG CCG CACTAG TGT CGA CTC GAG ATT TAA ATC CGG TGA CTG AAA ATG AGA CAT ATTA引物83’-引物(含有Xba I酶切位點(diǎn))TTC TCT AGA CAC AGG TGATG采用定位突變雙次PCR技術(shù)，PCR產(chǎn)物片段插入pGEM-T-easy載體中(方法參見Promega公司操作說明書)，命名為pGEM-T-Ela。將該片段進(jìn)行DNA測序，其測序結(jié)果顯示在pXC.1質(zhì)粒bp552位點(diǎn)中插入TTC GAA GCG GCC GCA CTA GTG TCG ACT CGA GAT TTA AAT CCGGT，從而產(chǎn)生7個(gè)新的Age I、Bst BI、Not I、Spe I、Sal I、XhoI和Swa I酶切位點(diǎn)，其它序列與pXC.1相同。應(yīng)用EcoR I與Xba I雙酶切pGEM-T-E1A及pXC.1質(zhì)粒，將pGEM-T-E1A中切出片段插入pXC.1質(zhì)粒中EcoR I及Xba I位點(diǎn)中，使pXC.1中552插入一個(gè)TTCGAA GCG GCC GCA CTA GTG TCG ACT CGA GAT TTA AAT CCG GT，從而產(chǎn)生7個(gè)Age I、Bst BI、Not I、Spe I、Sal I、Xho I和Swa I酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于E1A起始密碼前12bp，將該質(zhì)粒命名為pQW1。
pUC-hTERTp分別用Not I+Swa I酶切，其酶切片段分別插入pQW1質(zhì)粒中Not I+Swa I酶切位點(diǎn)中，分別應(yīng)用引物4及5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)出1310bp，這表明端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子已正向插入pQW1質(zhì)粒Not I+Swa I位點(diǎn)，即腺病毒5型E1A起始密碼子上游區(qū)12bp處，命名為pQW-hTERTp。
例3.攜帶人內(nèi)皮抑素(endostatin)基因的E1區(qū)缺失的腺載體的構(gòu)建pCA13載體購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pCA13含有5型腺病毒序列bp22-5790并缺失E1區(qū)342至3523bp片段，在E1缺失區(qū)插入了人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)及SV40 poly A加尾信號。應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)人內(nèi)皮抑素(endostatin)基因，自新鮮的正常人肝組織中抽提總RNA，以隨機(jī)引物作逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在擴(kuò)增人內(nèi)皮抑素(endostatin)基因，并用兩次多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)(方法參見文獻(xiàn)1)在基因前加入M-成瘤蛋白(Oncostatin-M)信號肽及信號肽前、基因結(jié)尾引入EcoR I和XbaI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。
引物9GGG GAA TTC ACC ATG GGG GTA CTG CTC ACA CAG AGG ACGCTG CTC AGT CTG GTC CTT GCA CTC引物10CTG CTC AGT CTG GTC CTT GCA CTC CTG TTT CCA AGCATG GCG AGC CAC CGC GAC TTC CAG引物11GCT CTA GAC TAT TAC TTG GAG GCA GTC ATG AAG CTGTTC TCA ATG CAT AGC ACG ATG TAG GCG TG引物10與引物11進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，回收615bp片段，再用引物9與引物11對615bp片段進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，回收647bp片段，應(yīng)用EcoR I+Xba I對酶切，將該基因插入pbluescript IIKS(+)載體(購于美國ATCC公司)中進(jìn)行測序，其測序結(jié)果見下GAATTCACCATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTAACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTATGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAGTAATAGTCTAG將其EcoR I+Xba I切下，定向插入pCA13載體EcoR I+Xba I中，命名pCA13-human endostatin。
例4、攜帶血管生成抑素(angiostatin)基因的E1區(qū)缺失的腺載體的構(gòu)建應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)血管生成抑素(angiostatin)基因，自新鮮的正常人肝組織中抽提總RNA，以隨機(jī)引物作逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后進(jìn)行第一輪PCR，并用兩次多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)(方法參見文獻(xiàn)1)在基因結(jié)尾引入EcoR I和Xho I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，引物125’-AGCGAATTCCAAAATGGAACATAAGG-3’EcoR I血漿纖維蛋白溶酶原49-67引物135’-ACACTTTTCCTTGACCTGATTTCAG-3’血漿纖維蛋白溶酶原348-343+111-94
引物145’-CTGAAATCAGGTCAAGGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTGC-3’血漿纖維蛋白溶酶原94-111+343-363引物155’-AGCCTCGAGCTATTACGCTTCTGTTCCTGAG-3’Xho I(2 Stop)血漿纖維蛋白溶酶原1431-1416引物12與引物13、引物14與引物15分別進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)，將其反應(yīng)產(chǎn)物混合，用引物12與引物15進(jìn)行再次PCR反應(yīng)，回收1168bp片段。應(yīng)用EcoR I+Xho I對酶切，將該基因插入pbluescript IIKS(+)載體(購于美國ATCC公司)中進(jìn)行測序，其測序結(jié)果見下GAATTCCAAAATGGAACATAAGGAAGTGGTTCTTCTACTTCTTTTATTTCTGAAATCAGGTCAAGGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGTAATAGCTCGAG將其EcoR I+Xho I切下，定向插入pCA13載體EcoR I+Xho I中，命名pCA13-human angiostatin。
例5攜帶內(nèi)皮抑素或血管生成抑素的端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子控制E1A表達(dá)的腺病毒載體的構(gòu)建應(yīng)用Bgl II分別酶切pCA13-human endostatin和pCA13-humanangiostatin，分別回收1237bp(含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40poly A加尾信號)及1758bp(人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、人血管生成抑制及SV40 poly A加尾信號)，將其插入pUC-hTERTp中Bgl II酶切位點(diǎn)，應(yīng)用PCR技術(shù)分別驗(yàn)證其插入的反方向其端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子3’-端引物引物16TGG CCG GGG CCA GGG CTT C引物17人內(nèi)皮抑素3’-引物(位于M-成瘤蛋白信號肽及人內(nèi)皮抑素基因中577-600bp)AGC ACG ATG TAG GCG TGA TGG C引物18人血管生成抑素3’-引物(位于人血管生成抑素823-842bp)AGG AGT CAC AGG ACG GTA TC其引物16與引物17能擴(kuò)增到1280bp，表明含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40 poly A加尾信號反向插入pUC-hTERTp Bgl II酶切位點(diǎn)。命名為pUC-hTERTp-endostatin。
其引物16與引物18能擴(kuò)增到1520bp，表明含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、人血管生成抑素基因及SV40 poly A加尾信號反向插入pUC-hTERTp Bgl II酶切位點(diǎn)，命名為pUC-hTERTp-angiostatin。
應(yīng)用Not I和Swa I雙酶切pUC-hTERTp-endostatin及pUC-hTERTp-angiostatin，回收片段，分別插入pQW-hTERTp中Not I和Swa I酶切位點(diǎn)，分別命名為pQW-hTERTp-endostatin及pQW-hTERTp-angiostatin。
例6攜帶內(nèi)皮抑素或血管生成抑素的端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子控制E1A表達(dá)的腺病毒的重組。
293細(xì)胞株購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA轉(zhuǎn)化人胚胎腎細(xì)胞而成，它含有及表達(dá)5型腺病毒E1區(qū)，腺病毒DNA對其具有高轉(zhuǎn)染率。將含有5型腺病毒左臂的質(zhì)粒聯(lián)合含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過同源重組可產(chǎn)生具有感染力的腺病毒。我們將pQW-hTERTp-endostatin與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pBHGE3通過Lipofectamine共轉(zhuǎn)染至293細(xì)株，pQW-hTERTp-angiostatin與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pBGH10通過Lipofectamine共轉(zhuǎn)染至293細(xì)株，其具體方法參見GIBCO BRL公司的操作說明。pBGHE3及pBHG10購于加拿大Microbix Biosystems Inc.(Ontario)，pBGHE3含有5型腺病毒右臂，含有E3區(qū)；pBGH10含有5型腺病毒右臂，但缺失E3區(qū)。共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過三次病毒空斑純化，即得E1A受端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子控制的腺病毒，并攜帶人內(nèi)皮抑素或血管生成抑素，分別命名為Adv-hTERTp Ela-endostatin及Adv-hTERTp Ela-angiostatin，分別記為QW1-endostatin及QW1-angiostatin。
由上述方法構(gòu)建的重組病毒的列表如下病毒 名稱 含Ad5左臂質(zhì)粒 含Ad5右臂質(zhì)粒Adv-hTERTp E1a-QW1- pQW-hTERTp-PBHGE3endostatin endostatin endostatinAdv-hTERTp E1a-QW1- pQW-hTERTp-PBHG10angiostatinangiostatinangiostatin腺病毒在293細(xì)胞中大量繁殖，應(yīng)用氯化銫梯度離心的方法大量純化腺病毒(具體方法參見前述文獻(xiàn)2出版)。Adv-hTERTp Ela-endostatin(QW1-endostatin)為5型腺病毒，在E1A轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間插入端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子，并在端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子上游區(qū)新建一個(gè)Bgl II酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)中反向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40 poly A加尾信號基因序列，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。
Adv-hTERTp E1a-angioststin(QW1-angiostatin)為5型腺病毒，在E1A轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間插入端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子，并在端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子上游區(qū)新建一個(gè)Bgl II酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)中反向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有人血管生成抑素基因及SV40 poly A加尾信號基因序列，同時(shí)伴有28133-30818bp(E3區(qū)部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。
例7攜帶內(nèi)皮抑素或血管生成抑素的端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子控制E1A表達(dá)的腺病毒的的體外在具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞增殖、復(fù)制及高效表達(dá)人內(nèi)皮抑素或人血管生成抑素因子并特異性殺滅腫瘤細(xì)胞。
將QW1-endostatin及QW1-angiostatin分別感染具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞株Hep 3B、293及正常人成纖維細(xì)胞，細(xì)胞按2×105/孔接種6孔板，分別感染重組腺病毒QW1-endostatin、QW1-angiostatin及野生型5型腺病毒4×105pfu，48小時(shí)后應(yīng)用293細(xì)胞株測定其病毒滴度，具體方法參見前述文獻(xiàn)2，結(jié)果為293 Hep 3B正常成纖維細(xì)胞野生型5型腺病毒1×1056×1044×104QW1-endostat in1×1055×1052×10QW1-angiststin 1×1053×1055×10將感染EB病毒感染的腫瘤細(xì)胞株Hep 3B及正常人成纖維細(xì)胞分別感染重組腺病毒QW1-endostatin及QW1-angiostatin，MOI為1，37℃孵育1小時(shí)，感染后7天收集細(xì)胞，應(yīng)用QIAamp DNA Bloodmini kit(德國QIAGEN公司)提取病毒DNA，方法參見QIAGEN公司操作說明。將上述QW1-endostatin提取的DNA分別應(yīng)用Bgl II酶切，用1％的瓊脂糖電泳，將其轉(zhuǎn)至尼龍膜，用32P分別標(biāo)記人內(nèi)皮抑素cDNA片段(EcoR I與Xba I雙酶切pCA13-human endostatin，回收637bp)作為探針，進(jìn)行souther blot雜交，以pCA13-humanendostatin作為病毒拷貝數(shù)對照(方法參見文獻(xiàn)2)，QW1-endostatin在腫瘤細(xì)胞株Hep 3B及正常人成纖維細(xì)胞的每個(gè)細(xì)胞病毒拷貝數(shù)分別為2×104及＜10。
將上述QW1-angiostatin提取的DNA分別應(yīng)用Bgl II酶切，用1％的瓊脂糖電泳，將其轉(zhuǎn)至尼龍膜，用32P分別標(biāo)記人血管生成抑素cDNA片段(EcoR I與Xba I雙酶切pCA13-human angiostatin，回收1168bp)作為探針，進(jìn)行souther blot雜交，以pCA13-humanangiostatin作為病毒拷貝數(shù)對照(方法參見文獻(xiàn)2)，QW1-angiostatin在腫瘤細(xì)胞株Hep 3B及正常人成纖維細(xì)胞的每個(gè)細(xì)胞病毒拷貝數(shù)分別為3×104及＜10。
例8攜帶內(nèi)皮抑素或血管生成抑素的端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子控制E1A表達(dá)的腺病毒在裸鼠體內(nèi)治療移植腫瘤將4-5周齡的裸鼠皮下接種細(xì)胞株Jijoye細(xì)胞5×107，兩周后給予每次2×108pfu，共5次，增殖型重組腺病毒QW1-endostatin或QW1-angiostatin治療或用相同劑量的對照腺病毒Ad5-Lac Z，其未治療組及對照腺病毒治療組4周后腫瘤體增加3倍以上，而治療組則腫瘤明顯縮小。
權(quán)利要求
1.一種在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒，其特征在于由病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域插入有某種順式作用元件，該順式作用元件至少含有以下順序之一端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子，端粒酶RNA組份基因啟動(dòng)子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒，其特征在于所述該增殖型重組病毒為腺病毒，該腺病毒增殖必需基因至少含有以下一個(gè)腺病毒的早期表達(dá)基因E1A，E1B，E2，E4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒，其特征在于其修飾病毒基因組中非增殖必需區(qū)域插入有目的基因，該目的基因可以是下述任一種抑癌基因，血管抑制基因，細(xì)胞因子基因，前藥轉(zhuǎn)換酶基因，細(xì)胞凋亡基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒，其特征在于所述的抑癌基因可以是下述任一種P53，P21，Rb，NF1，VHL，APC。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒，其特征在于所述的血管抑制基因可以是下述任一種膠原蛋白X VIII的C-末端片段的內(nèi)皮抑素基因，血管生成抑素基因?yàn)檠獫{纖維蛋白溶酶原中Kringle1-4結(jié)構(gòu)，Kringle1-5結(jié)構(gòu)，Kringle1-3結(jié)構(gòu)及Kringle1-3加上Kringle5結(jié)構(gòu)，血小板反應(yīng)蛋白基因，血小板因子4基因，纖溶酶原激活因子抑制劑(PAI)基因，膠原蛋白XV的C-末端片段的內(nèi)皮抑素，干擾素誘生蛋白10，干擾素-γ誘生的單核因子，可溶性血管生長因子受體1，可溶性血管生長因子受體2，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子，抗凝血酶III，尿激酶N末端片段基因，纖維結(jié)合素基因。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒，其特征在于所述的血管抑制基因血管抑制基因中含有編碼分泌型信號肽。該分泌型信號肽可以是下述中的任何一種血管生成抑制因子自身信號肽，M-成瘤蛋白信號肽，免疫球蛋白K鏈信號肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒，其特征在于所述的細(xì)胞因子基因可以是下述任一種白細(xì)胞介素2，白細(xì)胞介素12，粒-單集落刺激因子，腫瘤壞死因子，干擾素-α，干擾素-β，干擾素-γ，Light，F(xiàn)lt3配體。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒，其特征在于所述的前藥轉(zhuǎn)換酶基因可以是下述任一種單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶，水痘-帶狀皰疹病毒胸腺嘧啶激酶，大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組病毒，其特征在于所述的細(xì)胞凋亡基因可以是下述任一種ICE，capase-3，capase-8，capase-9。
10.一種在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于將兩個(gè)分別含有腺病毒左臂及右臂的載體共轉(zhuǎn)染給會產(chǎn)生重組腺病毒的細(xì)胞，這兩個(gè)腺病毒載體中至少有一個(gè)載體中腺病毒非增殖必需區(qū)插入目的基因，同時(shí)這兩個(gè)腺病毒載體中至少有一個(gè)載體中腺病毒早期基因E1A、E1B、E2、E4區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間表達(dá)區(qū)域插入順式作用元件，該順式作用元件至少含有以下順序之一端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子，端粒酶RNA組份基因啟動(dòng)子。
11.根據(jù)權(quán)利要求1 0所述的一種在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒的構(gòu)建方法，其特征在于通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在腺病毒早期基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域做一個(gè)酶切位點(diǎn)，通過酶切，將將上述順式作用元件插入該位點(diǎn)，使腺病毒早期基因受控于端粒酶催化亞基基因啟動(dòng)子或端粒酶RNA組份基因啟動(dòng)子。
12.一種在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒的增殖方法，其特征在于將重組病毒體外感染具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞，從而在具有端粒酶活性的細(xì)胞內(nèi)增殖。
13.一種如權(quán)利要求1所述的在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒載體的應(yīng)用，其特征在于將該重組病毒用于體外感染具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞毒性。
14.一種如權(quán)利要求1所述的在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒載體的應(yīng)用，其特征在于將該重組病毒用于抑制具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞的生長。
15.一種如權(quán)利要求1所述的在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒載體的應(yīng)用，其特征在于將該重組病毒用于體內(nèi)選擇性地殺滅具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞。
16.一種抗腫瘤藥物，其特征在于該藥物由如權(quán)利要1所述的能特異性殺滅腫瘤的增殖型重組病毒與化療藥物組成的復(fù)合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所說的化學(xué)治療藥物可以是下述任一種順鉑，5-氟脲嘧啶，絲裂霉素C，碳鉑，環(huán)磷酰胺。
全文摘要
本發(fā)明提供一類在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖及高效表達(dá)抗癌基因的重組病毒及其構(gòu)建方法。通過在病毒早期基因上游區(qū)插入端粒酶啟動(dòng)子,使該重組病毒選擇性地在具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖,而在無端粒酶活性的正常細(xì)胞內(nèi)基本不增殖,同時(shí)將抗癌基因插入腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖的病毒基因組中非增殖必需區(qū)域,使抗癌基因在腫瘤細(xì)胞高效表達(dá),從而特異性殺滅具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞。這種重組病毒可用于治療多種腫瘤。
文檔編號A61K39/12GK1339584SQ0112611
公開日2002年3月13日 申請日期2001年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月12日
發(fā)明者錢其軍, 吳孟超 申請人:錢其軍