專利名稱：HBV特異性干涉靶位點(diǎn)基因及其siRNA和其在抗HBV感染中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的基因治療，具體涉及基因工程方法構(gòu)建乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)特異性干涉靶位點(diǎn)基因、上述基因生成的siRNA(small interfering RNA，小干涉RNA)以及所述的基因和siRNA在制備用于抗HBV感染的治療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
HBV屬嗜肝DNA病毒，為含有部分雙鏈的環(huán)狀DNA病毒。病毒DNA的長鏈為負(fù)鏈，短鏈為正鏈。HBV基因組致密精巧，大小約3.2kb。HBV的持續(xù)感染是當(dāng)前嚴(yán)重的全球健康問題之一，也是導(dǎo)致慢性肝病最常見的原因。目前全球約有3.5億慢性HBV感染者，每年死于HBV感染有關(guān)的慢性肝病近100萬人。我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，由HBV持續(xù)感染所引起的病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等嚴(yán)重危害我國人民的生命健康近10％的人口為HBV攜帶者，現(xiàn)癥乙型肝炎患者3000多萬人，每年有約30萬人死于乙型肝炎及其相關(guān)并發(fā)癥。因此，尋求乙型肝炎的有效治療方法，已成當(dāng)前醫(yī)學(xué)界亟待解決的重大課題。目前已獲批準(zhǔn)的控制HBV持續(xù)感染的藥物主要有干擾素-α和核苷類似物如拉米呋啶和阿德福韋，但迄今的抗病毒治療手段療效不夠滿意高劑量重組干擾素的持續(xù)應(yīng)答率僅約30％左右，核苷類似物如拉米呋啶雖然抗病毒活性較強(qiáng)，但停藥后病毒復(fù)制水平快速反跳及耐藥病毒株的出現(xiàn)，使得臨床抗病毒方案的實(shí)施面臨極大的挑戰(zhàn)。尋找高效、特異、低毒的抗HBV治療新方案一直是人們不懈追求的目標(biāo)。
RNA干涉(RNA interference，RNAi)是雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的、序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，廣泛存在于多種生物體中。RNAi的本質(zhì)是一種由RNA介導(dǎo)的序列特異的獲得性免疫反應(yīng)，是一種原始的基因組對抗外來基因表達(dá)的保護(hù)機(jī)制，是生物體在基因組水平上的免疫系統(tǒng)。RNAi的核心功能是抗病毒感染免疫，維持基因組中轉(zhuǎn)座子的穩(wěn)定性，清除異常RNA，同時參與基因表達(dá)的調(diào)控。當(dāng)前，RNAi已發(fā)展成為一種新型的基因阻斷技術(shù)，用于高效特異地關(guān)閉或降低特定基因的表達(dá)，廣泛用于新基因篩選、基因功能鑒定以及基因治療等方面，在腫瘤、病毒感染等的治療方面已取得積極進(jìn)展，顯示了非常廣闊的應(yīng)用前景。
現(xiàn)已證實(shí)，dsRNA誘發(fā)的RNAi作用機(jī)理是細(xì)胞中的dsRNA在Dicer-1酶的作用下降解產(chǎn)生siRNA，后者在其它活化酶的參與下識別與siRNA同源的mRNA并將其降解。在哺乳動物細(xì)胞中，21nt的siRNA的引入則成功地抑制了細(xì)胞中的靶基因的表達(dá)，同時避免了dsRNA激活干擾素系統(tǒng)而產(chǎn)生的非特異性作用。
與經(jīng)典的抗HBV藥物干擾素和核苷類似物相比，RNAi技術(shù)在抗HBV治療方面具有諸多優(yōu)勢①特異性針對病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從而阻斷病毒復(fù)制，不會激活非特異性細(xì)胞反應(yīng)，不良反應(yīng)最小；②RNAi具有高效性，少量的siRNA就可達(dá)到抑制HBV mRNA，降低病毒表達(dá)產(chǎn)物的作用；③HBV基因組內(nèi)存在許多潛在的RNAi靶位點(diǎn)，可提供數(shù)百個RNAi的作用靶位點(diǎn)，選擇保守區(qū)域位點(diǎn)可有效防止病毒變異株的出現(xiàn)；④RNAi的作用不依賴于病毒的復(fù)制，siRNA可以在病毒非活躍復(fù)制的情況下發(fā)揮其抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄及降低蛋白表達(dá)水平的作用，而拉米呋啶只對有復(fù)制活性的HBV有抑制作用，因此可以作為抗病毒藥物拉米呋啶的輔助治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一種特異性強(qiáng)、活性高能持續(xù)抗HBV感染的新型分子，提供一種HBV特異性干涉靶位點(diǎn)基因、上述基因轉(zhuǎn)錄生成的siRNA及所述的基因和siRNA在制備用于抗HBV感染的治療藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是HBV特異性干涉靶位點(diǎn)基因，其具有序列表<400>1-5之一的序列。
由上述基因轉(zhuǎn)錄生成的siRNA，其具有序列表<400>6-15之一的序列。
上述基因在制備用于抗HBV感染的治療藥物中的應(yīng)用。
上述siRNA在制備用于抗HBV感染的治療藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明基于siRNA能夠高效、特異地關(guān)閉或降低特定基因的表達(dá)的原理，采用pSUPER載體(grummelkamp TR，et al.Science 2002；296550-553)產(chǎn)生的siRNA實(shí)現(xiàn)對HBV的高效、特異、持續(xù)抑制作用。本發(fā)明篩選所得到的HBV靶向基因，經(jīng)載體表達(dá)后產(chǎn)生能特異性地識別和降解HBV的siRNA效應(yīng)分子，無論是使用表達(dá)siRNA重組載體直接進(jìn)行靜脈注射，或?qū)⑷斯ず铣傻膕iRNA注射入乙型肝炎患者體內(nèi)，均能產(chǎn)生高效、特異的抗HBV作用。
本發(fā)明篩選所得到的HBV靶向基因具有以下特點(diǎn)①高度的特異性——RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制，HBV靶向的siRNA能夠非常特異地降解HBV轉(zhuǎn)錄的mRNA，而無關(guān)基因不受影響，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)針對EGFP(綠色熒光蛋白)的siRNA并未對HBV基因的表達(dá)產(chǎn)生明顯影響；②高效性——相對很少量的siRNA分子就能產(chǎn)生強(qiáng)烈的RNAi效應(yīng)，抑制HBV mRNA的表達(dá)，降低病毒表達(dá)產(chǎn)物的作用，其水平可以達(dá)到缺失突變體表型的程度；③持續(xù)性——HBV特異性siRNA可經(jīng)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后長期表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對體內(nèi)HBV的長期抑制作用；④安全性——由于使用的是21nt的siRNA，不會激活干擾素系統(tǒng)而產(chǎn)生非特異性作用，不良反應(yīng)最小。
本發(fā)明可望為HBV感染的治療提供一種新手段。


圖1為pSUPER載體轉(zhuǎn)錄生成siRNA的示意圖。
圖2為HBV基因及其轉(zhuǎn)錄本的RNA干涉位點(diǎn)信息圖。
圖3為siRNA表達(dá)載體的雙酶切鑒定結(jié)果圖。
圖4為穩(wěn)定表達(dá)siRNA的細(xì)胞株的細(xì)胞周期分析結(jié)果圖。
圖5為穩(wěn)定表達(dá)siRNA的細(xì)胞的生長曲線。
圖6為siRNA對HBV基因mRNA的降解圖。
圖7為siRNA對HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的降解圖。
圖8為siRNA對細(xì)胞分泌HBsAg(A)和HBeAg(B)的抑制作用圖。
圖9為siRNA抑制HBV抗原的表達(dá)的免疫熒光檢測結(jié)果圖(200×)。
圖10為細(xì)胞裂解液的Western blot分析圖。
圖11為siRNA對培養(yǎng)上清(A)和細(xì)胞內(nèi)(B)HBV DNA的抑制作用圖。
圖12為siRNA持久抑制HBsAg(A)和HBeAg(B)的表達(dá)圖。
圖13為siRNA對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBsAg的抑制作用圖。
圖14為HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(A)和C57BL小鼠(B)肝臟HE染色圖。
圖15為siRNA抑制轉(zhuǎn)基因小鼠體肝臟中HBsAg的表達(dá)16為siRNA抑制轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV DNA的復(fù)制圖具體實(shí)施方式
1.HBV特異性siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建(1)由DNA轉(zhuǎn)錄生成siRNA的策略設(shè)計(jì)的寡核苷酸鏈每條均為64nt，5′端和3′端分別含BglII和HindIII酶切位點(diǎn)，便于與pSUPER載體連接。5′端19nt的編碼序列與靶基因同源、另一段19nt的序列與其反向互補(bǔ)，其間由9nt的TTCAAGAGA間隔序列形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，末端加有轉(zhuǎn)錄終止信號TTTTT。具有上述結(jié)構(gòu)特征的寡核苷酸鏈經(jīng)退火、磷酸化后形成雙鏈DNA，然后定向插入pSUPER載體(附圖1)。具有上述結(jié)構(gòu)的pSUPER載體能轉(zhuǎn)錄生成發(fā)夾狀的RNA(shRNA)，后者經(jīng)Dicer酶切后成為siRNA而發(fā)揮抑制基因表達(dá)的功能。
(2)針對HBV基因干涉位點(diǎn)的選擇與寡核苷酸的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中報道的HBV核苷酸序列(U95551)，在siRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站http//wwwl.qiagen.com/Products/GeneSilencing/CustomSiRna/SiRnaDesigner.asDx，選擇基因編碼區(qū)中以AA開頭長度為21個堿基，G+C含量在50％左右的序列作為候選siRNA靶位點(diǎn)。設(shè)計(jì)出的siRNA序列進(jìn)行BLAST(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)同源分析證實(shí)為HBV特異序列。選取HBV編碼區(qū)1683-1701、1580-1598、671-689、413-431、2027-2045核苷酸序列，按照pSUPER載體的要求設(shè)計(jì)2條64nt能編碼siRNA的寡核苷酸鏈，寡核苷酸序列兩端包含BglII和HindIII酶切位點(diǎn)，能直接與經(jīng)相同酶切的pSUPER載體連接。此外還設(shè)計(jì)了與HBV序列無關(guān)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的siRNA表達(dá)載體pSUPER-EGFP作為對照。針對HBV基因及其轉(zhuǎn)錄本的RNA干涉位點(diǎn)信息如附圖2所示。
(3)雙鏈寡核苷酸克隆入pSUPER載體①寡核苷酸的退火和磷酸化合成的單鏈寡核苷酸溶解于H2O中，調(diào)整其濃度為3μg/μl。各取1μl相應(yīng)的寡核苷酸合成片段，加入48μl退火緩沖液，95℃保溫5min，70℃孵育10分鐘，緩慢冷卻至4℃得到退火雙鏈DNA；取2μl退火的寡核苷酸，加1μl T4 PNK緩沖液、1μl 1mM ATP、1μl T4 PNK、5μl H2O，在37℃水浴進(jìn)行30min磷酸化，70℃孵育10分鐘滅活PNK。
②雙鏈寡核苷酸與載體的連接退火并磷酸化的寡核苷酸與經(jīng)BglII和HindIII雙酶切的pSUPER載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆、搖菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，EcoR I和Hind III雙酶切進(jìn)行鑒定，陽性質(zhì)粒切出約300bp的條帶，而空質(zhì)粒的大小為240bp(附圖3)。序列測定證實(shí)重組質(zhì)粒序列與所設(shè)計(jì)序列完全一致，分別命名為pSUPER-HBV1、pSUPER-HBV2、pSUPER-HBV3、pSUPER-HBV4、pSUPER-HBV5以及pSUPER-EGFP。
2.siRNA抑制細(xì)胞內(nèi)HBV的基因表達(dá)和復(fù)制將序列正確的siRNA表達(dá)載體與pTK-Hyg質(zhì)粒按摩爾比10∶1共轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)HBV的HepG2 2.2.15細(xì)胞，經(jīng)200μg/ml潮霉素抗性篩選獲得穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株，觀察導(dǎo)入的siRNA對細(xì)胞周期和細(xì)胞生長速度的影響；在mRNA水平上用RT-PCR和Northern blot檢測HBV mRNA的抑制情況；在蛋白質(zhì)水平上用微粒子酶免疫測定法(MEIA)定量檢測培養(yǎng)上清中的HBsAg和HBeAg含量，免疫熒光染色和Western blot檢測細(xì)胞中相應(yīng)抗原的表達(dá)；熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測細(xì)胞內(nèi)外HBV DNA的復(fù)制情況；并動態(tài)觀察siRNA對HBV的長期抑制作用。
(1)siRNA對細(xì)胞周期無明顯影響篩選出的單克隆細(xì)胞消化、洗滌制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)固定、染色，檢測細(xì)胞周期并計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。流式細(xì)胞分析結(jié)果結(jié)果顯示(附圖4，表1)穩(wěn)定表達(dá)siRNA單克隆細(xì)胞株，細(xì)胞周期和增殖指數(shù)與對照HBV-pSUPER相比并無顯著差異，表明導(dǎo)入HBV特異性siRNA表達(dá)載體對HepG2 2.2.15細(xì)胞的生長無明顯影響。
表1 穩(wěn)定表達(dá)siRNA的細(xì)胞株的細(xì)胞周期及增殖指數(shù)(PI)

(2)siRNA對細(xì)胞生長曲線無明顯影響按照3×103/100μl/孔接種篩選出的單克隆細(xì)胞于7塊96孔板，培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7天時，各取1塊96孔板，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入20μl 5mg/ml的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸掉培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，震蕩10min溶解結(jié)晶，酶聯(lián)免疫檢測儀測定490nm吸光值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制各細(xì)胞生長曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定表達(dá)siRNA的細(xì)胞生長速度與對照細(xì)胞的生長速度相似，各組間無明顯差別(附圖5)(3)siRNA對HepG2 2.2.15細(xì)胞中HBV mRNA的降解根據(jù)HBV的基因序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增HBV 356-714位置的RT-PCR引物P1和P2，用于擴(kuò)增3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphatedehydrogenase，GAPDH)基因的引物G1和G2。提取篩選出的單克隆細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，用相應(yīng)的引物按如下參數(shù)進(jìn)行HBV mRNA的PCR擴(kuò)增94℃預(yù)變性4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃45sec，共25個循環(huán)；72℃延伸5min。結(jié)果顯示干涉組細(xì)胞的RT-PCR產(chǎn)物在358bp位置處的條帶明顯暗于對照條帶，轉(zhuǎn)染pSUPER-EGFP、pSUPER細(xì)胞的HBV mRNA表達(dá)產(chǎn)物與HepG2 2.2.15細(xì)胞相比無明顯變化，提示HBV mRNA的表達(dá)被明顯抑制；而內(nèi)參照GAPDH mRNA在各細(xì)胞均能經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)生250bp片段，各組之間的表達(dá)無明顯差異(附圖6)，表明siRNA對HepG2 2.2.15細(xì)胞中HBV mRNA的降解作用是高效、特異的。
P1 5’-CAA CTT GTC CTG GTT ATC GC-3’
P2 5’-AAG CCC TAC GAA CCA CTG AA-3’G1 5’-CAA CGG ATT TGG TCG TAT TGG G-3’G2 5’-CCT GGA AGA TGG TGA TGG GAT T-3’(4)siRNA對HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的降解作用提取篩選出的單克隆細(xì)胞總RNA，經(jīng)變性凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，與α-32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pSUPER、pSUPER-EGFP細(xì)胞HBV 3.5kb、2.4kb、2.1kb的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物條帶清晰，而干涉組細(xì)胞相應(yīng)的條帶明顯減弱，抑制效果明顯的細(xì)胞內(nèi)的HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物條帶基本看不到(附圖7)，表明siRNA對HepG22.2.15細(xì)胞中HBV RNA的降解作用是高效、特異的。
(5)siRNA對細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用篩選出的細(xì)胞3×105在雙抗性條件下48h、72h的培養(yǎng)上清用微粒子酶免疫分析法(MEIA)檢測HBsAg和HBeAg含量。結(jié)果表明培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg均受到明顯抑制，以pSUPER-HBV2抑制作用最強(qiáng)，它對培養(yǎng)48h的細(xì)胞上清中的HBsAg和HBeAg抑制率分別為97％和87％，培養(yǎng)72h對相應(yīng)抗原的抑制率為98％和88％；pSUPER-HBV5作用次之，它對培養(yǎng)48h的細(xì)胞上清中的HBsAg和HBeAg抑制率分別為87.4％和77％，培養(yǎng)72h對相應(yīng)抗原的抑制率為90％和80.8％；其它載體對HBsAg和HBeAg的分泌也有很好的抑制作用，對HBsAg抑制效率為60.2％(pSUPER-HBV3，72h)到91.7％(pSUPER-HBV1，72h)，對HBeAg抑制效率由53.8％到64.4％不等。上述結(jié)果與相應(yīng)的pSUPER對照組比較差異非常顯著(P＜0.05)，相比之下pSUPER-EGFP與對照組無明顯差異(附圖8)。提示siRNA的抑制作用是高效、特異的。
(6)siRNA抑制細(xì)胞內(nèi)HBsAg和HBcAg的表達(dá)將篩選出的單克隆細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示細(xì)胞中紅色熒光標(biāo)記的病毒抗原明顯減少，pSUPER-HBV2和pSUPER-HBV5轉(zhuǎn)染組細(xì)胞已基本檢測不到HBsAg和HBcAg的表達(dá)，而pSUPER-EGFP與對照組中抗原的表達(dá)無明顯降低(附圖9)，表明siRNA能高效、特異地抑制細(xì)胞內(nèi)HBV抗原的合成。
(7)細(xì)胞內(nèi)HBsAg的Western blot檢測對細(xì)胞裂解液所進(jìn)行的Western blot檢測結(jié)果顯示，表達(dá)HBV特異性siRNA的細(xì)胞中HBsAg的表達(dá)明顯下調(diào)，而pSUPER-EGFP與對照組中抗原的表達(dá)無明顯降低(附圖10)，表明siRNA確實(shí)能夠高效、特異地抑制細(xì)胞內(nèi)HBV抗原的合成。
(8)siRNA對HBV DNA的抑制作用取3×105細(xì)胞培養(yǎng)72h上清和濃度為1.0ng/μl細(xì)胞基因組DNA各5μl分別加入已配制好的PCR反應(yīng)管中，同時設(shè)立陰性對照和陽性定量梯度對照，混勻后置于PE7700自動熒光檢測儀，按下列條件擴(kuò)增93℃預(yù)變性2min，93℃45s，55℃60s，先做10個循環(huán)，再按93℃30s，55℃45s做30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，由電腦自動分析計(jì)算出HBV的拷貝數(shù)。熒光定量PCR(fluorogenicquantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)結(jié)果顯示，siRNA能降低細(xì)胞內(nèi)外HBV DNA的拷貝數(shù)，其中pSUPER-HBV2、pSUPER-HBV5均使培養(yǎng)上清中的HBV DNA下降2個數(shù)量級，抑制率高達(dá)99.7％和98.5％，其余pSUPER-HBV1、pSUPER-HBV4和pSUPER-HBV3對培養(yǎng)上清中HBV DNA的抑制率分別為95.7％、92.3％和62.9％(附圖11A)。對細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行的FQ-PCR檢測結(jié)果與培養(yǎng)上清中所得到的結(jié)果類似，pSUPER-HBV(1-5)對對細(xì)胞內(nèi)HBV DNA的抑制率分別為81.1％、82.8％、63.8％、74.5％和82.1％(附圖11B)。上述FQ-PCR結(jié)果說明siRNA能抑制細(xì)胞內(nèi)HBV DNA的復(fù)制。
(9)siRNA持續(xù)抑制HBV抗原的表達(dá)篩選出的單克隆細(xì)胞在含10％FBS、200μg/ml G418和200μg/ml潮霉素的MEM培養(yǎng)基中持續(xù)傳代培養(yǎng)，定期接種細(xì)胞3×105于6孔板，共3個復(fù)孔，用含相同濃度G418和潮霉素的DMEM培養(yǎng)基于同等條件下培養(yǎng)72h，收集各時段的培養(yǎng)上清用于HBsAg和HBeAg的檢測。對HBV抗原表達(dá)的持久、動態(tài)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，載體轉(zhuǎn)錄的siRNA能夠持續(xù)、高效地抑制HBV基因的表達(dá)抑制效果較好的pSUPER-HBV2、pSUPER-HBV5在長達(dá)10個月的培養(yǎng)過程中HBsAg幾乎維持不變，僅HBeAg有輕微的上升；pSUPER-HBV1、pSUPER-HBV4結(jié)果與之相似(附圖12)，pSUPER-HBV3的結(jié)果變化幅度較大，這可能與在挑取單克隆細(xì)胞時克隆不純有關(guān)。
3.siRNA對轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV的抑制作用(1)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的處理清潔級C57BL/6J-HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(6-8周齡，體重15-20g)從北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部購買，每只HBV轉(zhuǎn)基因小鼠均經(jīng)過嚴(yán)格檢測，體內(nèi)均有HBV的表達(dá)。24只HBV轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為3組pSUPER-HBV2組、pSUPER-HBV5組和pSUPER組，每組8只。
水壓轉(zhuǎn)染法(hydrodynamics-based transfection)給藥按照HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體重的10％準(zhǔn)備生理鹽水溶液(1.5-2.0ml)，取40μg不同組別的質(zhì)粒DNA溶于相應(yīng)體積的生理鹽水溶液中。將固定在捕鼠器外的小鼠尾消毒，用最小號頭皮針穿刺尾靜脈，回血后快速(＜5秒)將液體注射入小鼠體內(nèi)。注射后第4、7天，各組分別處理4只小鼠，收集血樣用于實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測，取肝組織制片，HE或免疫組織化學(xué)染色。
(2)siRNA對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBsAg的抑制作用抗HBV效果較好的pSUPER-HBV2、pSUPER-HBV5和對照載體pSUPER經(jīng)水壓轉(zhuǎn)染法注射入小鼠體內(nèi)，血清中HBsAg測定結(jié)果顯示，注入第4、7天時，pSUPER-HBV2對小鼠體內(nèi)HBsAg的抑制率分別為59.3％和60.3％，pSUPER-HBV5的抑制率為26％、40％。表明pSUPER-HBV2在體內(nèi)的抗HBV效果優(yōu)于pSUPER-HBV5，第7天的結(jié)果比第4天的結(jié)果稍好(附圖13)。
(3)siRNA抑制轉(zhuǎn)基因小鼠體肝臟中HBsAg的表達(dá)C57BL/6J-HBV轉(zhuǎn)基因小鼠各組織器官未見明顯肉眼可見病變。光鏡下C57BL/6J-HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞彌漫性腫脹，肝細(xì)胞胞質(zhì)呈伊紅均染(毛玻璃樣變性)，局部可見巨核肝細(xì)胞，散在的單個肝細(xì)胞胞質(zhì)固縮深染伴核固縮深染，部分肝細(xì)胞質(zhì)中可見嗜酸性小體，膽管上皮細(xì)胞排列不整，胞質(zhì)內(nèi)嗜酸性物質(zhì)增多(附圖14)。C57BL小鼠肝組織未見明顯病理改變。
將導(dǎo)入siRNA的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟固定，石蠟包埋，切片經(jīng)脫蠟水化后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果觀察到對照組(注射pSUPER質(zhì)粒)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞漿內(nèi)有大量棕褐色顆粒(HBsAg)，而注射了40μg重組質(zhì)粒7d的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的棕褐色顆粒明顯減少，染色陽性細(xì)胞所占比例降低。其中pSUPER-HBV2處理組HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的肝組織中HBsAg表達(dá)水平已接近正常的C57BL小鼠染色結(jié)果(圖15)。
(4)siRNA抑制轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV DNA的復(fù)制取轉(zhuǎn)基因小鼠血清進(jìn)行FQ-PCR檢測HBV DNA，F(xiàn)Q-PCR結(jié)果表明pSUPER-HBV2在第4、7天時對小鼠體內(nèi)HBV DNA的抑制率分別為67.6％和78.3％，pSUPER-HBV5的抑制率為60.3％、73％(圖16)。說明載體轉(zhuǎn)錄的s iRNA能抑制轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV DNA的復(fù)制。
(5)siRNA對轉(zhuǎn)基因小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的影響肝臟中富含丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)，肝臟受損時ALT可釋放到血清中，導(dǎo)致ALT生高，故檢測血清ALT能反映肝臟的損害。
注射siRNA表達(dá)載體后，用速率法于7070自動生化分析儀上測定小鼠血清中ALT含量，結(jié)果顯示注入pSUPER-HBV2、pSUPER-HBV5第4、7d，小鼠體內(nèi)ALT水平與對照組相比無明顯差異(表2)。說明載體轉(zhuǎn)錄的siRNA體內(nèi)應(yīng)用時不會對肝臟造成損害。
表2 siRNA對轉(zhuǎn)基因小鼠血清ALT的影響(x±s，n＝4)

序列表<110>楊安鋼<120>HBV特異性干涉靶位點(diǎn)基因及其siRNA和其在抗HBV感染中的應(yīng)用<160>15<210>1<211>19<212>DNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>gene<222>(1)...(19)<400>1tgtcaacgac cgaccttga 19<210>2<211>19<212>DNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>gene<222>(1)...(19)<400>2
tgtgcactt cgcttcacct 19<210>3<211>19<212>DNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>gene<222>(1)...(19)<400>3ggctcagttt actagtgcc 19<210>4<211>19<212>DNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>gene<222>(1)...(19)<400>4tagagtctc cggaacattg 19<210>5<211>19<212>DNA
<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>gene<222>(1)...(19)<400>5tcctgctgct atgcctcat 19<210>6<211>21<212>RNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<400>6UGUCAACGACCGACCUUGAdTdTdTdTACAGUUGCUGGCUGGAACU<210>7<211>21<212>RNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)...(21)<400>7UGUCAACGACCGACCUUGAUUUUACAGUUGCUGGCUGGAACU<210>8<211>21<212>RNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<400>8UGUGCACUUCGCUUCACCUdTdTdTdTACACGUGAAGCGAAGUGGA<210>9<211>21<212>RNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<400>9
UGUGCACUUCGCUUCACCUUUUUACACGUGAAGCGAAGUGGA<210>10<211>21<212>RNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<400>10GGCUCAGUUUACUAGUGCCdTdTdTdTCCGAGUCAAAUGAUCACGG<210>11<211>21<212>RNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<400>11GGCUCAGUUUACUAGUGCCUUUUCCGAGUCAAAUGAUCACGG
<210>12<211>21<212>RNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<400>12UAGAGUCUCCGGAACAUUGdTdTdTdTAUCUCAGAGGCCUUGUAAC<210>13<211>21<212>RNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<400>13UAGAGUCUCCGGAACAUUGUUUUAUCUCAGAGGCCUUGUAAC<210>14<211>21<212>RNA
<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<400>14UCCUGCUGCUAUGCCUCAUdTdTdTdTAGGACGACGAUACGGAGUA<210>15<211>21<212>RNA<213>人(homo sp.)和乙型肝炎病毒(hepatitis B vifus，HBV)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<400>15UCCUGCUGCUAUGCCUCAUUUUUAGGACGACGAUACGGAGUA。
權(quán)利要求
1.HBV特異性干涉靶位點(diǎn)基因，其具有序列表<400>1-5之一的序列。
2.由權(quán)利要求1所述的基因經(jīng)人工合成或載體產(chǎn)生的siRNA，其具有序列表<400>6-15之一的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的基因在制備用于抗HBV感染的治療藥物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求2所述的siRNA在制備用于抗HBV感染的治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種乙型肝炎病毒(HBV)特異性干涉靶位點(diǎn)基因、上述基因生成的siRNA以及所述的基因和siRNA在制備用于抗HBV感染的治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明篩選所得到的HBV靶向基因，經(jīng)載體表達(dá)后產(chǎn)生能特異性地識別和降解HBV的siRNA效應(yīng)分子，無論是使用表達(dá)siRNA重組載體直接進(jìn)行靜脈注射，或?qū)⑷斯ず铣傻膕iRNA注射入乙型肝炎患者體內(nèi)，均能產(chǎn)生高效、特異的抗HBV作用。本發(fā)明篩選所得到的HBV靶向siRNA具有以下特點(diǎn)高度的特異性、高效性、持續(xù)性和安全性，本發(fā)明可望為HBV感染的治療提供一種新手段。
文檔編號A61P1/00GK1793359SQ20051009634
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月15日
發(fā)明者楊安鋼, 劉家云, 李慶霞, 馬龍洋, 黃紅艷, 許彥鳴, 溫偉紅, 賈林濤, 孟艷玲, 王成濟(jì) 申請人:楊安鋼