專利名稱：人鼻咽組織特異性基因nasg編碼蛋白及其抗體的制備的制作方法
專利說明人鼻咽組織特異性基因NASG編碼蛋白及其抗體的制備 本發(fā)明涉及一種蛋白藥物的開發(fā)與應(yīng)用[背景技術(shù)]鼻咽癌是中國南方及東南亞地區(qū)常見的惡性腫瘤之一，該地區(qū)發(fā)病率高達(dá)50/10萬?？寺∨c鼻咽癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的遺傳易感基因是揭開鼻咽癌發(fā)病分子機(jī)制的必然途徑，也將對鼻咽癌的防治有著重要的指導(dǎo)意義。人鼻咽組織特異性基因的分離鑒定一直是從事鼻咽癌分子機(jī)理研究和鼻咽癌基因治療的科學(xué)工作者長期夢寐以求的。利用組織特異性的基因啟動(dòng)子來限制目的基因只在靶細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)的策略在基因治療中是特別重要的。鼻咽癌病人就診時(shí)大多到了中晚期，目前常常借助創(chuàng)傷性鼻咽活檢來確診。分子診斷的特點(diǎn)是靈敏度高、特異性強(qiáng)、取材一般不受組織或時(shí)相限制。隨首分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，對腫瘤的認(rèn)識由宏觀世界進(jìn)入了微觀世界，普通病理形態(tài)學(xué)的研究已不能適應(yīng)腫瘤學(xué)研究的需要，應(yīng)用分子診斷技術(shù)，對腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理學(xué)機(jī)制及生物學(xué)行為能從分子水平上加以認(rèn)識。鼻咽癌治療方法包括放療、外科手術(shù)治療和化學(xué)藥物治療，以放療為主。鼻咽癌放療的5年生存率僅為50％左右，現(xiàn)有的治療方法難以根治鼻咽癌。本發(fā)明的目的在于提供一種人鼻咽組織特異性基因NASG編碼蛋白及其抗體。
本發(fā)明采用成人鼻咽組織cDNA制備檢測子(tester)，以成人食管、肺、肝、心、胃、脾、肌肉、腎和皮膚cDNA制備驅(qū)趕子(driver)，采用抑制性消減雜交技術(shù)獲得14個(gè)鼻咽差異表達(dá)基因的cDNA片段。RT-PCR和76種組織表達(dá)陣列雜交結(jié)果表明，NASG(nasopharynx-specific gene)在人鼻咽和氣管相對特異性表達(dá)，在肺和唾液腺弱表達(dá)，而在其他組織未檢測到明顯表達(dá)。NASG為一新基因序列，其Genbank登錄號為AF439448。
在人胚鼻咽上皮與鼻咽癌上皮細(xì)胞株HNE1之間，正常成人鼻咽組織和鼻咽癌活檢組織之間進(jìn)行抑制性消減雜交，獲得鼻咽癌相關(guān)的消減cDNA文庫。從這該文庫中隨機(jī)挑取1200個(gè)克隆(每個(gè)文庫分別隨機(jī)挑取300個(gè)克隆)，用機(jī)械手按5×5矩陣方式制備成cDNA microarray膜，分別與經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的人胚鼻咽上皮細(xì)胞、鼻咽癌HNE1、成人鼻咽、鼻咽癌活檢標(biāo)本的第一鏈cDNA雜交，雜交信號經(jīng)自動(dòng)掃描檢測和對比分析，對存在5倍差異的克隆進(jìn)行了序列測定，獲得了23個(gè)鼻咽癌差異表達(dá)基因的cDNA片段。RT-PCR和Northern blot雜交分析表明，NASG基因在鼻咽癌上皮細(xì)胞株HNE1和71％(34/48)的鼻咽癌活檢標(biāo)本中表達(dá)下調(diào)。生物信息學(xué)分析表明可能是一個(gè)對呼吸道具有保護(hù)作用的分泌型蛋白。
本發(fā)明利用鼻咽組織特異性基因和鼻咽癌易感基因，對在鼻咽組織特異性表達(dá)且在鼻咽癌表達(dá)下調(diào)基因NASG的編碼蛋白。
其具體方案為1>GST/NASG融合蛋白的原核表達(dá)①據(jù)原核表達(dá)載體pEGX-4T-2的GST閱讀框架設(shè)計(jì)引物，使NASG基因的編碼區(qū)閱讀框與GST的閱讀框架一致。引物序列5’端帶SalI酶切位點(diǎn)，3’端引物帶NotI酶切位點(diǎn)。②以成人鼻咽cDNA文庫為模板，PCR擴(kuò)增NASG基因的編碼區(qū)，回收PCR產(chǎn)物條帶。用SalI和NotI酶切PCR回收產(chǎn)物及pEGX-4T-2載體。小膠回收試劑回收線性的4.9kb的載體，NASG編碼區(qū)片段。③將pEGX-4T-2載體分別與NASG基因連接，構(gòu)建成符合讀框的融合基因。用含融合基因的pEGX-4T-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，小量制備質(zhì)粒DNA，SalI和NotI酶切鑒定是否含插入片段，含插入片段的陽性克隆質(zhì)粒DNA純化后用DNA自動(dòng)測序儀測序。④挑單個(gè)陽性菌落接種入含氨卞青霉素(100μg/ml)的2ml LB培養(yǎng)液中，37℃，過夜培養(yǎng)；將50μl過夜培養(yǎng)物分別接種到5ml含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培基中，于37℃培養(yǎng)2h，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃，在培養(yǎng)的不同時(shí)刻(0.5、1、2、3、4和5小時(shí))各取1ml轉(zhuǎn)移至微量離心管中，離心去上清，將沉淀重懸于25μl TE中，再加25μl2×SDS凝膠加樣緩沖液(100mmol/L，Tris·HCl pH6.8，4％SDS，5％β-巰基己醇，0.002％溴酚藍(lán)，20％甘油)中，混勻菌液，20kHz超聲破碎，收集上清液；在12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中各加15μl上清進(jìn)行電泳。80-120V室溫電泳8h。考馬斯亮藍(lán)染色，觀察到NASG融合蛋白的表達(dá)。
2>融合蛋白的分離純化用谷胱苷肽Sepharose 4B過柱分離、純化融合蛋白。
NASG的編碼蛋白抗體制備1>多抗制備收獲純化的融合蛋白免疫家兔，采血制備血清，免疫沉淀法或親或?qū)游龇ǚ蛛x獲得多抗。
2>單抗的制備體外致敏法免疫B淋巴細(xì)胞(脾細(xì)胞懸液)，與骨髓瘤細(xì)胞融合，ELISA檢測、篩選陽性克隆，雜交瘤細(xì)胞克隆化、再檢測，腹腔注射BALB/c小鼠，收集動(dòng)物血清或腹水，對單克隆抗體性質(zhì)進(jìn)行鑒定，特異性免疫沉淀法或親和層析法分離純化單抗。
應(yīng)用NASG基因在人鼻咽組織特異性表達(dá)，制備診斷試劑盒，用以早期診斷鼻咽癌。
NASG基因在人鼻咽組織特異性表達(dá)且在鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)(34/48)，NASG編碼產(chǎn)物及其抗體的制備將為鼻咽癌的基因診斷和治療提供新的手段。基因診斷的特點(diǎn)是靈敏度高、特異性強(qiáng)、取材一般不受組織或時(shí)相限制，能夠?qū)崿F(xiàn)鼻咽癌的早診斷、早發(fā)現(xiàn)和早治療。利用NASG編碼產(chǎn)物治療鼻咽癌是一種全新的治療策略，有望實(shí)現(xiàn)鼻咽癌的無創(chuàng)傷性、根治性治療。

圖1NASG基因在76種組織中的差異表達(dá)，其中，圖1-aNASG與MTE array的雜交結(jié)果，圖1-bUbiquitin與MTE array的雜交結(jié)果，圖1-c76種組織分布情況。
圖2聯(lián)合抑制性消減雜交和cDNA microarray分離鼻咽癌候選易感基因。
圖3RT-PCR檢測NASG在正常鼻咽組織和鼻咽癌活檢標(biāo)本中的表達(dá)1，2.正常成人鼻咽，3～11.鼻咽癌活檢標(biāo)本。
圖4NASG融合蛋白在在大腸桿菌中的原核表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種人鼻咽組織特異性基因NASG編碼蛋白的制備方法，其特征在于本發(fā)明利用鼻咽組織特異性基因和鼻咽癌易感基因，對在鼻咽組織特異性表達(dá)且在鼻咽癌表達(dá)下調(diào)基因NASG的編碼蛋白，其具體方案為1>GST/NASG融合蛋白的原核表達(dá)①據(jù)原核表達(dá)載體pEGX-4T-2的GST閱讀框架設(shè)計(jì)引物，使NASG基因的編碼區(qū)閱讀框與GST的閱讀框架一致；②以成人鼻咽cDNA文庫為模板，PCR擴(kuò)增NASG基因的編碼區(qū)，回收PCR產(chǎn)物條帶；③將pEGX-4T-2載體分別與NASG基因連接，構(gòu)建成符合讀框的融合基因；④挑單個(gè)陽性菌落接種入含氨卞青霉素(100μg/ml)的2ml LB培養(yǎng)液中，37℃，過夜培養(yǎng)；將50μl過夜培養(yǎng)物分別接種到5ml含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培基中，于37℃培養(yǎng)2h，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃，在培養(yǎng)的不同時(shí)刻各取1ml轉(zhuǎn)移至微量離心管中，離心去上清，將沉淀重懸于25μl TE中，再加25μl 2×SDS凝膠加樣緩沖液中，混勻菌液，20kHz超聲破碎，收集上清液；在12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中各加15μl上清進(jìn)行電泳，80-120V室溫電泳8h，考馬斯亮藍(lán)染色，觀察到NASG融合蛋白的表達(dá)；2>融合蛋白的分離純化用谷胱苷肽Sepharose 4B過柱分離、純化融合蛋白。
2.一種權(quán)利要求1所述NASG的編碼蛋白抗體制備方法，其特征在于收獲純化的融合蛋白免疫家兔，采血制備血清，免疫沉淀法或親或?qū)游龇ǚ蛛x獲得多抗。
3.一種權(quán)利要求1所述NASG的編碼蛋白抗體制備方法，其特征在于體外致敏法免疫B淋巴細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞融合，ELISA檢測、篩選陽性克隆，雜交瘤細(xì)胞克隆化、再檢測，腹腔注射BALB/c小鼠，收集動(dòng)物血清或腹水，對單克隆抗體性質(zhì)進(jìn)行鑒定，特異性免疫沉淀法或親和層析法分離純化單抗。
全文摘要
人鼻咽組織特異性基因NASG編碼蛋白及其抗體的制備。本發(fā)明采用成人鼻咽組織cDNA制備檢測子(tester)，以成人食管、肺、肝、心、胃、脾、肌肉、腎和皮膚cDNA制備驅(qū)趕子(driver)，采用抑制性消減雜交技術(shù)獲得14個(gè)鼻咽差異表達(dá)基因的cDNA片段。NASG基因在人鼻咽組織特異性表達(dá)且在鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)(34/48)，NASG編碼產(chǎn)物及其抗體的制備將為鼻咽癌的基因診斷和治療提供新的手段?；蛟\斷的特點(diǎn)是靈敏度高、特異性強(qiáng)、取材一般不受組織或時(shí)相限制，能夠?qū)崿F(xiàn)鼻咽癌的早診斷、早發(fā)現(xiàn)和早治療。是一種全新的治療策略，有望實(shí)現(xiàn)鼻咽癌的無創(chuàng)傷性、根治性治療。
文檔編號C07K14/47GK1482244SQ0213960
公開日2004年3月17日 申請日期2002年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月13日
發(fā)明者李桂源, 張必成, 李小玲, 沈守榮, 周鳴, 聶新民, 朱詩國, 呂紅斌, 向娟娟 申請人:中南大學(xué)