專利名稱：透明質(zhì)酸凝膠組合物、其制造方法及含該組合物的醫(yī)用材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由透明質(zhì)酸和高分子化合物組成的基本上不用化學(xué)交聯(lián)劑或化學(xué)修飾劑改性的新型難溶于水的透明質(zhì)酸凝膠組合物、及其制造方法，還特別涉及利用該組合物的機(jī)體相容性良好的醫(yī)用材料。
背景技術(shù)：
已知透明質(zhì)酸是β-D-N-乙酰葡糖胺和β-D-葡糖醛酸相交替結(jié)合而形成的直鏈高分子多糖，不具有種屬及臟器特異性，移植或注入機(jī)體內(nèi)都顯示良好的機(jī)體相容性。
將該透明質(zhì)酸作為醫(yī)用材料用于機(jī)體的場合，因易溶于水而在體內(nèi)滯留時(shí)間較短，為改進(jìn)此缺點(diǎn)，提出了多種透明質(zhì)酸的化學(xué)修飾物。還為了增強(qiáng)其作為醫(yī)用材料的強(qiáng)度、組織粘合性等多種物理性質(zhì)，加入高分子物質(zhì)改性，對許多透明質(zhì)酸組合物進(jìn)行了探討。
例如，透明質(zhì)酸組合物用作骨修復(fù)材料時(shí)，與用于關(guān)節(jié)用人工軟骨的場合比較，要求有更大的強(qiáng)度，而透明質(zhì)酸組合物用作防粘連材料時(shí)，與用作栓塞形成劑的場合比較，要求有更高的組織粘合性。
以前作為醫(yī)用材料有用的透明質(zhì)酸組合物，可以列舉例如特表平5-508161號(hào)、特表平6-508169號(hào)的透明質(zhì)酸鈉和羧甲基纖維素以碳化二亞胺類EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽]修飾的透明質(zhì)酸組合物的報(bào)道。還可列舉WO86/00912的合羧基的多糖(透明質(zhì)酸鈉、羧甲基葡聚糖、羧甲基淀粉、羧甲基纖維素等)以雙及多官能環(huán)氧化物BDDE(1，4-丁二醇縮水甘油醚)等交聯(lián)得到的透明質(zhì)酸組合物的報(bào)道。還可列舉特開昭61-164558號(hào)的透明質(zhì)酸鈉、硫酸軟骨素、肝素等以多官能環(huán)氧化物和溴化氰、環(huán)氧氯丙烷等交聯(lián)得到的透明質(zhì)酸組合物的報(bào)道。還可列舉特開昭61-138601號(hào)的透明質(zhì)酸鈉和各種高分子化合物以二乙烯基砜交聯(lián)的透明質(zhì)酸組合物的報(bào)道。還可列舉特開平6-73102號(hào)、特開平8-301903號(hào)的透明質(zhì)酸鈉和各種高分子化合物以肉桂酸交聯(lián)得到的透明質(zhì)酸組合物的報(bào)道。
然而，它們不僅很難完全除去制造時(shí)使用的交聯(lián)劑等進(jìn)行精制，而且在透明質(zhì)酸和高分子化合物的分子中包含了交聯(lián)劑，其生理作用和機(jī)體相容性、安全性，在本質(zhì)上很難說與透明質(zhì)酸和高分子化合物等同。
還沒有開發(fā)出最大限度地利用透明質(zhì)酸和高分子物質(zhì)本身原來具有的優(yōu)良的機(jī)體相容性特征、不使用任何化學(xué)交聯(lián)劑和化學(xué)修飾劑、可能用作具機(jī)體相容性的醫(yī)用材料的、在機(jī)體內(nèi)滯留時(shí)間長的透明質(zhì)酸組合物。
本發(fā)明者為達(dá)到上述目的，深入探討了只含透明質(zhì)酸的、機(jī)體相容性和成型性優(yōu)良的、具有體內(nèi)分解性的、不使用化學(xué)交聯(lián)劑和化學(xué)修飾劑的透明質(zhì)酸凝膠(PCT/JP98/03536)本身的物理化學(xué)性質(zhì)。
此外，發(fā)現(xiàn)由透明質(zhì)酸和高分子化合物組成、實(shí)際上不用化學(xué)交聯(lián)劑或化學(xué)修飾劑改性的透明質(zhì)酸凝膠組合物，能增強(qiáng)透明質(zhì)酸凝膠原有的強(qiáng)度、粘合性、粘度、彈性等性質(zhì)，適合于單用透明質(zhì)酸凝膠難以滿足的對醫(yī)用材料的物性要求，且制備簡便，作為醫(yī)用材料具有理想的機(jī)體相容性和滯留性，從而完成了本發(fā)明。
尤其作為高分子化合物采用羧甲基纖維素的場合，該透明質(zhì)酸凝膠組合物特別適于作為防止粘連的材料和復(fù)蓋創(chuàng)口的材料。
發(fā)明的揭示即本發(fā)明是(1)特征為由透明質(zhì)酸和高分子化合物組成、實(shí)際上不用化學(xué)交聯(lián)劑或化學(xué)修飾劑改性、在中性的37℃水溶液中12小時(shí)內(nèi)的透明質(zhì)酸溶出率在50％以下的透明質(zhì)酸凝膠組合物；(2)特征是高分子化合物為羧甲基纖維素的(1)所記載的透明質(zhì)酸凝膠組合物；(3)特征是將含有透明質(zhì)酸和高分子化合物的pH3.5以下的水溶液或分散液凍結(jié)，然后解凍而形成透明質(zhì)酸凝膠組合物的透明質(zhì)酸凝膠組合物的制造方法；(4)特征是將含有透明質(zhì)酸的pH3.5以下的水溶液凍結(jié)、然后解凍而形成的透明質(zhì)酸凝膠與高分子化合物或高分子化合物凝膠混合而形成透明質(zhì)酸凝膠組合物的透明質(zhì)酸凝膠組合物的制造方法；(5)特征是高分子化合物為選自多糖類、蛋白質(zhì)、核酸類以及合成高分子化合物中的一種以上的(3)或(4)記載的透明質(zhì)酸凝膠組合物的制造方法；(6)特征是高分子化合物為羧甲基纖維素的(3)或(4)記載的透明質(zhì)酸凝膠組合物的制造方法；(7)特征是含有(1)或(2)記載的透明質(zhì)酸凝膠組合物的醫(yī)用材料；(8)特征是含有透明質(zhì)酸凝膠組合物以選自γ射線、電子射線、等離子體或EOG中的一種照射或注入而得到的透明質(zhì)酸凝膠組合物的醫(yī)用材料；(9)特征是醫(yī)用材料為防粘連材料的(7)所記載的醫(yī)用材料；(10)特征是醫(yī)用材料為創(chuàng)口復(fù)蓋材料的(7)所記載的醫(yī)用材料。
實(shí)施本發(fā)明的最佳形態(tài)以下對本發(fā)明詳細(xì)進(jìn)行說明。
本發(fā)明所述改性，是指為使原來具水溶性的透明質(zhì)酸或高分子化合物難溶化而進(jìn)行的交聯(lián)或化學(xué)修飾。
本發(fā)明的透明質(zhì)酸凝膠組合物，是將含透明質(zhì)酸和高分子化合物的pH3.5以下的水溶液或分散液凍結(jié)，然后解凍、中和、洗滌、干燥而得到。
或者本發(fā)明的透明質(zhì)酸凝膠組合物，是將含透明質(zhì)酸的pH3.5以下的水溶液凍結(jié)然后解凍得到的透明質(zhì)酸凝膠破碎，與高分子化合物凝膠一起投入水等水溶液中，經(jīng)破碎、分散、干燥而得。
這些透明質(zhì)酸凝膠組合物，與單用透明質(zhì)酸凝膠的場合比較，能簡單地提高機(jī)械強(qiáng)度和組織粘合性。
調(diào)整透明質(zhì)酸和高分子化合物的水溶液的pH所使用的酸，只要是能調(diào)整pH至3.5以下的酸，都可以使用。為減少酸的使用量，最好使用強(qiáng)酸，例如鹽酸，硝酸，硫酸等。
凍結(jié)和解凍，是將已調(diào)整至酸性的透明質(zhì)酸和高分子化合物水溶液置于任何容器中，然后凍結(jié)至設(shè)定溫度，在凍結(jié)結(jié)束后，至少進(jìn)行一次使其于所規(guī)定的溫度解凍的操作。凍結(jié)和解凍的溫度和時(shí)間可根據(jù)容器的大小、水溶液的量在透明質(zhì)酸酸性水溶液凍結(jié)、解凍的溫度和時(shí)間范圍內(nèi)適當(dāng)決定，但通常凍結(jié)溫度在冰點(diǎn)以下、解凍溫度為冰點(diǎn)以上較好。
由于凍結(jié)、解凍時(shí)間可以縮短，最好選用-5℃以下作凍結(jié)溫度，選5℃以上作解凍溫度。而時(shí)間只要是在該溫度凍結(jié)、解凍結(jié)束的時(shí)間以上，沒有特別限制。
將調(diào)整到酸性的透明質(zhì)酸及高分子化合物的水溶液凍結(jié)然后解凍的操作的重復(fù)次數(shù)，根據(jù)所使用的透明質(zhì)酸的分子量、水溶液濃度、水溶液的pH、凍結(jié)以及解凍的溫度和時(shí)間，以及生成的透明質(zhì)酸凝膠組合物的強(qiáng)度等各種特性適當(dāng)決定。通常最好重復(fù)一次以上。
而重復(fù)凍結(jié)、解凍操作中，也可以改變其凍結(jié)、解凍的溫度和時(shí)間。
透明質(zhì)酸凝膠組合物的成型加工等的處理，可于制造時(shí)選擇透明質(zhì)酸已調(diào)至酸性的溶液凍結(jié)時(shí)的容器和操作，制成所希望的片狀、膜狀、破碎狀、海綿狀、塊狀、纖維狀、流動(dòng)狀和管狀的形式的透明質(zhì)酸凝膠組合物。
例如將透明質(zhì)酸組合物及其分散液置于平底容器中冷凍干燥，就可得到片狀的透明質(zhì)酸凝膠組合物。
而例如將透明質(zhì)酸組合物及其分散液置于平底容器中晾干，就可得到膜狀的透明質(zhì)酸凝膠組合物。
本發(fā)明所用的透明質(zhì)酸，不管其來源，由動(dòng)物組織提取或用發(fā)酵法制造的，都可以使用。
本發(fā)明所用的透明質(zhì)酸的分子量最好在約1×105～1×107道爾頓的范圍內(nèi)。而且只要是分子量在上述范圍內(nèi)的，即使是從較高分子量的透明質(zhì)酸經(jīng)水解處理等得到的，也同樣可以使用。
而本發(fā)明的透明質(zhì)酸可使用其堿金屬鹽，包括例如鈉、鉀、鋰鹽。
本發(fā)明所用的高分子化合物，不管是天然高分子化合物、合成高分子化合物，只要是可生成本發(fā)明的透明質(zhì)酸凝膠組合物，且對于單用透明質(zhì)酸凝膠難以滿足的醫(yī)用材料所要求的物理性質(zhì)而言，能增強(qiáng)其透明質(zhì)酸凝膠原有的性質(zhì)的，不管什么高分子化合物都可使用。
因此，不管高分子化合物相互之間，或高分子化合物和透明質(zhì)酸凝膠之間是否形成交聯(lián)，加入透明質(zhì)酸凝膠中可生成本發(fā)明的透明質(zhì)酸凝膠組合物的所有高分子化合物都可用于本發(fā)明。
可用于本發(fā)明的高分子化合物的代表例，可從多糖類、蛋白質(zhì)、核酸類以及合成高分子化合物中選擇，總之沒有什么限制。
作為多糖類的例子，可列舉葡糖胺基葡聚糖類(肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素等)、硫酸軟骨素(硫酸軟骨素-6-硫酸等)、硫酸角蛋白、肝素、硫酸乙酰肝素、藻酸及其生物學(xué)上允許的鹽、纖維素、殼多糖、殼聚糖、葡聚糖、淀粉、直鏈淀粉、聚乳酸、角叉菜膠等。
而作為多糖類的合成衍生物，可列舉例如羧甲基纖維素、羧甲基直鏈淀粉、各種烷基纖維素、羥乙基纖維素、羧基纖維素及氧化淀粉氧化再生纖維素等。
而作為蛋白質(zhì)的實(shí)例，可列舉膠原、明膠、清蛋白、彈性蛋白、各種球蛋白、酪蛋白、谷蛋白等，以及它們的生物學(xué)允許的合成衍生物等。
而作為合成高分子化合物的例子，可列舉聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙醇酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、它們的共聚物、以及聚丙烯酸/甲基丙烯酸羥乙酯、聚丙烯酰胺等、聚乙烯醇、馬來酸及富馬酸的共聚物等這類衍生物等。
而本發(fā)明對這些高分子化合物不加任何限制。
本發(fā)明所用的含透明質(zhì)酸和高分子化合物的pH3.5以下的水溶液或分散液，系將透明質(zhì)酸和高分子化合物與水混合、攪拌而得。其透明質(zhì)酸與高分子化合物的濃度分別在5.0質(zhì)量％以下，對水溶液或分散液的處理都很方便。
特別是使用分子量為2×106道爾頓以上的透明質(zhì)酸的場合，透明質(zhì)酸的濃度以2.5質(zhì)量％以下為佳。
而含透明質(zhì)酸和高分子化合物的pH3.5以下的水溶液或分散液的配比，只要通過該液的凍結(jié)、解凍能得到透明質(zhì)酸凝膠組合物即可，并無特別限制。例如，作為防粘連材料的配比，以50∶1～1∶20為佳。
或者在本發(fā)明中先分別制備透明質(zhì)酸凝膠和高分子化合物凝膠，將其破碎得到透明質(zhì)酸凝膠破碎物和高分子化合物凝膠破碎物，再混合，也可用作透明質(zhì)酸凝膠組合物。
用于本發(fā)明的透明質(zhì)酸凝膠和高分子化合物凝膠的混合比例，只要是投入水等水溶液中，可破碎、分散即可，沒有特別限制。
本發(fā)明所得透明質(zhì)酸凝膠組合物，只要是通常的機(jī)體分解性醫(yī)用材料和透明質(zhì)酸和使用領(lǐng)域內(nèi)的，都可使用，沒有特別限制。例如可列舉其使用于防粘連材料、關(guān)節(jié)用人工軟骨、藥理活性化合物的載體、創(chuàng)口復(fù)蓋材料、人工皮膚、組織轉(zhuǎn)換型機(jī)體組織修復(fù)材料、關(guān)節(jié)注入劑、外科手術(shù)用縫合線、止血?jiǎng)?、人工臟器、人工細(xì)胞外基質(zhì)或人工基底膜、用于診斷、治療的醫(yī)療器具、醫(yī)療用具等生物醫(yī)學(xué)制品或醫(yī)藥組合物。
而在透明質(zhì)酸凝膠和高分子化合物凝膠混合時(shí)，通過混入生理活性物質(zhì)，也可得到包含生理活性物質(zhì)的透明質(zhì)酸凝膠組合物。
下面，對本發(fā)明的透明質(zhì)酸凝膠組合物經(jīng)照射處理的醫(yī)用材料作一說明。照射透明質(zhì)酸凝膠組合物的γ射線，以鈷60或銫137作放射源較好。理想的是用30kGy以下的吸收劑量的γ射線照射透明質(zhì)酸凝膠組合物干品，得到作防粘連材料、創(chuàng)口治療材料有效的透明質(zhì)酸凝膠組合物。而通過改變照射量、照射時(shí)間，控制透明質(zhì)酸凝膠組合物的溶解度，可控制其用作體內(nèi)材料時(shí)適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)滯留性。透明質(zhì)酸凝膠組合物通過γ射線照射，預(yù)期也具有滅菌效果。
照射透明質(zhì)酸凝膠組合物的電子射線由電子加速器發(fā)生。理想的是用30kGy以下的吸收劑量的電子射線照射透明質(zhì)酸凝膠組合物的干品，得到作為防粘連材料、創(chuàng)口復(fù)蓋材料有效的透明質(zhì)酸凝膠組合物。
等離子體可與固體、液體和氣體相區(qū)別，可認(rèn)為是物質(zhì)的第四態(tài)，它是通過極高的溫度或者強(qiáng)大的電場或磁場的作用而形成的，通常由離子、電子和中性核素組成。讓電作用于氣流形成的離子化氣體，已知有輝光放電。
照射透明質(zhì)酸凝膠組合物的等離子體可采用氫、氧、惰性載氣的混合物暴露于電磁場形成的低溫氣體等離子體等。
將透明質(zhì)酸凝膠組合物干品置于等離子體發(fā)生器室內(nèi)，注入氬、氧、氫等組成的等離子體發(fā)生氣，并使之?dāng)U散，在等離子體氛圍氣下照射10分鐘以上，便能得到作為防粘連材料、創(chuàng)口復(fù)蓋材料有效的透明質(zhì)酸凝膠組合物。
EOG是對通常不可能干燥滅菌、蒸氣滅菌的物質(zhì)進(jìn)行的采用環(huán)氧乙烷氣體的滅菌法。將透明質(zhì)酸凝膠組合物干品置于EOG滅菌室內(nèi)，注入EOG，溫度條件最好在50℃以下進(jìn)行滅菌，對防粘連材料、創(chuàng)口復(fù)蓋材料是有效的。
通過改變注入EOG的溫度、時(shí)間，控制透明質(zhì)酸凝膠組合物的溶解度，可能控制用于體內(nèi)材料的適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)滯留性。
下面說明本發(fā)明的醫(yī)用材料中的防粘連材料。
本發(fā)明所得的透明質(zhì)酸凝膠組成物防粘連材料，可以片狀、膜狀、破碎狀、海綿狀、塊狀、纖維狀、流動(dòng)狀或管狀等形態(tài)用于外科手術(shù)。所用的形態(tài)，以膜狀或片狀直接貼附于外科手術(shù)部位為佳。而微細(xì)破碎狀、流動(dòng)狀以注射器涂布于外科手術(shù)部位為佳。而腹腔鏡手術(shù)中也可使用。
此外，在調(diào)至酸性的透明質(zhì)酸凝膠組合物溶液中混入生理活性化合物后進(jìn)行凍結(jié)、解凍，可能得到作為防粘連材料的含有生理活性化合物的透明質(zhì)酸凝膠組合物。
本發(fā)明所得的透明質(zhì)酸凝膠組合物防粘連材料的投與時(shí)間，在可防止術(shù)后粘連的任何時(shí)間都可以?？稍谑中g(shù)中或手術(shù)結(jié)束時(shí)給予，特別在手術(shù)即將結(jié)束前給予為佳。
實(shí)施例以下用實(shí)施例對本發(fā)明作更詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不受其限制。
實(shí)施例1分子量為2×106道爾頓的透明質(zhì)酸鈉與羧甲基纖維素鈉(和光純藥制)溶于蒸餾水，至濃度各為0.5質(zhì)量％。用1mol/L鹽酸使水溶液的pH調(diào)整為pH1.5。將酸性水溶液15ml置30ml的玻璃瓶中，置于設(shè)定溫度為-20℃的冷凍庫。放置5日后，于25℃解凍。結(jié)果得到海綿狀的透明質(zhì)酸凝膠組合物。
實(shí)施例2分子量為2×106道爾頓的透明質(zhì)酸鈉與聚乙烯醇(聚合度1500，和光純藥制)溶于蒸餾水，使?jié)舛确謩e為0.5質(zhì)量％、10質(zhì)量％。用1mol/L鹽酸調(diào)整pH，使調(diào)整后的水溶液pH為1.5。將酸性水溶液15ml置30ml玻璃瓶中，置設(shè)定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置5日后，于25℃解凍。結(jié)果得到塊狀的透明質(zhì)酸凝膠組合物。
實(shí)施例3分子量為2×106道爾頓的透明質(zhì)酸鈉與藻酸鈉(フナコシ公司制)溶于蒸餾水，使?jié)舛染鶠?.5質(zhì)量％。用1mol/L鹽酸調(diào)整pH，使調(diào)整后的水溶液的pH為1.5。將酸性水溶液15ml置30ml玻璃瓶中，置于設(shè)定溫度為-20℃的冷凍庫內(nèi)。放置5日后，于25℃解凍。結(jié)果得到海綿狀的透明質(zhì)酸凝膠組合物。
比較例1實(shí)施例1中不調(diào)整混合水溶液的pH，將中性溶液凍結(jié)、解凍、重復(fù)8次。結(jié)果，透明質(zhì)酸水溶液不發(fā)生變化。即，不發(fā)生膠凝。第9次凍結(jié)后，進(jìn)行冷凍干燥，得到海綿狀的透明質(zhì)酸組合物。
比較例2實(shí)施例2中不調(diào)整混合水溶液的pH，將中性溶液凍結(jié)、解凍，重復(fù)8次。結(jié)果，透明質(zhì)酸水溶液不發(fā)生變化。即，不發(fā)生膠凝。第9次凍結(jié)后，進(jìn)行冷凍干燥，得到海綿狀的透明質(zhì)酸組合物。
比較例3實(shí)施例3中不調(diào)整混合水溶液的pH，而將中性溶液凍結(jié)、解凍、重復(fù)8次。結(jié)果，透明質(zhì)酸水溶液不發(fā)生變化。即，不發(fā)生膠凝。第9次凍結(jié)后，進(jìn)行冷凍干燥，得到海綿狀的透明質(zhì)酸組合物。
參考例1將分子量2×106道爾頓的透明質(zhì)酸鈉溶于蒸餾水，至濃度為1.0質(zhì)量％。用1mol/L鹽酸調(diào)整pH，使調(diào)整后的水溶液的pH為1.5。將酸性水溶液15ml置30ml玻璃瓶中，置于設(shè)定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置5日后，于25℃解凍。結(jié)果得到海綿狀的透明質(zhì)酸凝膠。
實(shí)施例4透明質(zhì)酸凝膠組合物的溶解性試驗(yàn)在生理鹽水中加磷酸緩沖成分，濃度為50mmol/L，調(diào)整磷酸緩沖的生理鹽水至pH7。將上述實(shí)施例1～3所得的海綿狀透明質(zhì)酸凝膠組合物及參考例1所得的透明質(zhì)酸凝膠用蒸餾水洗滌，在濾紙上脫水。以相對所得的含透明質(zhì)酸干重150mg的透明質(zhì)酸凝膠組合物磷酸緩沖生理鹽水為50ml的比例，將透明質(zhì)酸凝膠組合物浸漬于磷酸緩沖的生理鹽水中。而對上述比較例1～3中所得的含透明質(zhì)酸干重150mg的冷凍干燥的海綿狀透明質(zhì)酸組合物，按磷酸緩沖生理鹽水50ml的比例，將透明質(zhì)酸組合物浸漬于磷酸緩沖的生理鹽水中。
然后目視得出透明質(zhì)酸凝膠組合物及透明質(zhì)酸組合物的溶解性。并從磷酸緩沖的生理鹽水中透明質(zhì)酸的濃度，求出25℃時(shí)透明質(zhì)酸在磷酸緩沖的生理鹽水中溶出的比例。
從而可從上述試驗(yàn)確定在25℃中性水溶液中透明質(zhì)酸凝膠組合物的溶解性。
透明質(zhì)酸濃度的測定磷酸緩沖的生理鹽水中的透明質(zhì)酸可使用GPC進(jìn)行測定。透明質(zhì)酸具高分子量，因此首先洗脫，然后低分子的羧甲基纖維素、聚乙烯醇被洗脫。透明質(zhì)酸的濃度，可用示差折光檢測器從透明質(zhì)酸洗脫峰的面積求出。
按照上述，具體進(jìn)行了實(shí)施例1～3的透明質(zhì)酸凝膠組合物、參考例1的透明質(zhì)酸凝膠、以及比較例1～3的透明質(zhì)酸組合物的溶解性試驗(yàn)。其結(jié)果如表1所示。
表1

由表1可見，例如，考察實(shí)驗(yàn)No.1的實(shí)施例1所得的透明質(zhì)酸凝膠組合物的溶解百分率，透明質(zhì)酸經(jīng)過1日后溶解百分率為2％，4日后為4％，而10日后為6％。即經(jīng)過10日，透明質(zhì)酸凝膠中有94％透明質(zhì)酸殘存。形態(tài)也保持海綿狀。
考察實(shí)驗(yàn)No.7的參考例1所得的透明質(zhì)酸凝膠的溶解百分率，經(jīng)過1日后溶解百分率為3％，4日后為5％，而10日后為10％。即發(fā)現(xiàn)實(shí)施例1～3所得的透明質(zhì)酸凝膠組合物的溶解百分率與參考例1所得的透明質(zhì)酸凝膠的溶解百分率相同。
與此相同，考察實(shí)驗(yàn)No.4～6的比較例1～3所得的透明質(zhì)酸組合物的溶解百分率，經(jīng)過1日后，溶解百分率為100％，即已完全溶解。
實(shí)施例5透明質(zhì)酸凝膠組合物的溶解性試驗(yàn)在生理鹽水中加磷酸緩沖成分，濃度為50mmol/L，調(diào)整磷酸緩沖的生理鹽水至pH7。將上述實(shí)施例1～3所得的海綿狀透明質(zhì)酸凝膠組合物及參考例1所得的透明質(zhì)酸凝膠用蒸餾水洗滌，在濾紙上脫水。對所得的含透明質(zhì)酸干重20mg的透明質(zhì)酸凝膠組合物，按磷酸緩沖生理鹽水50ml的比例，將透明質(zhì)酸凝膠組合物浸漬于磷酸緩沖的生理鹽水中。并對上述比較例1～3所得的含透明質(zhì)酸干重20mg的冷凍干燥的海綿狀透明質(zhì)酸組合物，按磷酸緩沖生理鹽水50ml的比例，將透明質(zhì)酸組合物浸漬于磷酸緩沖的生理鹽水中。
然后從磷酸緩沖生理鹽水中透明質(zhì)酸的濃度求得37℃透明質(zhì)酸在攪拌下的磷酸緩沖的生理鹽水中溶出的比例。
從而可從上述試驗(yàn)確定在37℃中性水溶液中透明質(zhì)酸凝膠組合物的溶解性。
根據(jù)上述，具體進(jìn)行了實(shí)施例1～3的透明質(zhì)酸凝膠組合物、參考例1的透明質(zhì)酸凝膠及比較例1～3的透明質(zhì)酸組合物的溶解性試驗(yàn)。其結(jié)果如表2所示。
表2

根據(jù)表2，考察例如實(shí)驗(yàn)No.8的實(shí)施例1所得的透明質(zhì)酸凝膠組合物的溶解百分率，透明質(zhì)酸經(jīng)6小時(shí)后溶解百分率為12％，12小時(shí)后為14％，而24小時(shí)后為18％。即經(jīng)過24小時(shí)后透明質(zhì)酸凝膠中透明質(zhì)酸仍殘存82％。
考察實(shí)驗(yàn)No.14的參考例1所得的透明質(zhì)酸凝膠的溶解百分率，經(jīng)過6小時(shí)后溶解百分率為12％，12小時(shí)后為15％，而24小時(shí)后為20％。即發(fā)現(xiàn)實(shí)施例1～3所得的透明質(zhì)酸凝膠組合物的溶解百分率與參考例1所得透明質(zhì)酸凝膠的溶解百分率相同。
與此相比，考察實(shí)驗(yàn)No.10～12的比較例1～3所得的透明質(zhì)酸組合物的溶解百分率，6小時(shí)后溶解百分率為100％，已完全溶解。
實(shí)施例6分子量2×106道爾頓的透明質(zhì)酸鈉與殼聚糖(和光純藥制)在蒸餾水中混和，其濃度分別為1.0質(zhì)量％、0.1質(zhì)量％，用1mol/L鹽酸調(diào)整pH至pH1.5。將酸性水溶液15ml置30ml玻璃瓶中，放入設(shè)定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置5日后，于25℃解凍。結(jié)果得到海綿狀的透明質(zhì)酸凝膠組合物。
實(shí)施例7透明質(zhì)酸凝膠組合物的溶解性試驗(yàn)在生理鹽水中加入磷酸緩沖成分至濃度為100mmol/L，調(diào)整磷酸緩沖的生理鹽水至pH7。將上述實(shí)施例1、2及6所得的海綿狀透明質(zhì)酸凝膠組合物用蒸餾水洗滌，在濾紙上脫水。對所得的含透明質(zhì)酸干重20mg的透明質(zhì)酸凝膠組合物，按100ml磷酸緩沖的生理鹽水的比例，在磷酸緩沖的生理鹽水中浸漬透明質(zhì)酸凝膠組合物。
從磷酸緩沖的生理鹽水中各成分的濃度，求出在25℃的磷酸緩沖的生理鹽水中溶出的透明質(zhì)酸、羧甲基纖維素、聚乙烯醇和殼聚糖的比例。
透明質(zhì)酸、羧甲基纖維素、聚乙烯醇以及殼聚糖濃度的測定使用GPC測定磷酸緩沖的生理鹽水中透明質(zhì)酸、羧甲基纖維素、聚乙烯醇及殼聚糖。由于透明質(zhì)酸具高分子量，首先從GPC洗脫，其后低分子的羧甲基纖維素、聚乙烯醇和殼聚糖被洗脫。用示差折光檢測器從峰面積求出該洗脫的透明質(zhì)酸峰。
根據(jù)上述，具體對實(shí)施例1、2及6的透明質(zhì)酸凝膠組合物進(jìn)行了溶解性試驗(yàn)。其結(jié)果如表3所示。
表3

根據(jù)表3，例如考察實(shí)驗(yàn)No.15的實(shí)施例1所得的透明質(zhì)酸凝膠組合物的溶解百分率，可見透明質(zhì)酸經(jīng)過1日后溶解百分率為2％，4日后為4％，而10日后為6％。而羧甲基纖維素1日后為10％，4日后為30％，而10日后為51％。
考察實(shí)驗(yàn)No.16的實(shí)施例2所得的透明質(zhì)酸凝膠組合物的溶解百分率，透明質(zhì)酸經(jīng)1日后溶解百分率為0％，4日后為1％，而10日后為3％。而聚乙烯醇1日后溶解百分率為0％，4日后為1％，而10日后為1％。
考察實(shí)驗(yàn)No.17的實(shí)施例6所得的透明質(zhì)酸凝膠組合物的溶解百分率，透明質(zhì)酸經(jīng)1日后溶解百分率為1％，4日后為4％，而10日后為5％。而殼聚糖1日后溶解百分率為4％，4日后為5％，而10日后為6％。
實(shí)施例8透明質(zhì)酸凝膠組合物的細(xì)胞毒性試驗(yàn)將來自正常人皮膚的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物與本發(fā)明所得的透明質(zhì)酸凝膠組合物在非接觸狀態(tài)下共存，觀察細(xì)胞增殖情況，評價(jià)其細(xì)胞毒性。用實(shí)施例1的方法制作的海綿狀透明質(zhì)酸凝膠組合物以磷酸緩沖的生理鹽水浸漬后，制成冷凍干燥物。將該冷凍干燥物機(jī)械粉碎，取20mg置于ファルコン公司制的細(xì)胞培養(yǎng)墊(cell culture insert，孔徑3μm)中，浸入接種有細(xì)胞的培養(yǎng)基中。將透明質(zhì)酸凝膠組合物非共存時(shí)的培養(yǎng)物，作為對照組。
培養(yǎng)條件平板細(xì)胞培養(yǎng)用12孔平板培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)基+10％胎牛血清，2ml/孔溫度37℃(5％CO2下)接種細(xì)胞數(shù)1×104個(gè)/孔培養(yǎng)開始后2日、5日、8日后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞密度，即使透明質(zhì)酸凝膠組合物共存時(shí)也顯示與對照組同樣良好的增殖，證明本發(fā)明得到的透明質(zhì)酸凝膠組合物沒有細(xì)胞毒性作用。
實(shí)施例9將分子量2×106道爾頓的透明質(zhì)酸鈉和羧甲基纖維素鈉(和光純藥制)溶于蒸餾水，使其濃度均為0.5質(zhì)量％。用1mol/L鹽酸調(diào)整該水溶液的pH至pH1.5，得透明質(zhì)酸酸性水溶液。將此透明質(zhì)酸酸性水溶液25ml置于塑料制的培養(yǎng)皿中，放入設(shè)定溫度為-20℃的冷凍庫。凍結(jié)5日，得海綿狀的透明質(zhì)酸凝膠組合物。然后將其浸漬于在生理鹽水中加磷酸緩沖成分至50mM濃度、并調(diào)整pH至7的磷酸緩沖的生理鹽水100ml中，于5℃經(jīng)24小時(shí)浸漬中和后，用蒸餾水充分洗滌。然后將其冷凍干燥。結(jié)果得片狀的透明質(zhì)酸凝膠組合物的防粘連材料。
實(shí)施例10將分子量為2×106道爾頓的透明質(zhì)酸鈉溶解至濃度為0.5質(zhì)量％。用1mol/L鹽酸調(diào)整pH至調(diào)整后的水溶液的pH為1.5。取酸性水溶液15ml置30ml的玻璃瓶中，放入設(shè)定溫度為-20℃的冷凍庫。放置5日后，于25℃解凍，將所得的海綿狀透明質(zhì)酸凝膠用微量勻漿器(Polytoron，Kinematica AG制)粉碎，得破碎的透明質(zhì)酸凝膠。
將25℃時(shí)1％粘度為150～250mPa·s的羧甲基纖維素鈉(醚化值0.62～0.68，換算分子量1.28×105～1.35×105道爾頓，第一工業(yè)制藥制)溶于蒸餾水，使?jié)舛葹?.5～1質(zhì)量％。用1mol/L硝酸將這樣配制的水溶液的pH調(diào)整至1.0，取酸性水溶液15ml置30ml的容器內(nèi)，放入設(shè)定溫度為-20℃的冷凍庫。放置3日后，于25℃解凍，將所得的海綿狀羧甲基纖維素凝膠用微量勻漿器(Polytoron，Kinematica AG制)粉碎，得破碎的羧甲基纖維素凝膠。
將所得的破碎的透明質(zhì)酸凝膠與羧甲基纖維素鈉凝膠投入蒸餾水，使其濃度均為10.0質(zhì)量％，并攪拌，得到漿狀液。將此漿狀液取25ml放入帶9cm角的塑料制培養(yǎng)皿中自然干燥。結(jié)果得到薄膜狀的透明質(zhì)酸凝膠組合物的防粘連材料。
比較例4實(shí)施例9中混合水溶液的pH不加調(diào)整，將中性溶液凍結(jié)、解凍、重復(fù)8次。結(jié)果，透明質(zhì)酸水溶液不起變化。即不發(fā)生膠凝。將此溶液放入塑料制的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行第9次凍結(jié)，冷凍干燥，得到片狀透明質(zhì)酸組合物的防粘連材料。
比較例5將在Na2HPO4·12H2O 1.1g溶于30g水、并用2％NaOH調(diào)整pH為10的溶液中平均分子量60萬的透明質(zhì)酸鈉0.3g與羧甲基纖維素鈉(和光純藥制)各0.3g溶于蒸餾水。將氰尿酰氯0.05g溶于1.5ml二噁烷，加至上述透明質(zhì)酸溶液中，室溫反應(yīng)3小時(shí)。此后，置透析膜中，對水透析1日，將此溶液15ml放入塑料制培養(yǎng)皿中，冷凍干燥，得片狀的氰尿酰氯交聯(lián)的透明質(zhì)酸組合物的防粘連材料。
實(shí)施例11透明質(zhì)酸凝膠組合物的防粘連材料用小鼠子宮模型進(jìn)行的防粘效果試驗(yàn)將實(shí)施例9與10所得片狀和膜狀的透明質(zhì)酸凝膠組合物的防粘連材料剪成1cm×2cm的長方形；對照組為比較例4所得的片狀透明質(zhì)酸組合物剪成的1cm×2cm長方形；并把比較例5所得的氰尿酰氯交聯(lián)的透明質(zhì)酸組合物剪成1cm×2cm的長方形，供以下試驗(yàn)。
取7周齡的ICR小鼠(體重25～30g)腹腔內(nèi)注射戊巴比妥麻醉后經(jīng)正中切開腹腔，將子宮角約10mm的長度以碘酊擦涂造成損傷。每組10只小鼠，對照組不加處理，其他各組損傷部位分別用上述實(shí)施例9和10的透明質(zhì)酸凝膠組合物的防粘連材料、比較例4的透明質(zhì)酸組合物的防粘連材料、比較例5的以氰尿酰氯交聯(lián)的透明質(zhì)酸組合物的防粘連材料的1cm×2cm的長方形片纏繞。然后每種情況都用5-0デキソン閉腹。
術(shù)后第10日，將無處理、給予透明質(zhì)酸凝膠組合物及透明質(zhì)酸組合物、氰尿酰氯交聯(lián)的透明質(zhì)酸組合物的小鼠各10只、經(jīng)頸椎脫臼致死后，腹部再開腹，判定有無粘連形成。粘連形成的判定，系將膜狀的極輕度的粘連不判定為粘連，而將發(fā)生纖維狀增厚的、用小鑷子拉也不易剝離的強(qiáng)烈粘連的情況判定為粘連。其結(jié)果如表4所示。
表4

由表4可見，無處理組粘連形成的比例為10只中有9只，而單用透明質(zhì)酸混合液于中性時(shí)凍結(jié)得到的透明質(zhì)酸組合物10只中有5只，以氰尿酰氯交聯(lián)的透明質(zhì)酸組合物10只中有3只，與之相比，用實(shí)施例9及10的透明質(zhì)酸凝膠組合物的防粘連材料10只中形成粘連的為0只，揭示它具有優(yōu)良的防粘連作用。
雖然所有小鼠都能正常生育，但組織狀態(tài)以實(shí)施例9與10的透明質(zhì)酸凝膠組合物的防粘連材料以及以比較例4的透明質(zhì)酸組合物的防粘連材料埋入的小鼠局部組織狀態(tài)未見異常，而以比較例5所得氰尿酰氯交聯(lián)的透明質(zhì)酸組合物埋入，發(fā)現(xiàn)組織有輕微炎癥。
實(shí)施例12將透明質(zhì)酸鈉(分子量2×105道爾頓)溶于蒸餾水，濃度為1質(zhì)量％，用1mol/L硝酸調(diào)節(jié)水溶液的pH至1.5。另外，將25℃時(shí)1％粘度為150～250mPa·s的羧甲基纖維素鈉(醚化值0.62～0.68，換算分子量1.28×105～1.35×105道爾頓，第一工業(yè)制藥制)溶于蒸餾水，濃度為1質(zhì)量％，用1mol/L硝酸調(diào)整如此配制的水溶液的pH為1.5。將兩種酸性水溶液混合，體積比為50∶1，將混合液100ml置容器(面積16cm×16cm)中，放入設(shè)定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置3日后，于25℃解凍，得海綿狀的透明質(zhì)酸/羧甲基纖維素凝膠組合物。再將所得凝膠組合物用雙蒸餾水置換過剩的酸溶液后，用100mmol/L的磷酸緩沖的生理鹽水洗滌3次，使其完全中和。中和后，將凝膠在室溫晾干，得HA/CMA凝膠膜。
實(shí)施例13將透明質(zhì)酸鈉(分子量2×105道爾頓)溶于蒸餾水使?jié)舛葹?質(zhì)量％，用1N硝酸調(diào)整水溶液的pH至1.5。另外，取25℃時(shí)1％粘度為150～250mPa·s的羧甲基纖維素鈉(醚化值0.62～0.68、換算分子量為1.28×105～1.35×105道爾頓、第一工業(yè)制藥制)溶于蒸餾水，使?jié)舛葹?質(zhì)量％，這樣配制的水溶液的pH以1mol/L硝酸調(diào)整至1.5。兩種酸性水溶液以2∶1的體積比混合，將混合液100ml倒入容器(面積16cm×16cm)，置于設(shè)定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置3日后，于25℃解凍，得海綿狀的透明質(zhì)酸/羧甲基纖維素凝膠組合物。再用雙蒸餾水置換過量的酸溶液后，用100mmol/L的磷酸緩沖生理鹽水洗滌所得的凝膠組合物3次，使其完全中和。中和后，凝膠于室溫晾干，得HA/CMC凝膠膜。
實(shí)施例14將透明質(zhì)酸鈉(分子量2×105道爾頓)溶于蒸餾水使?jié)舛葹?質(zhì)量％，用1mol/L硝酸將水溶液的pH調(diào)整至1.5。另外，取25℃時(shí)1％粘度為150～250mPa·s的羧甲基纖維素鈉(醚化值0.62～0.68，換算分子量為1.28×105～1.35×105道爾頓，第一工業(yè)制藥制)溶于蒸餾水，使?jié)舛葹?質(zhì)量％，這樣配制的水溶液的pH用1mol/L硝酸調(diào)整至1.5。兩種酸性水溶液以1∶1的體積比混合，將混合液100ml倒入容器(面積16cm×16cm)，置于設(shè)定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置3日后，于25℃解凍，得海綿狀的透明質(zhì)酸/羧甲基纖維素凝膠組合物。再用雙蒸餾水置換過量的酸溶液后，用100mmol/L的磷酸緩沖生理鹽水洗滌所得的凝膠組合物3次，使其完全中和。中和后，凝膠于室溫晾干，得HA/CMC凝膠膜。
實(shí)施例15將透明質(zhì)酸鈉(分子量2×105道爾頓)溶于蒸餾水使?jié)舛葹?質(zhì)量％，用1mol/L硝酸將水溶液的pH調(diào)整至1.5。另外，取25℃時(shí)1％粘度為150～250mPa·s的羧甲基纖維素鈉(醚化值0.62～0.68，換算量為1.28×105～1.35×105道爾頓，第一工業(yè)制藥制)溶于蒸餾水，使?jié)舛葹?質(zhì)量％，這樣配制的水溶液的pH用1mol/L硝酸調(diào)整至1.5。兩種酸性水溶液以1∶2的體積比混合，將混合液100ml倒入容器(面積16cm×16cm)，置于設(shè)定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置3日后，于25℃解凍，得海綿狀的透明質(zhì)酸/羧甲基纖維素凝膠組合物。再用雙蒸餾水置換過量的酸溶液后，用100mmol/L的磷酸緩沖生理鹽水洗滌所得的凝膠組合物3次，使其完全中和。中和后，凝膠于室溫晾干，得HA/CMC凝膠膜。
實(shí)施例16將透明質(zhì)酸鈉(分子量2×105道爾頓)溶于蒸餾水使?jié)舛葹?質(zhì)量％，用1mol/L硝酸將水溶液的pH調(diào)整至1.5。另外，取25℃時(shí)1％粘度為150～250mPa·s的羧甲基纖維素鈉(醚化值0.62～0.68，換算分子量為1.28×105～1.35×105道爾頓，第一工業(yè)制藥制)溶于蒸餾水，使?jié)舛葹?質(zhì)量％，這樣配制的水溶液的pH用1mol/L硝酸調(diào)整至1.5。兩種酸性水溶液以50∶1的體積比混合，將混合液100ml倒入容器(面積16cm×16cm)，置于設(shè)定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置3日后，于25℃解凍，得海綿狀的透明質(zhì)酸/羧甲基纖維素凝膠組合物。再用雙蒸餾水置換過量的酸溶液后，用100mmol/L的磷酸緩沖生理鹽水洗滌所得的凝膠組合物3次，使其完全中和。中和后，將凝膠凍結(jié)，得HA/CMC凝膠片。
實(shí)施例17將透明質(zhì)酸鈉(分子量2×105道爾頓)溶于蒸餾水使?jié)舛葹?質(zhì)量％，用1mol/L硝酸將水溶液的pH調(diào)整至1.5。另外，取25℃時(shí)1％粘度為150～250mPa·s的羧甲基纖維素鈉(醚化值0.62～0.68，換算分子量為1.28×105～1.35×105道爾頓，第一工業(yè)制藥制)溶于蒸餾水，使?jié)舛葹?質(zhì)量％，這樣配制的水溶液的pH用1mol/L硝酸調(diào)整至1.5。兩種酸性水溶液以2∶1的體積比混合，將混合液100ml倒入容器(面積16cm×16cm)，置于設(shè)定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置3日后，于25℃解凍，得海綿狀的透明質(zhì)酸/羧甲基纖維素凝膠組合物。再用雙蒸餾水置換過量的酸溶液后，用100mmol/L的磷酸緩沖生理鹽水洗滌所得的凝膠組合物3次，使其完全中和。中和后，將凝膠凍結(jié)，得HA/CMC凝膠片。
實(shí)施例18將透明質(zhì)酸鈉(分子量2×105道爾頓)溶于蒸餾水使?jié)舛葹?質(zhì)量％，用1mol/L硝酸將水溶液的pH調(diào)整至1.5。另外，取25℃時(shí)1％粘度為150～250mPa·s的羧甲基纖維素鈉(醚化值0.62～0.68，換算分子量為1.28×105～1.35×105道爾頓，第一工業(yè)制藥制)溶于蒸餾水，使?jié)舛葹?質(zhì)量％，這樣配制的水溶液的pH用1mol/L硝酸調(diào)整至1.5。兩種酸性水溶液以1∶1的體積比混合，將混合液100ml倒入容器(面積16cm×16cm)，置于設(shè)定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置3日后，于25℃解凍，得海綿狀的透明質(zhì)酸/羧甲基纖維素凝膠組合物。再用雙蒸餾水置換過量的酸溶液后，用100mmol/L的磷酸緩沖生理鹽水洗滌所得的凝膠組合物3次，使其完全中和。中和后，將凝膠凍結(jié)，得HA/CMC凝膠片。
實(shí)施例19將透明質(zhì)酸鈉(分子量2×105道爾頓)溶于蒸餾水使?jié)舛葹?質(zhì)量％，用1mol/L硝酸將水溶液的pH調(diào)整至1.5。另外，取25℃時(shí)1％粘度為150～250mPa·s的羧甲基纖維素鈉(醚化值0.62～0.68，換算分子量為1.28×105～1.35×105道爾頓，第一工業(yè)制藥制)溶于蒸餾水，使?jié)舛葹?質(zhì)量％，這樣配制的水溶液的pH用1N硝酸調(diào)整至1.5。兩種酸性水溶液以1∶2的體積比混合，將混合液100ml倒入容器(面積16cm×16cm)，置于設(shè)定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置3日后，于25℃解凍，得海綿狀的透明質(zhì)酸/羧甲基纖維素凝膠組合物。再用雙蒸餾水置換過量的酸溶液后，用100mmol/L的磷酸緩沖生理鹽水洗滌所得的凝膠組合物3次，使其完全中和。中和后，將凝膠凍結(jié)，得HA/CMC凝膠片。
實(shí)施例20透明質(zhì)酸/羧甲基纖維素凝膠組合物的溶解性試驗(yàn)在生理鹽水中加磷酸緩沖成分，濃度為50mmol/L，調(diào)整磷酸緩沖的生理鹽水至pH7.4。相對上述實(shí)施例11～18所得所得的干重為50mg的凝膠組合物，按磷酸緩沖的生理鹽水為50ml的比例，用磷酸緩沖的生理鹽水浸漬。
從磷酸緩沖的生理鹽水中的透明質(zhì)酸濃度求得37℃時(shí)在磷酸緩沖的生理鹽水中溶出的透明質(zhì)酸與羧甲基纖維素的比例。
由此可從上述試驗(yàn)確定在37℃中性水溶液中透明質(zhì)酸凝膠組合物的溶解性。
透明質(zhì)酸與羧甲基纖維素濃度的測定磷酸緩沖的生理鹽水中的透明質(zhì)酸，通過添加NaOH溶液使凝膠完全分解后用透明質(zhì)酸酶進(jìn)行處理。然后，分析樣品經(jīng)0.45μm的濾器過濾后用GPC測定。根據(jù)示差折光檢測器算出的透明質(zhì)酸洗脫峰的峰面積，求出透明質(zhì)酸和羧甲基纖維素的濃度。透明質(zhì)酸因酶分解而分子量降低，故其峰可能與高分子量的羧甲基纖維素相分離。
按上面所述，具體對實(shí)施例12～19的透明質(zhì)酸凝膠組合物進(jìn)行了溶解性試驗(yàn)。其結(jié)果如表5、6所示。
表5透明質(zhì)酸凝膠的溶解性(pH7)

表6透明質(zhì)酸凝膠的溶解性(pH8)

由表5、6可見，凝膠組合物不管組成比如何，通過凝膠化可使透明質(zhì)酸、羧甲基纖維素兩者均難以溶出。
實(shí)施例21透明質(zhì)酸凝膠組合物的細(xì)胞毒性試驗(yàn)來自正常人皮膚的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物與本發(fā)明所得的透明質(zhì)酸凝膠組合物在非接觸狀態(tài)下共存，觀察細(xì)胞增殖情況，評價(jià)其細(xì)胞毒性。將以實(shí)施例12～19的方法制作的凝膠組合物用機(jī)械粉碎，取20mg置于ファルコン公司制的細(xì)胞培養(yǎng)墊(孔徑3μm)中，浸入接種有細(xì)胞的培養(yǎng)基。將在透明質(zhì)酸凝膠組合物非共存時(shí)的培養(yǎng)物作為對照組。
培養(yǎng)條件平板細(xì)胞培養(yǎng)用12孔平板培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)基+10％胎牛血清，2ml/孔溫度37℃(5％CO2下)接種細(xì)胞數(shù)1×104個(gè)/孔培養(yǎng)開始2日、5日和8日后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞密度，即使凝膠組合物共存也與對照組同樣良好地增殖，確認(rèn)本發(fā)明所得凝膠組合物沒有細(xì)胞毒性作用。
實(shí)施例22大鼠盲腸擦傷模型的防粘連試驗(yàn)大鼠(SD，Messer，9周齡以上)下肢肌注麻醉劑麻醉后，仰臥位固定以聚乙烯吡咯酮碘消毒腹部皮膚后剪毛。沿大鼠腹肌正中線開腹，用包有紗布的攪棒接觸盲腸部分擦過。在擦過部分放上以透明質(zhì)酸組合物作原料制成的膜狀防粘連材料，將盲腸放回原來部位縫合。另外，不用防粘連材料處置，而把盲腸放回的大鼠作為對照組。這樣處置，包括對照組的各實(shí)驗(yàn)組每組用10只大鼠。術(shù)后一周解剖，判定有無粘連形成。粘連形成的判定，系將膜狀的極輕度的粘連不判定為粘連，而將發(fā)生纖維狀、厚的用小鑷子拉也不易剝離的強(qiáng)烈粘連的情況判定為粘連。其結(jié)果如表7所示。
仍將比較例4、5及實(shí)施例14～16制造的組合物200mg/g1cm2作為試驗(yàn)片，用上述方法評價(jià)了作為防粘連材料的效果。
表7透明質(zhì)酸凝膠防粘連試驗(yàn)

根據(jù)表7，無處理組粘連形成的比例為10只中有9只，僅將透明質(zhì)酸混合液于中性凍結(jié)而得到的透明質(zhì)酸組合物10只中有7只，以氰尿酰氯交聯(lián)的透明質(zhì)酸組合物10只中有4只，與此比較，用實(shí)施例8的透明質(zhì)酸凝膠組合物的防粘連材料10只中為3只以下，提示有優(yōu)良的防粘連作用。
至于組織的狀態(tài)，在埋入實(shí)施例14～16的透明質(zhì)酸凝膠組合物防粘連材料和比較例4的透明質(zhì)酸組合物防粘連材料的局部組織其狀態(tài)未見異常，而比較例5所得的氰尿酰氯交聯(lián)的透明質(zhì)酸組合物，其組織見輕度炎癥。
實(shí)施例23凝膠創(chuàng)口復(fù)蓋材料在大鼠皮膚缺損模型中的創(chuàng)傷治療效果試驗(yàn)取7周齡(約200g)的Wistar系雌性大鼠，背部剃毛，于乙醚麻醉下用眼科剪于背部皮膚除去直徑2cm的圓片，制作皮膚完全缺損的創(chuàng)口。設(shè)置無處理組，僅用醫(yī)用無紡布(40×40mm2塊重疊)包裹，而處理組，則用比較例4、5及實(shí)施例14制成的組合物(30×30mm)復(fù)蓋創(chuàng)面后，用醫(yī)用無紡布(40×40mm，2塊重疊)包裹。每組用6只大鼠。醫(yī)用無紡紗布用粘合繃帶設(shè)定，再用膠帶固定。
通過測定創(chuàng)口面積隨時(shí)間的變化而進(jìn)行治療效果的比較。即用下式求出與最初創(chuàng)口面積的面積比，檢測其隨時(shí)間的變化。
結(jié)果如表8所示。

表8透明質(zhì)酸凝膠的創(chuàng)口愈合效果試驗(yàn)

由表8可知，難溶于水的透明質(zhì)酸凝膠片能增強(qiáng)創(chuàng)口治療效果。
實(shí)施例24將分子量2×106道爾頓的透明質(zhì)酸鈉溶于水，濃度為0.5質(zhì)量％。用1mol/L鹽酸調(diào)整pH至調(diào)整后的水溶液pH為1.5，將酸性水溶液15ml倒入30nl玻璃瓶中，置于設(shè)定溫度為-20℃的冷凍庫中。放置5日后，于25℃解凍，將所得的海綿狀透明質(zhì)酸凝膠用微量勻漿器(Polytoron，Kinematica AG制)粉碎，得破碎的透明質(zhì)酸凝膠。在羧甲基纖維素鈉(和光純藥制)溶于蒸餾水形成的1.0質(zhì)量％的溶液中，使破碎的透明質(zhì)酸凝膠擴(kuò)散，形成2.0質(zhì)量％的濃度，取此溶液25ml置于帶9cm角的塑料制培養(yǎng)皿中自然干燥。結(jié)果得到膜狀的透明質(zhì)酸凝膠組合物。
實(shí)施例25與實(shí)施例1同樣得到破碎的透明質(zhì)酸凝膠。然后在聚乙烯醇(聚合度1500、和光純藥制)溶于蒸餾水的1.0質(zhì)量％的溶液中，使破碎的透明質(zhì)酸凝膠擴(kuò)散，形成2.0質(zhì)量％的濃度，取此溶液25ml置帶9cm角的塑料制培養(yǎng)皿中自然干燥。結(jié)果得到膜狀的透明質(zhì)酸凝膠組合物。
實(shí)施例26與實(shí)施例1同樣制得破碎的透明質(zhì)酸凝膠。然后在明膠(フナコシ公司制)溶于蒸餾水成1.0質(zhì)量％濃度的溶液中，使破碎的透明質(zhì)酸凝膠擴(kuò)散，形成2.0質(zhì)量％的濃度，取此溶液25ml置帶9cm角的塑料制培養(yǎng)皿中自然干燥。結(jié)果得膜狀的透明質(zhì)酸凝膠組合物。
實(shí)施例27與實(shí)施例1同樣制得破碎的透明質(zhì)酸凝膠。然后在硫酸軟骨素(和光純藥劑)溶于蒸餾水形成的1.0質(zhì)量％濃度的溶液中，使破碎的透明質(zhì)酸凝膠擴(kuò)散，形成2.0質(zhì)量％的濃度，取此溶液25ml置帶9cm角的塑料制培養(yǎng)皿中自然干燥。結(jié)果得膜狀的透明質(zhì)酸凝膠組合物。
比較例6與實(shí)施例1同樣制得破碎的透明質(zhì)酸凝膠。然后將所得的破碎的透明質(zhì)酸凝膠在蒸餾水中擴(kuò)散，形成3.0質(zhì)量％，取此溶液25ml置帶9cm角的塑料制培養(yǎng)皿中自然干燥。結(jié)果得膜狀的透明質(zhì)酸凝膠。
實(shí)施例28透明質(zhì)酸凝膠組合物的干燥強(qiáng)度試驗(yàn)用島圖制作所制的EZ-TEST測定上述實(shí)施例24～27、比較例6的膜狀透明質(zhì)酸凝膠組合物及透明質(zhì)酸凝膠的干燥拉伸強(qiáng)度。各樣品剪成1cm×5cm的長方形，滑塊間距30mm，以10mm/分的速度拉伸，測定破裂時(shí)的最大應(yīng)力。
結(jié)果如表9所示?？梢妼?shí)施例24～27的透明質(zhì)酸凝膠組合物的膜破裂時(shí)所加重量比比較例6的僅含透明質(zhì)酸凝膠的膜的干燥強(qiáng)度大大提高。
表9透明質(zhì)酸凝膠組合物的干燥強(qiáng)度

實(shí)施例29透明質(zhì)酸凝膠組合物的組織粘合性試驗(yàn)用島圖制作所制的EZ-TEST測定上述實(shí)施例24～27、比較例6的膜狀透明質(zhì)凝膠組合物及透明質(zhì)酸凝膠的組織粘合性。
各樣品剪成1cm×1cm的正方形，裝在滑塊上，測定與作為組織的無皮雞肉剝離時(shí)的應(yīng)力。各樣品與組織以0.01kg/cm2的壓力接觸30秒后，測定滑塊以1mm/分速度拉伸剝離時(shí)的最大應(yīng)力。
其結(jié)果如表10。
表10透明質(zhì)酸凝膠組合物的組織粘合性

由表10可見，實(shí)施例24～27的透明質(zhì)酸凝膠組合物的膜斷裂時(shí)的加重與比較例6的透明質(zhì)酸凝膠膜的數(shù)值比較，明顯較好。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性根據(jù)上述的本發(fā)明，不使用任何化學(xué)交聯(lián)劑和化學(xué)修飾劑，能從透明質(zhì)酸和高分子化合物簡單地配制透明質(zhì)酸凝膠組合物。而且這種透明質(zhì)酸凝膠組合物能增強(qiáng)單用透明質(zhì)酸所形成的凝膠的各種物性，提供機(jī)體相容性更好的可用于醫(yī)療領(lǐng)域的醫(yī)用材料。
權(quán)利要求
1.一種透明質(zhì)酸凝膠組合物，其特征為包含透明質(zhì)酸和高分子化合物，基本上未經(jīng)化學(xué)交聯(lián)劑或化學(xué)修飾劑修飾，且浸入37℃中性水溶液中12小時(shí)透明質(zhì)酸的溶出率在50％以下。
2.如權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸凝膠組合物，其中高分子化合物為羧甲基纖維素。
3.透明質(zhì)酸凝膠組合物的制造方法，其特征為將含有透明質(zhì)酸及高分子化合物的pH3.5以下的水溶液或分散液凍結(jié)、然后解凍而形成透明質(zhì)酸凝膠組合物。
4.透明質(zhì)酸凝膠組合物的制造方法，其特征為將含有透明質(zhì)酸的pH3.5以下的水溶液凍結(jié)、然后解凍而形成的透明質(zhì)酸凝膠與高分子化合物或高分子化合物凝膠混合，而形成透明質(zhì)酸凝膠組合物。
5.如權(quán)利要求3或4所述的透明質(zhì)酸凝膠組合物的制造方法，其中高分子化合物是選自多糖類、蛋白質(zhì)、核酸類及合成高分子化合物的一種以上化合物。
6.如權(quán)利要求3或4所述的透明質(zhì)酸凝膠組合物的制造方法，其中高分子化合物為羧甲基纖維素。
7.醫(yī)用材料，其特征為含有權(quán)利要求1或2所述的透明質(zhì)酸凝膠組合物。
8.醫(yī)用材料，其特征為含有以選自γ射線、電子射線、等離子體或EOG中的一種對透明質(zhì)酸凝膠組合物照射或注入而得到的透明質(zhì)酸凝膠組合物。
9.如權(quán)利要求7所述的醫(yī)用材料，其中醫(yī)用材料為防止粘連的材料。
10.如權(quán)利要求7所述的醫(yī)用材料，其中醫(yī)用材料為復(fù)蓋創(chuàng)口的材料。
全文摘要
一種透明質(zhì)酸凝膠組合物,其特征為包含透明質(zhì)酸和高分子化合物,基本上未經(jīng)化學(xué)交聯(lián)劑或化學(xué)修飾劑修飾,且浸入37℃中性水溶液中12小時(shí)透明質(zhì)酸的溶出百分率為50%或更低。
文檔編號(hào)A61L27/52GK1340080SQ00803894
公開日2002年3月13日 申請日期2000年2月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月19日
發(fā)明者橋本正道, 梅田俊彥, 宮田喜明, 山本修, 姬田康一, 新井一彥 申請人:電氣化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社