專利名稱：一種新型質體定向核酸序列,一種新型β－淀粉酶序列,一種刺激響應型啟動子及其用途的制作方法
雖然分離并鑒定了被推測與淀粉在植物中合成和降解相關的多種酶，但該過程的確切機制尚不明了。
在白天，淀粉在葉片的葉綠體中積累，而在夜間被用于滿足植物能量和生物合成的需要。對這種被稱為瞬時淀粉轉運的模式尚不完全了解，但必然與合成或降解酶活性的協(xié)同調控作用相關。在葉片組織中，主要的降解途徑被認為與磷酸分解和水解活性，特別是α-葡糖醛酸酶(E.C.3.2.1.3)相關(Nielson和Stitt,1997)。
淀粉還在諸如種子、果實和塊莖的儲存器官的造粉體中積累。在這種情況下，淀粉能儲存較長時間，并且淀粉的轉運伴隨著儲存器官組織的降解和淀粉分解和磷酸分解活性的加強。不過，有證據(jù)表明，淀粉的轉化也發(fā)生于儲存器官的造粉體中(Sweetlove等，1996)。這一過程同樣需要合成和降解酶活性的協(xié)同調控作用。
葉綠體和造粉體都源于前質體，因此，除了分別是葉片和儲存器官中淀粉合成的部位外，還具有很多共同的特征。葉綠體還可以轉化成造粉體和其他類型的質體(Thomson和Whatley,1980)。
淀粉是兩種多糖的混合物，直鏈淀粉是通過α-1,4-糖苷鍵連接在一起的糖基單位的線性鏈；而支鏈淀粉是由許多α-1,4-葡聚糖的線性鏈組成，這些線性鏈通過α-1,6-糖苷鍵連接在一起。
參與淀粉合成的酶有ADPG焦磷酸化酶(E.C.2.7.7.21)，淀粉合成酶(E.C.2.4.1.21)以及分支酶(E.C.2.4.1.18)。ADPG焦磷酸化酶負責提供底物ADPG，該分子起著葡萄糖單體供體的作用，這些單體通過淀粉合成酶(α-1,4鍵)和分支酶(α-1,6鍵)的轉化作用連接在一起。
人們認為，淀粉粒的不溶性的晶體結構是通過伸長的螺旋型、分支的支鏈淀粉分子的緊密堆積而形成的，由線性直鏈淀粉分子填充所有空間。
業(yè)已報導了多種淀粉降解酶活性，包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，異淀粉酶(E.C.3.2.1.68),β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2),α-葡糖酸苷酶(E.C.3.2.1.3)，淀粉磷酸化酶(E.C.2.4.1.1)和歧化酶(E.C.2.4.1.25)。所述酶的多種活性以多種形式存在于植物中，并且某些形式被認為與淀粉的合成相關。所有的酶都可能在某種程度上參與淀粉的轉運過程，不過，其確切的作用和可能的相互作用尚未確定。通過其中兩種酶的活性，可以最好地說明確定不同酶的作用的難度，這兩種酶被認為在淀粉降解過程中起主要作用淀粉磷酸化酶和淀粉酶。
淀粉磷酸化酶能催化α-1,4-葡聚糖可逆地釋放葡萄糖-1-磷酸。在植物組織中存在兩種形式的淀粉磷酸化酶Pho1或L-型，位于質體的里面，并對麥芽糖糊精具有高的親和力；Pho2或H-型，存在于胞質中，并對諸如糖原的大的，高度分支的葡聚糖具有高的親和力。盡管質體Pho1酶有可能是參與淀粉轉運的一種酶，但對葉片酶活性的反義抑制，在轉基因馬鈴薯的葉片中對淀粉積累沒有影響(Sonnewald等，1995)。在另一項研究中，對胞質Pho2的反義抑制，能對轉基因馬鈴薯塊莖的發(fā)芽行為產(chǎn)生影響，但對淀粉積累和降解沒有影響(Duwenig等，1997)。
有兩種主要類型的淀粉酶都能水解直鏈淀粉和支鏈淀粉中的α-1,4-葡糖苷鍵α-淀粉酶隨機地作用于非末端鍵，而β-淀粉酶從葡聚糖鏈的非還原端開始起作用釋放麥芽糖單元。α-淀粉酶在植物細胞的質外體間隙中的亞細胞定位，被認為反映了這種酶正常分泌的事實。不過，在諸如水稻(Chen等，1994)和甜菜(Li等，1992)的多種植物中，所述酶還定位于葉綠體和造粉體內部，盡管有關位于多種α-淀粉酶蛋白氨基末端的信號序列的發(fā)現(xiàn)是蛋白通過ER膜而不是質體膜轉運的特征(Chen等，1994)。在一項研究中，將水稻α-淀粉酶基因的啟動子和信號序列與細菌GUS基因融合，并用農桿菌屬介導的轉化導入水稻、煙草和馬鈴薯(Chan等，1994)。業(yè)已證實，所表達的GUS融合蛋白首先被轉運到內質網(wǎng)中，然后外泌到由轉基因細胞組成的懸浮培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中。業(yè)已在多項研究中證實，α-淀粉酶能降解天然淀粉分子。
相反，體外研究業(yè)已證實，在不事先用其他酶消化淀粉粒的情況下，β-淀粉酶不能降解天然淀粉粒。缺乏活性β-淀粉酶或僅含有微量活性的黑麥(Daussant等，1981)和大豆(Hildebrand和Hymowitz，1981)突變體分別明顯地表現(xiàn)出正常的生長和發(fā)育。另外，在β-淀粉酶的含量業(yè)已大大降低的轉基因擬南芥屬植物中，未表現(xiàn)出嚴重的生長缺陷(Mita等，1997)。確定β-淀粉酶在植物中的確切生理學作用的努力由于尚無有關亞細胞定位的確定資料而受到妨礙。盡管有一項研究報導在豌豆葉綠體中存在兩種β-淀粉酶(Kakefuda,1986)，但涉及諸如蠶豆、大麥、小麥、大豆、甘薯和豌豆等物種的大部分研究得出的結論是，大部分(如果不是全部的話)β-淀粉酶活性存在于葉綠體外(Nakamura等，1991)。這一觀點得到了以下事實的支持即迄今所克隆的所有β-淀粉酶基因都編碼缺乏氨基末端葉綠體轉運肽序列的蛋白。
在谷類作物中，業(yè)已披露了三種類型的β-淀粉酶一種在穎果成熟期間積累的胚乳特異形式；一種在發(fā)芽期間在水稻和玉米的糊粉細胞中從頭合成的形式(Wang等，1996)；以及一種普遍存在于營養(yǎng)器官中的β-淀粉酶。在擬南芥屬中，所述普遍存在的形式占蓮座葉的總淀粉降解活性的大約80％。與迄今為止業(yè)已克隆的所有其他β-淀粉酶基因相同，編碼所述遍在擬南芥屬β-淀粉酶的基因不能編碼具有亞細胞定向信號的蛋白，因此，這種酶有可能定位于細胞質中。
在多項研究中的發(fā)現(xiàn)是驚人的即消除所述降解活性對植物的生活力沒有不利影響，并且淀粉降解酶的亞細胞定位位于質體外面。即預期的β-淀粉酶活性的主要最終產(chǎn)物，即麥芽糖是在分離的葉綠體中做為淀粉降解產(chǎn)物被鑒定的(Peavey等，1977)，這一事實使明顯缺乏質體定位的β-淀粉酶活性更加令人驚異。最近，業(yè)已證實葡萄糖和麥芽糖是在淀粉轉運過程中從分離的花椰菜花芽造粉體中分泌出來的(Neuhaus等，1995)。
利用葉片或儲存器官的質體生產(chǎn)大量淀粉的能力，對利用植物淀粉的多種工業(yè)方法來說具有很高價值，例如，為了提高馬鈴薯塊莖中的淀粉含量，以前業(yè)已證實當大腸桿菌ADPG PPase glgC16在轉基因馬鈴薯塊莖中超量表達時，流向淀粉的碳流通量增加，但淀粉的凈積累量只有很少的增加(Sweetlove等，1997)。分析超量表達品系中的酶活性證實，除了ADPG PPase的改變之外，淀粉酶，特別是β-淀粉酶的活性也有所改變。這一結果表明，在超量表達glgC16蛋白的塊莖中，淀粉的積累受到新合成淀粉降解的抑制，即淀粉得到轉化。
在另一個例子中，在麥芽糖化過程中淀粉的可利用性與植物中，特別是儲存器官中降解酶活性的類型和數(shù)量密切相關。作物的所述降解能力的增強，將使得谷物的麥芽糖化或來自塊莖或其他儲存器官的淀粉向醇的轉化更加有效和產(chǎn)量更高。
存在于儲存器官中的淀粉的類型取決于存在的ADPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶、分支酶和降解酶的活性和形式。各種酶之間的相互作用也很重要。
在植物中產(chǎn)生新型淀粉具有重要價值，因為這可以降低在被用于諸如食品、紙張、藥品、膠體、油類和織物的多種行業(yè)之前對淀粉進行加工和改性的成本。下面的例子證實了淀粉水解活性在體內改變淀粉結構方面的重要性。
業(yè)已在玉米種子中證實，sugaryl突變能導致脫支酶的缺乏，這種酶能水解淀粉的α-1,6-糖基鍵(James等，1995)。該突變會導致支鏈淀粉的濃度降低和高度分支的葡聚多糖、植物糖原的積累。
業(yè)已在豌豆中證實，由麥芽糖開始連續(xù)添加葡萄糖單位直到形成麥芽七糖的短的寡聚糖分子能特異性刺激顆粒結合淀粉合成酶Ⅰ(GBSSI)的活性(Denyer等，1996)。這種酶被普遍認為是淀粉合成的主要酶(例如，van der Leij等，1991；Hylton等，1995；Ainsworth等，1993)。通過控制麥芽糖-寡聚糖的供應控制GBSSI活性，是一份新專利(WO97/16554)的主題，并且該專利提示，通過導入降解酶，即α-淀粉酶、β-淀粉酶、歧化酶、脫支酶和淀粉磷酸化酶，可以導致麥芽糖-寡聚糖濃度的提高，并因此提高淀粉中直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例。專利WO97/16554還聲稱已經(jīng)克隆了編碼所述酶的質體異構型基因。不過，如上文所述，迄今為止所分離的β-淀粉酶基因沒有一個能編碼具有蛋白定向序列的β-淀粉酶，另外，α-淀粉酶最初是否是導向質體還存在疑問(Chen等，1994；Chan等，1994)。在WO97/16554的隨后的內容中，提到了對合適的β-淀粉酶cDNA序列進行工程操作，以便添加質體定向序列。
除了儲存器官中淀粉的工業(yè)利用之外，葉片中淀粉的含量對作物的農藝學具有重要價值。淀粉是白天在葉片中由在光合作用期間固定的碳合成的。淀粉被儲存在葉綠體中，并且在夜間降解，成為植物新陳代謝的能源和中介物。目前，尚不了解控制所述源-庫關系的機制，不過，已經(jīng)清楚，控制葉片質體中淀粉的含量和可利用度對植物產(chǎn)量(生物量和產(chǎn)量)具有明顯影響。
對于以葉片作為主要農產(chǎn)品的作物來說，例如煙草，葉片中的淀粉含量也很重要。已知淀粉含量對于吸煙時最終的煙草味道具有影響。提供控制煙草葉片中淀粉含量的方法對于煙草行業(yè)具有重要價值。
在本發(fā)明中我們首次披露了編碼新型β-淀粉酶的cDNA的分離，這種酶通過一種新型定向序列導向質體(因此被稱為葉綠體定向(ct)β-淀粉酶)。這種完整編碼序列的分離是令人吃驚的，因為一般認為，一旦較小的葡聚糖片段通過轉運或通過膜的降解從質體釋放到細胞質中，β-淀粉酶僅參與淀粉的水解。所述酶在質體中的定位產(chǎn)生了不可預見的可能性，即ctβ-淀粉酶參與葉綠體中瞬時淀粉的降解和造粉體中淀粉的儲存。
葉綠體和造粉體之間特征的相似性(Thomson和Whatley,1980)與本發(fā)明相關，因為業(yè)已證實，來自葉綠體定向多肽的轉運肽可能將異源多肽輸入造粉體，反之亦然。例如，來自玉米顆粒結合淀粉合成酶的轉運肽在與大腸桿菌β-葡糖醛酸酶(GUS)蛋白融合之后，不僅能將GUS蛋白輸入造粉體，而且能輸入葉綠體(Klosgen和Weil,1991)。
另外，我們證實ct-Bmy基因在擬南芥屬中的表達以及ct-Bmy啟動子GUS融合體在轉基因煙草中的表達可以通過光照和蔗糖分別進行調控?？紤]到擬南芥屬的ATβ-Amy的光照和糖誘導的密切相關性，這一發(fā)現(xiàn)是驚人的(Mita等，1995)。
本發(fā)明提供了在本文中被稱為序列1的核酸序列，它含有1-294個核苷酸，并具有一個能將另一種編碼序列定向至植物質體的序列，或者是與所披露的序列1的序列具有至少65％或更高同源性并具有相同的導向能力的序列。
所述核酸序列優(yōu)選編碼大約94，更優(yōu)選大約85個氨基酸殘基。
本發(fā)明還提供了一種在本文中被稱作序列2的核酸序列，它含有1-1642個核苷酸，并具有一個能編碼β-淀粉酶的序列，或者是與序列2中所披露的序列具有至少65％或更高同源性并具有相同的編碼能力的序列。
本發(fā)明還提供了一種在本文中被稱作序列3的核酸序列，它含有1-1953個核苷酸，并具有一個能編碼葉綠體定向β-淀粉酶的序列，或者是與序列3中所披露的序列具有至少65％或更高同源性并具有相同的編碼能力的序列。
同源序列還包括在中等嚴格條件(在65℃下，在2×SSC中洗滌)下能與序列1、序列2或序列3雜交的序列。
所述核酸序列優(yōu)選是mRNA或cDNA序列，不過，它也可以是基因組DNA。
本發(fā)明還提供了一種提高或降低植物中淀粉生物合成或降解途徑上的一種酶的活性的方法，該方法包括以下步驟將包括編碼質體定向序列的核酸序列和淀粉生物合成或降解途徑中一種酶的編碼序列的嵌合基因穩(wěn)定地整合到植物基因組中，以及再生具有改變了的基因組的植物。
本發(fā)明還提供了一種將蛋白或酶引導到植物質體中的方法，該方法包括以下步驟將包括編碼質體定向序列的核酸序列和一種蛋白或酶的編碼序列的嵌合基因穩(wěn)定地整合到植物基因組中，以及再生具有改變了的基因組的植物，所述蛋白或酶可以是下列一組途徑中的一種或多種脂類合成，光合作用，氨基酸代謝，固氮，固碳或碳水化合物聚合物的合成；或者能夠賦予所述植物一種特征，該特征選自下列一組中的一種或多種除草劑抗性和抗蟲性，例如，包括真菌、細菌或病毒抗性。
本發(fā)明還提供了一種具有嵌合基因的植物，該嵌合基因包括一個啟動子、一個編碼質體定向序列的核酸編碼序列，該序列能夠將淀粉生物合成或降解途徑上的一種酶的編碼序列引導到植物質體中，以及一個終止子。
本發(fā)明還提供了一種能夠指導由可操作地與它相連的編碼序列編碼的產(chǎn)物表達的核酸序列，所述核酸序列在本文中被稱作序列8，或者與序列8具有至少65％的同源性并具有大體上與它相同的功能，并且所述核酸序列對刺激可產(chǎn)生反應，所述產(chǎn)物的表達水平根據(jù)作用于所述核酸序列上的刺激而變化。
本發(fā)明還提供了一種改變由一種編碼序列編碼的產(chǎn)物的表達水平的方法，該編碼序列可操作地連接于能在植物中指導所述產(chǎn)物表達的核酸序列上，所述方法包括以下步驟將一種嵌合基因穩(wěn)定地整合到植物基因組上，該嵌合基因包括能夠指導由可操作地與它相連的編碼序列編碼的產(chǎn)物表達水平的核酸序列，所述核酸序列具有大體上與序列8相同的序列或者與該序列具有至少65％的同源性并具有大體上與它相同的功能，并且對刺激有反應。
所述刺激優(yōu)選是光照的存在或缺乏和/或糖含量水平的改變。另外，所述刺激是通過發(fā)育控制的刺激。
理想的糖是蔗糖或葡萄糖中的一種或多種。
優(yōu)選的糖是蔗糖。
理想的是，所述誘導型啟動子或能夠在植物中指導所述產(chǎn)物表達的核酸序列是在遮光但有糖的條件下或者是在無糖但有光的條件下能夠操縱的。所述遮光但有糖的植物組織可以是地下器官或儲存器官。例如，地下器官可以是塊莖、根莖或根，而其他儲存器官可以是幼葉或種子。
所述無糖但有光的植物組織可以是較老的葉片(其中沒有被轉運的糖)、花部分或發(fā)芽的種子。
具有上述DNA結構特征的結構和嵌合基因也是本發(fā)明的方面。
含有包括編碼上述質體定向序列的核酸序列和淀粉生物合成或降解途徑上的一種酶的核酸編碼序列的嵌合基因，或包括能夠指導另一種編碼序列表達的核酸序列的嵌合基因，或包括上述對刺激有反應的核酸序列或一種編碼序列的嵌合基因(所述編碼序列的表達水平可以根據(jù)作用于所述核酸序列上的刺激而改變)的植物細胞也是本發(fā)明的一個方面，含有本發(fā)明的一種或多種嵌合基因的轉化植物的種子也是本發(fā)明的一個方面。
優(yōu)選地，所述質體定向序列是序列1。
在本發(fā)明的第一方面，上述方法可用于改變葉片的代謝，以便淀粉在葉片中積累或者從葉片中轉運出去，這一過程能夠從總體上改變植物內的源-庫關系。這一目的可以通過將所述定向序列和淀粉生物合成或降解途徑上的一種酶的核酸編碼序列置于合適的啟動子指導之下而實現(xiàn)。合適啟動子的選擇，會導致得到葉片中淀粉含量升高或降低的植物，這種植物可用于諸如煙草行業(yè)中；或者通過改變植物的源-庫關系，導致在各種其他植物組織中淀粉產(chǎn)量的改變，所述組織如塊莖、果實和根。
在本發(fā)明的該實施方案中，一種合適的啟動子可以在整個植株中指導所述質體定向序列和所述淀粉生物合成或降解途徑上的一種酶的編碼序列的表達，即所謂的組成型表達，或者特限于葉片中表達。這種改變具有重要影響，使得植物的淀粉含量和/或器官產(chǎn)量得到明顯的改變。
一種能夠在所有植物組織中指導表達的優(yōu)選的啟動子是來自花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子。對于葉片表達來說，優(yōu)選的啟動子可來自編碼核酮糖二磷酸羧化酶小亞基的基因或豌豆質體蘭素基因。本領域技術人員會認可用于組成型表達和葉片特異表達的其他合適的啟動子，如分別是胭脂氨酸合酶啟動子和葉綠素a/b結合蛋白啟動子。
所述淀粉生物合成或降解途徑上的酶的編碼序列或其部分可以沿正常閱讀框方向，即有義方向排列，或者沿反閱讀框方向，即反義方向排列。通過有義、反義或共抑制技術(后者是由DNAP在其歐洲專利申請?zhí)?465572和0647715中披露的)實現(xiàn)的所述酶在植物中活性的上調或下調，可用于實現(xiàn)植物淀粉的改變。
在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明的方法還可用于改變儲存器官中淀粉的代謝，以便提高淀粉的含量和/或根據(jù)特定工業(yè)方法的目的以合適的形式提供淀粉。所述方法包括造紙；制藥，織物、染料和建筑制品；提供烘烤、乳制品和點心類食品；生產(chǎn)罐裝、干燥或即食食品；谷物的麥芽糖化和生產(chǎn)糖漿和醇。
在本發(fā)明的第一或第二方面，被選擇用于所述方法中的嵌合基因可以是來自淀粉降解途徑的酶，即淀粉降解酶。優(yōu)選地，所述嵌合基因包括葉綠體定向的β-淀粉酶(以下稱之為ctβ-淀粉酶)，更優(yōu)選地包括源于擬南芥的ctβ-淀粉酶(以下稱之為At ctβ-淀粉酶)，參見序列3。還可以使用可能源于諸如馬鈴薯、煙草、小麥、玉米和大麥的其他植物來源的與At ctβ-淀粉酶同源的序列。通過雜交或聚合酶鏈式反應(PCR)技術進行的標準克隆方法，可用于從所述生物中分離序列例如，分子克隆技術，如由Sambrook等(1989)披露的技術和由Innes等(1990)披露的PCR技術。適用于所述質體定向序列的其他淀粉降解酶、一種或多種所述酶的編碼序列包括α-淀粉酶、歧化酶、脫支酶、淀粉磷酸化酶、α-葡糖苷酶和非質體β-淀粉酶。
在本發(fā)明的方法的第二方面，可以選擇在植物的儲存器官中指導表達的優(yōu)選啟動子，例如，源于下列基因的啟動子編碼小麥胚乳的高分子量麥谷蛋白的基因；編碼小麥胚乳的α-,β-麥醇溶蛋白的基因；編碼大麥胚乳的大麥醇溶蛋白的基因；或編碼馬鈴薯塊莖的patatin的基因。其他合適的啟動子為本領域技術人員所熟知。
在本發(fā)明任一方面，組織代謝的改變或淀粉類型或特征的改變可以通過刺激反應產(chǎn)生，也就是可誘導，即利用本文所披露的誘導型啟動子誘導(序列8)。例如，所述誘導型啟動子的光誘導性特征可用于通過誘導諸如芽孢桿菌RNA酶的基因(如在專利WO98/10081中所述)，通過影響花粉發(fā)育或影響在諸如果實成熟或種子發(fā)芽的其他光依賴性過程中的非光反應基因控制結實。所述光誘導型啟動子還可用于啟動影響在葉片中產(chǎn)生刺激代謝產(chǎn)物，例如產(chǎn)生生物堿的基因。光誘導型啟動子還可用于在葉片或其他光合組織中控制淀粉生物合成酶基因，或者在從諸如暗處的儲存點取出塊莖后啟動基因。所述誘導型啟動子的糖誘導性特征可用于調控諸如發(fā)育中的塊莖或其他非光合組織中的基因，如抗蟲害基因和/或能夠影響作物收獲后品質的基因。對于馬鈴薯來說，枯萎病、黑脛病和干腐病抗性基因是特別有利的，并且最好是克隆到與糖誘導型啟動子的重組基因上。另外，所述誘導型啟動子的糖誘導性特征可用于在組織培養(yǎng)過程中啟動選擇標記的基因的表達。
本領域技術人員通過使用眾所周知的技術，如缺失研究，可以很方便地從序列8中找出糖誘導型效應因子和/或光誘導型效應因子。Pwee和Gray(1993)用一種標記基因在豌豆質體蘭素基因上進行了這樣的缺失研究，以便確定其操縱區(qū)。
本文所披露的方法或者在諸如由Sambrook等(1989)和Gelvin和Stanton(1995)在實驗室手冊中所披露的用于克隆基因序列并將其插入合適的載體(載體或質粒等)的方法，是將所述概念付諸實施的本領域技術人員眾所周知的技術。嵌合基因或上述基因可以單獨導入，或者與一種或多種其他嵌合基因一起導入，如一種或多種上述的其他基因。在使用編碼淀粉降解途徑的一種酶的第一種嵌合基因的上述實施方案中，所述第二種嵌合基因可以包括(舉例來說)一個編碼來自淀粉生物合成途徑的酶的核酸序列，該序列同樣受合適的啟動子和合適的終止子的指導。第二種嵌合基因的啟動子和/或終止子可以與第一種嵌合基因的啟動子和/或終止子相同或不同。編碼淀粉生物合成途徑中的酶的合適的序列，是編碼蔗糖合成酶、ADPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶的核酸序列，并可以包括編碼分支酶、α-淀粉酶、異淀粉酶、非質體β-淀粉酶、α-葡糖苷酶、淀粉磷酸化酶和歧化酶的核酸序列。
業(yè)已披露了用于將一種以上的嵌合基因導入植物中的方法，該方法包括構建一種二元載體，將所述嵌合基因連接在一個核酸分子上；用兩種或兩種以上不同的農桿菌屬細胞，例如，用含有不同嵌合基因的不同的二元載體進行共轉化；或者用第二種不同的嵌合基因轉化已經(jīng)具有一種嵌合基因的植物，即再轉化。在后一種情況下，在導入第二種嵌合基因之后，篩選轉基因植物的方法必須與用于導入第一種嵌合基因的篩選方法不同。合適的選擇標記包括潮霉素、卡那霉素、氨磺酰和Basta抗性。還可以使用諸如讓各自含有一種嵌合基因的兩種植物雜交的生物學方法。
還可將兩種嵌合基因結構用于改變已經(jīng)轉化過的植物的淀粉含量，這種植物表現(xiàn)出第一種酶活性的明顯增強，以及在淀粉合成方面的后續(xù)改變。
因此，本發(fā)明還提供了一種用于改變一種轉基因植物中另一種酶的方法，所述轉基因植物已經(jīng)表現(xiàn)出由于遺傳轉化而導致的一種酶活性的提高或降低，以便上調或下調所述另一種酶，并因此增加或減少由所述再轉化植物產(chǎn)生的淀粉的數(shù)量。
有利的是，所述第一種轉化植物具有較強的淀粉生物合成途徑中的酶活性。試圖提高植物淀粉含量的一個例子是用編碼ADPG-PPase的基因，例如glgC16轉化過的轉基因馬鈴薯(例如，參見WO91/19806)。在這種植物中淀粉含量的提高比較小。所述第一種轉化植物優(yōu)選用編碼淀粉降解酶的嵌合基因進行再次轉化。該嵌合基因優(yōu)選包括諸如At ctβ-淀粉酶，glgC16蛋白是在第一種轉化的塊莖中表達的，并導致ADPG-PPase活性的提高，以及流向淀粉的碳流量的增加。理想的是，所述嵌合的At ctβ-淀粉酶基因或其部分在再轉化塊莖中的表達，會導致ctβ-淀粉酶活性的下調，即共抑制或反義技術，由此導致淀粉積累的增加。
優(yōu)選的是，所述第二種酶的表達是定向于塊莖的。指導At ctβ-淀粉酶嵌合基因在塊莖中表達的合適的啟動子，是來自編碼patatin基因的啟動子。
表達glg16的第一種轉化馬鈴薯植物具卡那霉素抗性，因此，At ctβ-淀粉酶嵌合基因的二元載體結構攜帶一種不同的抗性基因，例如，優(yōu)選氨磺?？剐曰?。增加馬鈴薯塊莖中淀粉的產(chǎn)量將是有利的，例如，對于薯片生產(chǎn)商來說，馬鈴薯干物質每增加1％，會導致增產(chǎn)4％。
薯片生產(chǎn)還被用于說明本發(fā)明的另一個優(yōu)點。當馬鈴薯在低于8℃的溫度下儲存時，會積累由淀粉降解所產(chǎn)生的還原糖、葡萄糖和果糖。在將馬鈴薯炸成薯片時，所述還原糖在Maillard反應中與氨基酸反應產(chǎn)生褐色，并破壞產(chǎn)品的口味。將能終止淀粉降解，并因此終止還原糖積累的嵌合基因導入馬鈴薯植物，對于食品工業(yè)來說將是有利的。所述嵌合基因優(yōu)選在一種共抑制或反義結構中包括編碼ctβ-淀粉酶的編碼序列或該序列的一部分，該序列是由一種合適的啟動子和終止子驅動的。合適的啟動子來自馬鈴薯塊莖中編碼patatin的基因。理想的是，上面提到的任一種其他淀粉降解酶都可用于取代ctβ-淀粉酶。
如果需要在發(fā)育的葉片和發(fā)育的塊莖中進行協(xié)同表達的話，序列8的誘導型啟動子也可用于所述結構中，因為patatin啟動子也是蔗糖誘導型的(Rocha-Sosa等，1989)。類似地，序列1所示的編碼葉綠體定向多肽的序列還可與其他基因一起使用，所述其他基因缺乏其本身的定向序列，并且必須向質體導向。
上述例子可用來說明使用本發(fā)明的可能的優(yōu)點。本領域技術人員可以理解的是，將基因和可以采用本發(fā)明的植物進行組合具有重要意義。
基因組合優(yōu)選包括ctβ-淀粉酶與編碼蔗糖合成酶、ADPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶、分支酶、α-淀粉酶、異淀粉酶、非質體β-淀粉酶、α-葡糖苷酶、淀粉磷酸化酶和歧化酶的一種或多種基因的組合，所述基因的序列為本領域技術人員所熟知，另外，來自ctβ-淀粉酶的定向序列可用于上述一種或多種基因。
可以轉化的植物優(yōu)選包括馬鈴薯、小麥、玉米、大麥、番茄、水稻、豌豆、大豆、花生、木薯、大薯、香蕉和煙草。
下面將結合用于從擬南芥中分離編碼ctβ-淀粉酶的cDNA并將該cDNA整合到煙草和馬鈴薯植物中的實施方案，通過舉例形式對本發(fā)明進行說明。還給出了刺激響應啟動子及其在轉基因植物中的活性的例子。
為了便于實施本發(fā)明，下面將通過舉例形式對下面的示意圖進行說明，其中

圖1表示通過熒光顯像所獲得的SDS-PAGE凝膠上的體外輸入翻譯產(chǎn)物的放射標記結果。圖例分子量標記(泳道M)；翻譯產(chǎn)物(泳道Tr)；在輸入培養(yǎng)之后再分離的和嗜熱菌蛋白酶處理過的葉綠體(泳道C)；基質級份(泳道S)；洗滌的類囊體(泳道T)；嗜熱菌蛋白酶處理過的類囊體(泳道tT)；內包膜級份(泳道I)；外包膜級份(泳道O)。β-淀粉酶的推測前體(P)，中間體(I)和成熟(M)形式。千道爾頓(K)；圖2表示光照與光照和糖對ctβ-淀粉酶轉錄物在擬南芥幼苗中表達的影響。圖2a表示生長在土壤中的5周齡擬南芥屬植物總RNA的Northern印跡分析，對所述植物進行以下處理2天連續(xù)光照(L),2天連續(xù)遮光(D),2之后進行3天連續(xù)光照(LL)或2天遮光之后接著進行3天光照(DL)。圖2b表示體外生長的5周齡擬南芥屬植物總RNA的Northern印跡分析，將所述植物轉移到水中，并進行3天連續(xù)光照(WL)；或轉移到5％的蔗糖中并進行3天遮光(SD)或3天連續(xù)光照(SL)；或轉移到5％葡萄糖溶液中并進行3天遮光(GD)或3天連續(xù)光照(GL)。Northern印跡與放射性標記的ct-Bmy cDNA插入片段雜交，并進行放射自顯影(上圖)。在下面圖中示出了相應的溴化乙錠染色的甲醛瓊脂糖凝膠。
圖3表示在下面的例3中構建的嵌合的ctβ-淀粉酶啟動子-GUS基因的T-DNA的示意圖，其中，NosP表示胭脂氨酸合成酶啟動子；NosT表示胭脂氨酸合成酶終止子；BR是pBI101的T-DNA的右臂反向重復序列，BL是左臂反向重復序列；NPTⅡ表示新霉素磷酸轉移酶Ⅱ編碼序列；GUS表示β-葡糖醛酸酶編碼序列。ctβ-淀粉酶啟動子片段通過劃斜線的矩形表示；PCR擴增的Xho Ⅰ-Bam HⅠ連接片段用黑色的矩形表示。
圖4表示光照和蔗糖對由ct Bmy啟動子-GUS嵌合基因在煙草幼苗中表達的GUS活性的影響；圖5表示供體載體pDV35S(SK)V的質粒圖譜；圖6表示供體載體pDV02000的質粒圖譜；圖7表示二元質粒pBNP10431的質粒圖譜，其中，35Sp表示CaMV 35S啟動子，ct bamy表示完整長度的ctβ-淀粉酶cDNA,35St表示CaMV35S終止子，RB表示二元載體pBinPlus的右臂，colEori表示colEl的細菌復制起點，Rkori表示RK2質粒的oriV復制起點，nptⅢ表示編碼細菌卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉移酶基因，LB表示所述二元載體的左臂序列，而kan表示植物對卡那霉素的抗性所需要的新霉素磷酸轉移酶重組基因；圖8表示二元質粒pBNP10432的質粒圖譜，其中的縮略語含義與圖7相同；圖9表示二元質粒pBNP02431的質粒圖譜，其中的縮略語含義與圖7相同，所不同的是，patp表示源于圖6中載體pDV02000的patatin Ⅰ型啟動子，而nost表示胭脂氨酸合成酶終止子；和圖10表示二元質粒pBNP02432的質粒圖譜，其中的縮略語含義與圖9相同。
在序列表中序列1是能夠將一種編碼序列定向到植物質體，特別是葉綠體的核酸；序列2是編碼β-淀粉酶的核酸；序列3是葉綠體定向(ct)β-淀粉酶的完整序列；序列4和5是用于例3的擴增方法中的引物；序列6和7是用于例4的擴增方法中的引物；和序列8是對刺激有反應，特別是對光照和/或糖有反應的核酸。
例1分離并鑒定擬南芥葉綠體定向的β-淀粉酶測定pBmy81中cDNA插入片段的序列對粘粒G16599(Bevan等，1998)上的37kb擬南芥屬染色體Ⅳ DNA片段的核苷酸進行BLASTN數(shù)據(jù)庫檢索，發(fā)現(xiàn)了與擬南芥屬、大麥、玉米、水稻、大豆和水稻的葉綠體外β-淀粉酶具有明顯同源性的基因。該檢索還證實了若干3’末端EST序列，其中的一個序列EST81E10T7(Newman等，1995)，以下稱為pBmy81，在大約300個核苷酸上相同?？寺ST81E10T7是由擬南芥屬生物資源中心(ABRC)DNA資源中心(俄亥俄大學，美國)提供的。將跨越pBmy81上的cDNA插入片段的Bal31的嵌套缺失亞克隆用作雙鏈PCR循環(huán)測序反應的DNA模板，該反應使用熒光染料標記的通用引物。在應用生物系統(tǒng)373A型自動測序儀上分析測序反應物。pBmy81上的cDNA插入核苷酸序列在序列3中示出。由先進技術(劍橋)有限公司(劍橋科學園210號，英國劍橋CB4 4WA)根據(jù)國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約的規(guī)定，將結構pBmy81保藏在國立工業(yè)和海洋細菌保藏有限公司(NCIMB)，圣。馬卡大街23號，亞伯丁，蘇格蘭，保藏日為1998年8月4日，保藏號為NCIMB40964。
鑒定推測的葉綠體定向信號pBmy81c DNA插入片段包括位于5’末端的36個非翻譯核苷酸，一個編碼具有548個氨基酸的蛋白的開放讀框(ORF)，以及一個232bp的3’末端非翻譯區(qū)(UTR)。由pBmy81c DNA插入片段編碼的蛋白具有61kDa的預測分子量，并與源于玉米、水稻、大麥、大豆和甘薯的植物葉綠體外β-淀粉酶有高度的氨基酸相似性。不過，由pBmy81編碼的蛋白與迄今為止所報導的所有其他β-淀粉酶的不同之處在于，它含有葉綠體定向信號所特有的獨特的N-末端延伸加工，即高含量的絲氨酸(16％)，蘇氨酸(10％)和帶正電荷的氨基酸殘基(15％)(Baier和Dietz,1997)。在該信號序列上鑒定了作為葉綠體定向信號的區(qū)別特征的3個結構域(Schatz和Dobberstein,1996)一個不帶電荷的氨基末端域；一個富含羥化氨基酸的中央域；以及一個具有形成兩親性β-鏈的潛力的羧基末端域。
pBmy81上的cDNA插入片段編碼一種葉綠體定向β-淀粉酶用Percoll分級梯度從50-60克豌豆芽(Pisum sativum L.varFeltham First)中分離完整的葉綠體。按照Mould和Gray的方法(1997a)生長植物材料并分離葉綠體。
通過用NotⅠ進行限制性消化將pBmy81質粒線性化，并用T7 RNA聚合酶進行體外轉錄。在小麥胚乳翻譯系統(tǒng)中合成放射性標記過的前體蛋白。該系統(tǒng)包括來自pBmy81 cDNA的轉錄物的35S-甲硫氨酸和35S-半胱氨酸，所用方法大體如Mould和Gray所述(1997b)。
按照Mould和Gray的方法(1997b)輸入放射性標記過的體外翻譯產(chǎn)物。在輸入培養(yǎng)之后，用嗜熱菌蛋白酶(在輸入緩沖液中的最終濃度為0.2mg/ml)在冰上處理完整的葉綠體30分鐘，然后通過添加EDTA使其在輸入緩沖液中的濃度達到50mM，終止所述蛋白酶反應。通過用輸入緩沖液制備的40％的Percoll緩沖液層再次分離葉綠體，然后在輸入緩沖液中洗滌(Mould和Gray,1997b)。取1等份(1/10)的嗜熱菌蛋白酶處理過的葉綠體樣品，進行分析，其余的樣品大體上按Schnell和Blobel所述方法(1993)進行分離。通過SDS-PAGE對嗜熱菌蛋白酶處理過的葉綠體樣品、基質級份、類囊體和嗜熱菌蛋白酶處理過的類囊體進行定量，然后進行考馬斯蘭染色，并對染色的蛋白帶進行掃描密度測定(用核酮糖二磷酸羧化酶和集光復合蛋白的亞基作為標準物)。通過在有SDS的條件下在10％聚丙烯酰胺凝膠上電泳然后進行熒光顯像分析等量的所述級份(大體上相當于從Percoll梯度中回收的葉綠體的2％)，和回收的505內部和外部包膜級份。結果(圖1)表明，主要的翻譯產(chǎn)物(泳道Tr)大約為58kDa。當分離的完整豌豆葉綠體與放射標記過的蛋白一起在有ATP的條件下培養(yǎng)時，產(chǎn)生了大約50kDa和48kDa的多肽(泳道C)。所述多肽對外源添加的嗜熱菌蛋白酶的降解作用的抗性表明，它們是放射性標記蛋白輸入的產(chǎn)物。將完整的嗜熱菌蛋白酶處理過的葉綠體分解為基質、洗滌過的類囊體、嗜熱菌蛋白酶處理過的類囊體、內部包膜和外部包膜，證實以上兩種放射性標記多肽存在于基質級份中。
例2擬南芥ctβ-淀粉酶基因的蔗糖和光誘導為了證實光照對ctβ-淀粉酶的誘導，將擬南芥Landsberg生態(tài)型植物種植在溫室中，采用18小時的光照和6小時的遮光方案，溫度為18℃。5周以后，將兩盆幼苗轉移到完全遮光中，并讓兩盆幼苗在連續(xù)光照下生長。兩天以后，將一盆遮光馴化的幼苗和一盆光照生長的幼苗用于分離總RNA，并將每一種處理的另一盆進行3天連續(xù)光照。
為了進行組合的蔗糖-光照-遮光處理，對Landsberg生態(tài)型的種子進行表面消毒，放置在含有1％蔗糖的MS瓊脂培養(yǎng)基上，并在培養(yǎng)室中生長，采用18小時光照和6小時遮光的方案。將5周齡幼苗轉移到消毒蒸餾水或5％蔗糖或葡萄糖的水溶液中。將所述幼苗在連續(xù)光照或遮光中保持3天。用每一種試驗的幼苗制備總RNA，并通過Eggermont等所述方法(1996)進行Northern印跡分析。用凝膠純化的pBmy81上的cDNA插入片段檢測Northern印跡，然后按照Feinberg和Vogelstein所述方法(1983)用32P-dCTP進行隨機標記。
圖2A中所示結果表明，ctβ-淀粉酶基因轉錄物受光照的誘導。
圖2B所示結果表明，ctβ-淀粉酶基因轉錄物在遮光中受到5％蔗糖的誘導，受5％葡萄糖誘導的程度較低。在光照條件下，在有糖的情況下這種誘導得到進一步加強。以上結果表明，光照和糖的作用是相互獨立的。
例3構建ctβ-淀粉酶啟動子-GUS融合體通過限制酶消化從位于粘粒G16599(Bevan等，1998)上的ctβ-淀粉酶基因上分離啟動子片段。該啟動子上的常見限制位點是位于-1662bp核苷酸位點上的Hind Ⅲ(始于序列8負鏈上的19179bp)，位于-1127bp的SalⅠ和位于-371bp的PstⅠ，以及位于ctβ-淀粉酶起始甲硫氨酸下游+21bp位置上的XhoⅠ，將這些位點用于分離三種不同長度的啟動子和轉錄物肽序列(翻譯起始甲硫氨酸ATG中的A的編碼號是+1)。
用以下寡核苷酸引物擴增位于粘粒G16599(Bevan等，1998)上的ctβ-淀粉酶基因的294bp(序列1)片段序列4P1:(5’-AAT TCC TCG AGT TCT CTT ATC-3’)和序列5P2:(5’-cgg gAT CCC TGA CAT TGT TAC-3’)。
在引物P1中，在下面劃線的堿基表示位于+21bp位置上的XhoⅠ位點；在引物P2中，小寫堿基表示為了產(chǎn)生Bam HⅠ位點而添加的核苷酸。
嵌合的ctβ-淀粉酶啟動子-GUS基因是通過所述啟動子片段、用XhoⅠ和Bam HⅠ消化過的PCR連接片段、和用Hind Ⅲ-Bam HⅠ、SalI-Bam HⅠ或PstⅠ-Bam HⅠ消化過的GUS載體pBI101(Jefferson等，1987)三重連接產(chǎn)生的(圖3)。所得到的結構分別被稱為HβGUS、SβGUS和PβGUS。
通過三親交配(Bevan,1984)將所述嵌合基因結構轉入根癌農桿菌LBA4404中，并通過葉片轉化方法(Horsch等，1985)將其導入煙草Samsun品種。
煙草幼苗中嵌合的擬南芥ctβ-淀粉酶啟動子-GUS基因的蔗糖和光照誘導將表達高水平GUS活性的含有HβGUS和PβGUS結構的植物和該品系的F1幼苗后代用于研究所述嵌合基因的光照和蔗糖誘導表達。對F1煙草種子進行表面消毒，放在含有1％蔗糖的MS瓊脂培養(yǎng)基上，并在培養(yǎng)室中生長，采用18小時光照、6小時遮光的方案。將2-3周齡幼苗轉移到5％蔗糖溶液或轉移到蒸餾水中，并在連續(xù)光照或遮光條件下保持3天。用Jefferson等(1987)所述的方法使用生熒光底物4-甲基傘形基-葡糖醛酸苷(4-MUG)分析來自10-14個幼苗的總蛋白提取物的GUS活性。對于這兩種結構來說，在缺乏蔗糖的條件下接受連續(xù)光照的幼苗中GUS活性的水平與在缺乏光照的條件下接受蔗糖處理的幼苗中的GUS活性水平相似(圖4)。不過，讓幼苗同時接受連續(xù)光照和蔗糖處理能將GUS活性提高大約2-3倍。以上結果總體上與用ctβ-淀粉酶基因本身進行試驗所獲得的結果吻合，該試驗顯示光誘導和蔗糖誘導是獨立的過程。
GUS的組織化學染色表明，該活性是在2周齡幼苗的子葉中檢測到的，而在第一真葉和莖和根中的活性很少或沒有。在4周齡幼苗中，在第一真葉和莖中都檢測到額外的GUS活性。GUS染色特別與位于木射線之間和位于木質部和構成莖的內部韌皮部的韌皮束之間的富含葉綠體的薄壁組織(綠色組織)細胞相關。
例4構建用于轉化煙草和馬鈴薯葉片的ctβ-淀粉酶質粒通過定向誘變將位于pBmy81質粒的2302bp位置上的KpnⅠ位點轉化成Bam HⅠ位點。設計寡核苷酸引物序列6P3:(5’-GCT GGT ACG CCT GCA GGA TCC GGT CCG GAA TTC CC-3’)和序列7P4:(5’-GGG AAT TCC GGA CCG GAT CCT GCA GGC GTA CCA GC-3’)并與快速改變定向誘變試劑盒(Promega)一起使用。方法如生產(chǎn)商所述。
通過用Bam HⅠ裂解突變的pBmy81質粒將完整長度的ctβ-淀粉酶編碼序列切除，然后用GeneClean(BIO101)純化。將所述Bam HⅠ片段連接到供體載體pDV35S(SK)V(參見圖5)和pDV02000(參見圖6)的Bam HⅠ位點上。pDV35S(SK)V由攜帶35S CaMV啟動子-35S終止子的pBluescript(Stratagene)組成，類似的結構在本領域中是公知的(例如，Odell等，1985)。pDV02000由具有1.4kbp patatin啟動子-胭脂氨酸合成酶終止子的pBluescript組成。本領域技術人員可以用已知序列制備類似的結構(例如，Liu等，1990)。分離具有相對所述啟動子為有義方向和反義方向的編碼序列的質粒，并將來自所述供體載體的ctβ-淀粉酶嵌合基因亞克隆到二元載體pBinPlus上(vanEngelen等，1995)。質粒的圖譜如圖7-10所示。
例5植物的轉化或再轉化用大體上如Horsch所述的葉片共培養(yǎng)方法(1985)轉化馬鈴薯植物。通過電穿孔方法將上述二元載體轉入根癌農桿菌LBA4404中，并將所述農桿菌的培養(yǎng)物用于轉化，以便再生攜帶所述嵌合基因的植物，如例4中所述。
可以通過葉片共培養(yǎng)方法用所述patatin啟動子-ctβ-淀粉酶-胭脂氨酸合成酶終止子嵌合基因二元質粒轉化已經(jīng)攜帶編碼大腸桿菌ADPG-Ppase glgC16的嵌合基因的馬鈴薯植物。
例6構建具有ATctβ-淀粉酶定向肽的質粒AT ctβ-淀粉酶的質體定向序列包括在相當于序列1的294bp片段上。可以通過PCR擴增或限制酶消化從例3所述的質粒中分離DNA片段，即該片段將包括35S CaMV啟動子+質體定向序列或patatin啟動子+質體定向序列。可以通過連接作為翻譯融合體的蛋白或酶與轉運肽序列的編碼序列構建嵌合基因。翻譯的蛋白將被轉運到質體中，以便提供新的活性或影響代謝途徑。
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序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人(A)名稱先進技術(劍橋)有限公司(B)街道Globe House,1 Water Street(C)城市倫敦(E)國家英格蘭(F)郵編WC2R 3LA(ⅱ)發(fā)明名稱一種新型質體定向核酸序列，一種新型β-淀粉酶序列，一種刺激響應型啟動子及其用途(ⅲ)序列數(shù)8(ⅳ)聯(lián)系地址(A)收件人英美煙草(投資)有限公司(B)街道Regents Park Road(C)城市Southampton(D)州Hampshire(E)國家英格蘭(F)郵編SO15 8TL(ⅴ)計算機可讀形式(A)媒體類型3.50寸盤(B)計算機Viglen P5/75(C)操作系統(tǒng)MS-DOS視窗95(D)軟件微軟Word97(ⅵ)當前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)栁粗?C)分類號未知(ⅷ)律師/代理人資料(A)姓名M.R.Walford女士/K.J.H.MacLean先生(C)文件號RD-ATC-18(ⅸ)通訊資料(A)電話01703 777155(B)傳真01703 779856(2)序列1資料(ⅰ)序列特征(A)長度294個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙(D)拓撲結構線形(ⅱ)分子類型從cDNA到mRNA(ⅵ)來源(A)生物擬南芥(B)品系哥倫比亞生態(tài)型(C)組織類型葉(ⅶ)直接來源；(A)文庫ABRC DNA資源中心(B)克隆EST 81E10T7(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體/片段4號染色體(ⅸ)特征(A)名稱轉運肽(B)位置37-291bp(ⅹⅰ)序列描述序列11TCATTTCTCATCATAACAAAGAGAGAGAAAAAAACTATGGAATTGACACTGAATTCCTCGM E L T L N S S 861AGTTCTCTTATCAAACGTAAAGATGCCAAGAGTTCTAGAAACCAAGAAAGTTCCTCCAACS S L I K R K D A K S S R N Q E S S S N 28121 AACATGACCTTTGCGAAGATGAAGCCGCCAACATATCAGTTCCAAGCAAAGAACTCGGTTN M T F A K M K P P T Y Q F Q A K N S V 48181 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V L S Y P H S K N D A S V P V 88301 TTCGTCATGTTACCGCTCGACACAGTAACAATGTCAGGGCATTTGAACAAACCACGAGCCF V M L P L D T V T M S G H L N K P R A 108361 ATGAACGCTAGTTTGATGGCTCTGAAAGGAGCTGGTGTGGAAGGTGTGATGGTGGATGCTM N A S L M A L K G A G V E G V M V D A 128421 TGGTGGGGATTGGTGGAGAAAGATGGACCTATGAATTATAACTGGGAAGGCTATGCCGAGW W G L V E K D G P M N Y N W E G Y A E 148481 CTTATACAGATGGTTCAAAAGCACGGTCTCAAACTCCAGGTCGTTATGTCATTCCATCAAL I Q M V Q K H G L K L Q V V M S F H Q 168541 TGTGGAGGAAACGTAGGAGACTCTTGCAGTATCCCCTTGCCTCCATGGGTGCTTGAAGAGC G G N V G D S C S I P L P P W V L E E 188601 ATCAGCAAGAACCCTGATCTTGTCTACACAGACAAATCTGGGAGAAGGAACCCTGAATATI S K N P D L V Y T D K S G R R N P E Y 208661 ATCTCCTTGGGATGTGATTCTGTGCCTGTCCTAAGAGGAAGAACACCTATCCAGGTCTACI S L G C D S V P V L R G R T P I Q V Y 228721 TCAGATTTCATGAGGAGCTTCCGTGAACGATTTGAAGGCTACATAGGAGGAGTTATTGCGS D F M R S F R E R F E G Y I G G V I A 248781 GAAATTCAAGTAGGAATGGGACCTTGTGGAGAATTGAGATACCCATCATACCCTGAAAGCE I Q V G M G P C G E L R Y P S Y P E S 268841 AACGGGACCTGGAGATTCCCCGGAATTGGAGAGTTCCAGTGCTACGACAAGTATATGAAAN G T W R F P G I G E F Q C Y D K Y M K 288901 TCGTCACTTCAGGCATATGCTGAATCAATTGGGAAAACTAACTGGGGAACAAGCGGACCTS S L Q A Y A E S I G K T N W G T S G P 308961 CATGATGCCGGCGAGTACAAGAACCTCCCAGAAGATACTGAATTTTTCAGGAGAGACGGAH D A G E Y K N L P E D T E F F R R D G 3281021 ACATGGAATAGCGAGTATGGAAAGTTTTTCATGGAATGGTACTCCGGGAAGCTGCTAGAAT W N S E Y G K F F M E W Y S G K L L E 3481081 CATGGAGACCAACTCCTATCTTCAGCGAAAGGTATCTTTCAAGGAAGCGGAGCAAAGCTAH G D Q L L S S A K G I F Q G S G A K L 3681141 TCAGGAAAGGTAGCTGGAATTCACTGGCACTACAACACCAGGTCACACGCAGCTGAGCTAS G K V A G I H W H Y N T R S H A A E L 3881201 ACCGCTGGATATTACAACACAAGAAACCATGACGGGTATCTGCCAATAGCTAAGATGTTCT A G Y Y N T R N H D G Y L P I A K M F 4081261 AACAAACATGGAGTTGTGCTCAACTTCACCTGCATGGAGATGAAAGACGGGGAGCAACCTN K H G V V L N F T C M E M K D G E Q P 4281321 GAGCACGCGAATTGCTCACCAGAAGGTCTGGTCAAGCAAGTACAGAACGCGACAAGGCAGE H A N C S P E G L V K Q V Q N A T R Q 4481381 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GCTGAATACA1351 CATGTAAATG AGAATTTATT AACTAAAACA TCTTCCTTTG TAACTGATGT1401 GACATTTACA ATTTTTCATT TTGAGGTGTA AGAACCGTGT GACAAGTGAA1451 AAGGTTAAAA TAAGCAACCT TTGTGATATT TTCTCTCCAC TTTTTGAAAT1501 TGGGTCTCCA AACCACAGCC AATCAATATT CTTTATAAAT ACAAACACAC1551 AAACAGCATC TTTCTCTCAA ACACAAACAT ATCTTCTATC AAACACCAAC1601 AGCTCTATTC TCTACCTCAT TTCTCATCAT AACAAAGAGA GAGAAAAAAA1651 CT
權利要求
1．一種在本發(fā)明中被稱為序列1，并且含有1-294個核苷酸，并且在它上面具有能夠將另一種編碼序列定向到植物質體的核酸序列，或者是與序列1所示序列具有至少65％或更高的同源性并且具有相同的定向能力的序列。
2．如權利要求1的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼大約94個氨基酸殘基。
3．如權利要求2的核酸序列，其中，所述序列編碼大約85個氨基酸殘基。
4．一種在本發(fā)明中被稱為序列2，并且含有1-1642個核苷酸，并且在它上面具有一個能夠編碼β-淀粉酶的序列的核酸序列，或者是與序列2所示序列具有至少65％或更高的同源性并且具有相同的編碼能力的序列。
5．一種在本發(fā)明中被稱為序列3，并且含有1-1953個核苷酸，并且在它上面具有一個能夠編碼葉綠體定向β-淀粉酶的序列的核酸序列，或者是與序列3所示序列具有至少65％或更高的同源性并且具有相同的編碼能力的序列。
6．一種能夠指導由一種編碼序列編碼的產(chǎn)物表達的核酸序列，該編碼序列可操作地與所述核酸序列連接，所述核酸序列在本發(fā)明中被稱為序列8，或者是與它具有至少65％的同源性并具有大體上相同的功能的序列，所述核酸序列對刺激有反應，所述產(chǎn)物的表達水平根據(jù)作用在所述核酸序列上的刺激而變化。
7．如上述任一項權利要求的核酸序列，其中，所述核酸序列是mRNA、cDNA或基因組DNA序列。
8．一種提高或降低植物中淀粉生物合成或降解途徑上的一種酶的活性的方法，該方法包括以下步驟將一種包括編碼質體定向序列的核酸序列和所述淀粉生物合成或降解途徑上的一種酶的編碼序列的嵌合基因穩(wěn)定地整合到植物基因組上，以及再生具有改變了的基因組的植物。
9．如權利要求8的方法，其中，所述核酸序列包括權利要求1的序列。
10．如權利要求8的方法，其中，所述淀粉降解途徑上的酶是β-淀粉酶。
11．如權利要求8、9或10的方法，其中，所述編碼序列是權利要求4的核酸序列，它是淀粉降解途徑上一種酶的編碼序列。
12．如權利要求8的方法，其中，所述核酸序列是權利要求5的核酸序列。
13．如權利要求8-12中任一項的方法，其中，所述來自淀粉生物合成途徑上的酶是下列一組酶的一種蔗糖合成酶、ADPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶、分支酶、α-淀粉酶、異淀粉酶、非質體β-淀粉酶、α-葡糖酸苷酶、淀粉磷酸化酶和歧化酶。
14．一種將蛋白或酶定向到植物質體的方法，該方法包括以下步驟將包括編碼質體定向序列的核酸序列和一種蛋白或酶的編碼序列的嵌合基因穩(wěn)定地整合到植物基因組上，并再生具有改變了的基因組的植物，所述蛋白或酶是下列一組途徑中的一種或多種脂類合成、光合作用、氨基酸代謝、固氮、固碳或糖類聚合物的合成；或者能夠賦予植物一種特征，所述核酸序列是權利要求1的核酸序列。
15．如權利要求14的方法，其中，所述特征選自下列一組的一種或多種除草劑抗性和抗蟲性。
16．一種改變植物中由一種編碼序列編碼的產(chǎn)物的表達水平的方法，所述編碼序列可操作地連接于能夠指導所述產(chǎn)物表達的核酸序列上，所述方法包括以下步驟將包括一種能夠指導由可操作地連接在它上面的編碼序列編碼的產(chǎn)物表達的核酸序列的嵌合基因穩(wěn)定地整合到植物基因組上，所述核酸序列大體上具有序列8的序列，或者與序列8具有至少65％的同源性并具有大體上與它相同的功能，并且對刺激有反應。
17．如權利要求16的方法，其中，所述編碼序列編碼一種能在開花期間在所述植物上引起不育的基因，并且是在受到光照時引起所述核酸序列表達。
18．如權利要求16的方法，其中，所述編碼序列編碼一種能改變葉片或其他光合作用組織中淀粉生物合成酶基因的水平的基因。
19．如權利要求16的方法，其中，所述編碼序列編碼一種基因，其表達水平隨發(fā)育中儲存器官中糖的產(chǎn)生和糖對該核酸序列的影響而變化。
20．如權利要求16的方法，其中，所述核酸序列在有光但無糖的條件下是能工作的。
21．如權利要求16的方法，其中，所述核酸序列在有糖但遮光的條件下是能工作的。
22．一種改變轉基因植物中另一種酶的方法，所述植物由于遺傳轉化已經(jīng)表現(xiàn)出一種酶活性的提高或降低，以便上調或下調所述另一種酶，并因此提高或減少由所述再轉化植物產(chǎn)生的淀粉量。
23．如權利要求22的方法，其中，所述第一種轉化植物是在淀粉生物合成途徑上具有提高或降低了的酶活性的植物。
24．如權利要求23的方法，其中，所述第一種轉化植物是用編碼ADPG-PPase的基因轉化過的轉基因馬鈴薯。
25．如權利要求8、14或16中任一項的方法，其中，所述嵌合基因還包括一個選自下列一組的啟動子花椰菜花葉病毒35S啟動子(完整的或截短的)，核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶啟動子、豌豆質體蘭素啟動子、胭脂氨酸合成酶啟動子、葉綠體r/b結合啟動子、高分子量麥谷蛋白啟動子、α-,β-麥醇溶蛋白啟動子、大麥醇溶蛋白啟動子和patatin啟動子。
26．如權利要求8、14或16中任一項的方法，其中，所述嵌合基因中所述酶的編碼序列使所述酶的活性得到上調或下調。
27．如權利要求16的方法，其中，所述刺激是光照的存在或缺乏和/或糖含量的改變。
28．如權利要求16的方法，其中，所述刺激是受發(fā)育控制的刺激。
29．如權利要求27的方法，其中，所述糖是蔗糖或葡萄糖中的一種或多種。
30．如權利要求29的方法，其中，所述糖是蔗糖。
31．一種包括權利要求1的核酸序列的嵌合基因。
32．一種包括權利要求1的編碼一種質體定向序列的核酸序列和由權利要求4的序列編碼的淀粉降解途徑上的一種酶的核酸編碼序列的嵌合基因。
33．一種包括能夠指導另一種編碼序列表達的核酸序列的嵌合基因，所述編碼序列是權利要求4的序列。
34．一種嵌合基因，包括對刺激有反應的權利要求6的核酸序列和一種編碼序列，所述編碼序列的表達水平根據(jù)作用于所述核酸序列的刺激而變化。
35．含有權利要求1、4、5或6的任一項的核酸序列的植物細胞。
36．含有權利要求1、4、5或6的一種或多種核酸序列的轉化植物的種子。
37．按照權利要求8、14或16中任一項的方法轉化過的植物，其中，所述植物是下列一組中的一種或多種馬鈴薯、小麥、玉米、大麥、番茄、水稻、豌豆、大豆、花生、木薯、大薯、香蕉和煙草。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型葉綠體定向新型β－淀粉酶序列(ctβ－淀粉酶),一種新型葉綠體定向核酸序列和一種新型β－淀粉酶序列。還披露了一種能通過光照或糖刺激而獨立激活的誘導型啟動子。披露了用所述序列轉化植物的方法,以及轉化過的植物細胞、轉化過的植物及其種子,以及含有所述序列的嵌合基因。披露了可以實現(xiàn)對植物中淀粉含量的改變,以及由于刺激所產(chǎn)生的來自淀粉生物合成或降解途徑的基因的定向,病蟲害抗性或基因表達的改變。
文檔編號C12R1/91GK1323349SQ99812300
公開日2001年11月21日 申請日期1999年8月13日 優(yōu)先權日1998年8月19日
發(fā)明者T·A·卡瓦納格, N·T·勞 申請人:先進技術(劍橋)有限公司