專(zhuān)利名稱(chēng)：內(nèi)源組成激活g蛋白偶聯(lián)孤獨(dú)受體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專(zhuān)利文件公開(kāi)的發(fā)明涉及跨膜受體，尤其涉及內(nèi)源配體未知的內(nèi)源組成激活的G蛋白偶聯(lián)受體以及使用這種受體對(duì)作為這種受體的激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑和/或最適合的逆向激動(dòng)劑的候選化合物進(jìn)行直接鑒定篩選的方法。
背景技術(shù)：
A．G蛋白偶聯(lián)受體G蛋白偶聯(lián)受體具有普通結(jié)構(gòu)圖型。這類(lèi)受體具有7個(gè)α螺旋型疏水氨基酸序列7個(gè)，每個(gè)序列由22至24個(gè)疏水氨基酸構(gòu)成，每個(gè)螺旋都橫跨細(xì)胞膜。由氨基酸鏈把這種橫跨膜螺旋連接起來(lái)，這種氨基酸鏈在膜的胞外側(cè)且在第4和第5跨膜螺旋之間有一較大的環(huán)。另一較大的環(huán)基本由親水氨基酸組成，在膜的細(xì)胞內(nèi)側(cè)連接第5和第6橫跨膜螺旋。該受體的羰基末端位于細(xì)胞內(nèi)而氨基末端在細(xì)胞外空間中。目前認(rèn)為連接著第5和第6螺旋的大環(huán)及羰基末端與G蛋白相互配合?，F(xiàn)已鑒定Gq、Gs、Gi、Go是G蛋白。G蛋白偶聯(lián)受體的通式如圖1所示。
在生理?xiàng)l件下，細(xì)胞膜中G蛋白偶聯(lián)受體處于“非活性”和“活性”兩種不同狀態(tài)或形態(tài)的平衡中。如圖2所示，非激活態(tài)受體是不能連接到胞內(nèi)傳導(dǎo)通道上來(lái)產(chǎn)生生物反應(yīng)的。受體形態(tài)變?yōu)榧せ顟B(tài)才能連接到胞內(nèi)傳導(dǎo)通道并產(chǎn)生生物反應(yīng)。
用內(nèi)源配體或外源激動(dòng)劑配體可以把受體穩(wěn)定在激活態(tài)。最近發(fā)現(xiàn)用受體而不用配體也能穩(wěn)定激活態(tài)，包括修飾受體的氨基酸序列，但并不局限于此。這類(lèi)方法是通過(guò)對(duì)配體結(jié)合受體產(chǎn)生的效應(yīng)進(jìn)行刺激來(lái)有效地穩(wěn)定受體的活性狀態(tài)的。把這種利用孤立配體的方法產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)活性稱(chēng)為“組成受體活性”。把內(nèi)源配體未知或未鑒定的受體都稱(chēng)為“孤獨(dú)受體”。
B．傳統(tǒng)化合物篩選一般來(lái)說(shuō)，使用孤獨(dú)受體來(lái)篩選鑒定對(duì)聯(lián)與這類(lèi)受體相關(guān)生物反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)的化合物是已不可能的。這是因?yàn)閭鹘y(tǒng)“教條”認(rèn)為篩選中被選擇的化合物是在受體的配體已知情況下與受體竟?fàn)幮越Y(jié)合的化合物，即化合物干涉或阻礙自然配體與受體的結(jié)合。根據(jù)定義，這種方式不適用于孤獨(dú)受體。這種現(xiàn)有技術(shù)以及堅(jiān)持這種教條方式指導(dǎo)的治療學(xué)研究主要認(rèn)為除非且必須發(fā)現(xiàn)受體的自然配體才能使用孤獨(dú)受體。而孤獨(dú)受體的內(nèi)源配體研究會(huì)花費(fèi)幾年且成本達(dá)幾百萬(wàn)美元。
進(jìn)一步來(lái)說(shuō)，在人類(lèi)基因組中估計(jì)有2000個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體，其中大部分是孤獨(dú)受體，這種傳統(tǒng)教條極力反對(duì)對(duì)這些受體進(jìn)行治療學(xué)研究的創(chuàng)新方式。
C．孤獨(dú)受體實(shí)例GPR3,GPR4,GPR6,GPR12,GPR21,GHSR,OGR1和ALO22171GPR3是內(nèi)源配體未知的具有330個(gè)氨基酸的G蛋白偶聯(lián)受體(Marchese,A等(1994)Genomics 23:609；另見(jiàn)Iismaa,T.P.等(1994)Genomics 24:391；參見(jiàn)圖1描述的核酸和氨基酸序列)。GPR3是內(nèi)源型組成激活的(Eggerick,D等(1995)Biochem.J.389:837)。GPR12是GPR3的一種同源物，具有334個(gè)氨基酸，其內(nèi)源配體是未知的(Song,Z.-H.,(1995)Genomics 28:347；參見(jiàn)圖1描述的氨基酸序列)。GPR6是GPR3的一種同源物，具有362個(gè)氨基酸，其內(nèi)源配體是未知的(Song,Z.-H.,(1995)見(jiàn)上述圖1描述的氨基酸序列)。GPR6轉(zhuǎn)錄主要在人類(lèi)腦殼中，在前額皮層、海馬及下丘腦中很少(Heiber,M等，DNA and CELL Biology(1995)14(1):25，參見(jiàn)圖1描述的GPR6的核酸和氨基酸序列)。GPR4也已被證實(shí)為一種孤獨(dú)GPCR(Heiber,M等，DNA and CELL Biology 25(1995))。OGR1是一種孤獨(dú)GPCR,報(bào)道為GPR4的高度同系物(Xu,Y.和Casey,G.,35 Genomics397(1996)。GPR21是一種內(nèi)源配體未知的具有349個(gè)氨基酸的G蛋白偶聯(lián)受體(參見(jiàn)基因文庫(kù)附加號(hào)為#U66580的核酸推導(dǎo)出的氨基酸序列)。GPR21被報(bào)道是位于染色體9q33上的(O,DowdB等，187 Gene75(1997)。ALO22171是一種位于染色體1q24上的來(lái)自克隆384F21的人類(lèi)DNA序列。ALO22171已被證實(shí)具有一個(gè)編碼361個(gè)氨基酸蛋白(參見(jiàn)基因文庫(kù)附加號(hào)ALO22171)的開(kāi)讀框架1086bp。ALO22171中68％與GPR21相同(參見(jiàn)圖5B)。GHSK也被證實(shí)為一種孤獨(dú)GPCR(Howard,A.D.等，273 Science 974(1996))。
技術(shù)方案在此公開(kāi)的方法是對(duì)內(nèi)源組成激活的G蛋白偶聯(lián)孤獨(dú)受體(GPCRc)相對(duì)應(yīng)的候選化合物進(jìn)行篩選的方法，用于對(duì)作為這種受體的激動(dòng)劑、逆向激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑的候選化合物進(jìn)行直接鑒定。為了達(dá)到這種篩選目的，提出使用內(nèi)源組成激活的孤獨(dú)GPCR:G蛋白-融合蛋白。


圖1表示一種G蛋白偶聯(lián)受體的大體結(jié)構(gòu)，編號(hào)指跨膜螺旋、胞內(nèi)環(huán)和胞外環(huán)。
圖2圖示活性和非活性?xún)煞N狀態(tài)，為典型的G蛋白偶聯(lián)受體和與第二信息傳導(dǎo)通道的激活態(tài)連接；圖3用計(jì)算機(jī)顯示的“點(diǎn)斑”表示通過(guò)一種人體組織的孤獨(dú)受體GPR4的分布(參見(jiàn)附錄A坐標(biāo)編碼)；圖4是表示由帶有孤獨(dú)受體GPR3的受感染細(xì)胞293T制備的膜比僅用對(duì)照載體轉(zhuǎn)染的膜加強(qiáng)了[35S]GTPγS結(jié)合，膜蛋白為75μg/孔，[35S]GTPγS的放射同位素標(biāo)記濃度穩(wěn)定保持為1.2nM,GDP濃度穩(wěn)定保持為1μm，在Wallac閃爍記錄儀中的96孔格式上進(jìn)行評(píng)價(jià)；圖5A表示孤獨(dú)受體GPR3、GPR6和GPR12的氨基酸鏈，圖5B表示孤獨(dú)受體GPR21和ALO22171的氨基酸鏈(共同序列#1表示配合的殘基)；圖6A是利用在VIP細(xì)胞中從CRE受驅(qū)動(dòng)報(bào)告系統(tǒng)誘導(dǎo)β-半乳糖酶表達(dá)的加強(qiáng)能力，表示證實(shí)了孤獨(dú)受體GPR3、GPR6和GPR12為組成激活的示意圖，圖6B和圖6C是分別利用在293和293T細(xì)胞中從CRE受驅(qū)動(dòng)報(bào)告系統(tǒng)誘導(dǎo)熒光素酶基因表達(dá)的加強(qiáng)能力，表示證實(shí)了孤獨(dú)受體GPR21和ALO22171為組成激活的示意圖；圖7A、圖7B和圖7表示采用RT-PCR確認(rèn)的幾種正常人類(lèi)組織剖面中孤獨(dú)受體GPR3(A)、GPR6(B)和GPR12(C)表達(dá)的相對(duì)分布，縮寫(xiě)Oex=枕骨皮層；Hypoth=下丘腦；Tex=顳部皮層；Fex=額部皮層。
圖8A和圖8B表示采用RT-PCR確認(rèn)的在正常人(A)和癲癇患者(B)腦組織中表達(dá)的GPR3受體；圖9A是使用GPR6探針進(jìn)行原位雜交(正常鼠)結(jié)果的自動(dòng)射線照片；圖9B是鼠腦相應(yīng)區(qū)域的參考圖；圖10A是自動(dòng)射線照相證實(shí)GPR6探針定位雜交(Zueker鼠-C型)結(jié)果的復(fù)印圖；圖10B是使用GPR6探針進(jìn)行定位雜交(Zucker鼠-肥胖型)結(jié)果的自動(dòng)射線照片；圖10C是鼠腦相應(yīng)區(qū)域的參考圖；圖11A-F是相使用GPR12探針定位雜交(正常鼠)結(jié)果的自動(dòng)射線照片；圖12是使用GPR6探針(12A)和食欲素受體探針(12B)進(jìn)行原位雜交(正常鼠)結(jié)果及證實(shí)兩個(gè)受體(12C和12D)同位的重疊部自動(dòng)射線照片；圖13是使用GPR6探針(13A)和黑皮質(zhì)素-3受體探針(13B)進(jìn)行原位雜交(正常鼠)結(jié)果及證實(shí)兩個(gè)受體(13C和13D)同位的重疊部自動(dòng)射線照片；圖14提供了同位實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明了GPR6和AGRP在弓體內(nèi)的共同位置上，箭頭表示注意弓體內(nèi)特異性細(xì)胞以及環(huán)繞該細(xì)胞的環(huán)，“點(diǎn)”是放射性同位素標(biāo)記的GPR6，其下部較黑的陰影是AGRP。
圖15提供了動(dòng)物(n=5)接受了GPR6的反義寡義核苷酸后(第5天星符表示給動(dòng)物注射了右旋d-硫酸苯異丙胺，參見(jiàn)圖16)隨天數(shù)的體重變化圖示結(jié)果；圖16提供了圖15所述動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)動(dòng)活性及苯異丙胺誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)行為的柱狀圖；圖17提供了用GPR3融合蛋白標(biāo)記物(圖17A)和GPR6融合蛋白標(biāo)記物(圖17B)對(duì)被篩選的候選化合物進(jìn)行直接鑒定的柱狀圖；圖18A-L是最佳期載體pCMV的序列圖，包括限制本酶位點(diǎn)。
詳細(xì)說(shuō)明涉及受體的科學(xué)文獻(xiàn)使用了許多術(shù)語(yǔ)對(duì)影響各種受體的配體進(jìn)行解釋。為了明確區(qū)別起見(jiàn)，在本專(zhuān)利文件中使用下述定義，這些定義與其它定義有沖突時(shí)，以下述定義為準(zhǔn)激動(dòng)劑指與受體結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)或加強(qiáng)GTP結(jié)合到膜上的物質(zhì)(如配體、候選化合物)。
氨基酸縮寫(xiě)這里使用的氨基酸縮寫(xiě)列于表1中。
表1


部分激動(dòng)劑指與受體結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的級(jí)別/程度或加強(qiáng)GTP結(jié)合到膜上的級(jí)別/程度弱于使用激動(dòng)劑的級(jí)別/程度的物質(zhì)(如配體、候選化合物)。
拮抗劑指象激動(dòng)劑一樣以相同位點(diǎn)竟?fàn)幗Y(jié)合到受體上但不激活由受體激活態(tài)所啟動(dòng)的胞內(nèi)反應(yīng)、并能抑制由激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑引起的胞內(nèi)反應(yīng)的物質(zhì)。在沒(méi)有激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑的情況下拮抗劑并不減弱胞內(nèi)基準(zhǔn)反應(yīng)。
候選化合物指能改進(jìn)篩選技術(shù)的分子(如化學(xué)化合物，并不限定于此)?！昂蜻x化合物”不包括以前利用間接鑒定方法從受體的逆向激動(dòng)劑、激動(dòng)劑和拮抗劑中選擇的公知化合物(“間接鑒定化合物”)，更不包括以前鑒定的至少對(duì)一種脯乳動(dòng)物具有治療作用的間接鑒定化合物；尤其不包括以前鑒定的對(duì)人有治療用途的間接鑒定化合物。
混合物至少包含有一種成分，“藥物”是混合物的一個(gè)例子。
化合物功效指一種化合物抑制或刺激受體功能的能力量度，當(dāng)受體結(jié)合同簇物時(shí)功效相反。測(cè)定化合物功效的最佳方法是測(cè)定GTP(利用[35S]GTPγS)或cAMP，在本專(zhuān)利文件的實(shí)施例中進(jìn)一步公開(kāi)。
組成激活的受體(組成激活受體)指受到組成受體活性的一種受體。一種組成激活的受體可以是內(nèi)源的或非內(nèi)源的。
組成受體活性指不通過(guò)受體與其內(nèi)源配體或一種化學(xué)等同物的結(jié)合而使激活態(tài)受體穩(wěn)定。
接觸或接觸著指至少把兩部分放在一起，不論是在體外系統(tǒng)還是在活體系統(tǒng)。
直接鑒定或直接鑒定的與“候選化合物”有關(guān)，指與一個(gè)組成激活的受體相配的候選化合物的篩選以及對(duì)這種化合物進(jìn)行化合物功效評(píng)價(jià)，組成激活的受體可以是一個(gè)組成激活的孤獨(dú)受體，最好是細(xì)胞表面的一個(gè)組成激活的G蛋白偶聯(lián)孤獨(dú)受體。無(wú)論在什么條件下，這個(gè)詞組均被解釋或理解為反義或相反含義的“間接鑒定”或“間接鑒定的”。
內(nèi)源的指哺乳動(dòng)物自然產(chǎn)生的物質(zhì)。如以“受體”為例，但并不限定于此，內(nèi)源的是指由一種哺乳動(dòng)物(如人類(lèi)，只作為例子并不限定于此)或一種病毒自然產(chǎn)生的。與此相反，在這個(gè)意義上的非內(nèi)源的是指由一種哺乳動(dòng)物(如人類(lèi)，只作為例子并不限定于此)或一種病毒非自然產(chǎn)生的。例如內(nèi)源形態(tài)不是組成激活的受體受控變?yōu)榻M成激活，在此最好稱(chēng)為“非內(nèi)源的組成激活的受體”，但并不限定于此。這兩個(gè)的術(shù)語(yǔ)都被用于描述“活體”和“體外”體系。例如在篩選方法中，內(nèi)源的或非內(nèi)源的受體都可以以體外篩選體系為參照，但并不限定于此。又如控制哺乳動(dòng)物基因組包括非內(nèi)源組成激活受體，用活體對(duì)候選化合物的篩選是明顯的，但并不限定于此。
G蛋白偶聯(lián)受體融合蛋白和GPCR融合蛋白本發(fā)明在此公開(kāi)內(nèi)容中，每個(gè)這種蛋白都是指一個(gè)包括非內(nèi)源組成激活的孤獨(dú)GPCR融合在至少一個(gè)G蛋白上的非內(nèi)源蛋白質(zhì)，最好是這種G蛋白的阿爾法(α)亞單位(結(jié)合GTP的亞單位)，這種G蛋白可以是與動(dòng)物內(nèi)源GPCR天然偶聯(lián)的G蛋白一樣類(lèi)型的。例如，內(nèi)源態(tài)G蛋白“Gsα”是主要與GPR6偶聯(lián)的G蛋白，但并不限定于此，根據(jù)GPR6得到的GPCR融合蛋白可能是一種包含有融合了Gsα的GPR6的非內(nèi)源蛋白。該G蛋白可以被直接融合到內(nèi)源組成激活的孤獨(dú)GPCR的C末端，或者，可以在兩者之間具隔離物。
間接鑒定或間接鑒定的是指?jìng)鹘y(tǒng)方法，該方法在藥物研究方式中涉及對(duì)內(nèi)源受體的特異性?xún)?nèi)源配體的鑒定，對(duì)與受體相配的、用于確定干擾和/或竟?fàn)幣潴w-受體相互作用的候選化合物進(jìn)行鑒定，以及對(duì)影響與激活的受體相關(guān)的至少一個(gè)第二信息通道的化合物功效進(jìn)行評(píng)價(jià)。
抑制劑或抑制與“反應(yīng)”相關(guān)，是指當(dāng)有這種化合物存在時(shí)反應(yīng)降低或受阻，而當(dāng)缺少這種化合物時(shí)結(jié)果相反。
逆向激動(dòng)劑指即可以與受體的內(nèi)源形態(tài)結(jié)合也可以與受體組成激活形態(tài)結(jié)合的物質(zhì)(如配體、候選化合物)，在缺少激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑所觀察到的正?；钚曰舅揭韵?，它抑制由受體的激活態(tài)所啟動(dòng)的胞內(nèi)基準(zhǔn)反應(yīng)，或者降低GTP與膜結(jié)合。與缺少這種逆向激動(dòng)劑的狀況相比，有逆向激動(dòng)劑的狀況下這種胞內(nèi)基準(zhǔn)反應(yīng)至少可以受到30％的抑制，受抑制至少50％的效果較好，受抑制至少75％的效果最好。
配體是指針對(duì)天然產(chǎn)生的內(nèi)源受體而天然產(chǎn)生的內(nèi)源特異性分子。
孤獨(dú)受體是指對(duì)內(nèi)源特異性配體的內(nèi)源受體，這種受體的配體是未被鑒定或是未知的。
藥物指至少含有一種活性組分的混合物，從而使這種混合物經(jīng)得起哺乳動(dòng)物體(如人體，但不限定于此)內(nèi)特定有效結(jié)果的研究檢驗(yàn)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會(huì)理解和意識(shí)到這種適當(dāng)技術(shù)用于確定是否一種具有理想效果的活性組分是人工制作的必要基礎(chǔ)。
非孤獨(dú)受體指內(nèi)源天然產(chǎn)生配體的內(nèi)源天然產(chǎn)生的特異性分子，其特征在于配體與受體結(jié)合激活胞內(nèi)信息通道。
刺激或刺激著與“反應(yīng)”有關(guān)，在具有某種化合時(shí)反應(yīng)增強(qiáng)而缺少這種化合物時(shí)結(jié)果相反。
下列各部分的次序只起描述性說(shuō)明，并不用作對(duì)下列公開(kāi)內(nèi)容或權(quán)利要求限定的預(yù)定格式，也不應(yīng)當(dāng)限定為這種結(jié)構(gòu)。
A．引言對(duì)受體的傳統(tǒng)研究總是先假設(shè)(基于以前研究的)只有在發(fā)現(xiàn)前先確認(rèn)了內(nèi)源配體才可能進(jìn)一步尋找到拮抗劑和可能影響該受體的其它分子。即使在一種拮抗劑可能是先已知的情況下，研究也要立即延伸到尋找內(nèi)源配體。這種思維方式認(rèn)為即使在組成激活的受體發(fā)現(xiàn)后也要堅(jiān)持受體研究。以前沒(méi)有意識(shí)到受體的激活態(tài)對(duì)發(fā)現(xiàn)受體的激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑和逆向激動(dòng)劑最有價(jià)值。對(duì)于由整個(gè)活性受體引起的疾病來(lái)說(shuō)，理想的治療藥物是具有削弱受體激活態(tài)作用的化合物，這種藥物不必是內(nèi)源配體的拮抗劑。這是因?yàn)榻档突钚允荏w態(tài)活性的化合物(藥)不必象內(nèi)源配體那樣在相同點(diǎn)結(jié)合。因此，按照本發(fā)明方法的指導(dǎo)，治療用化合物的任何研究都應(yīng)當(dāng)從篩選抵抗非獨(dú)立配體激活態(tài)的化合物開(kāi)始。所以，這種研究是對(duì)激活態(tài)受體的逆向激動(dòng)劑研究。
以?xún)?nèi)源組成激活的孤獨(dú)受體為參照對(duì)候選化合物進(jìn)行篩選可以對(duì)作用于細(xì)胞膜表面受體的候選化合物進(jìn)行直接鑒定，不需要先了解這種受體的內(nèi)源配體知識(shí)或不需要使用這種受體的內(nèi)源配體，這種受體例如此處記載的內(nèi)源組成激活的GPRs,GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR、RE2和ALO22171，但并不限定于此。通過(guò)確定這類(lèi)受體在體內(nèi)表達(dá)或/和過(guò)度表達(dá)的區(qū)域，就可能確定與這些受體的表達(dá)和/或過(guò)度表達(dá)有關(guān)的疾病/紊亂狀態(tài)，這種措施在本專(zhuān)利文件中公開(kāi)。
B．疾病/紊亂鑒定和/或選擇正如下面較詳細(xì)的說(shuō)明，采用本發(fā)明方法可以鑒定內(nèi)源組成激活孤獨(dú)受體的最佳逆向激動(dòng)劑，這類(lèi)內(nèi)源組成激活的受體例如這里所述的受體(GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR、RE2和ALO22171)。在治療與這些受體有關(guān)疾病的藥物新發(fā)現(xiàn)程序中，這類(lèi)逆向激動(dòng)劑作為導(dǎo)引化合物是理想的候選物。的確，甚至在沒(méi)有配體-受體結(jié)合的情況下如果激活受體，這類(lèi)受體(即使配體是已知的)的拮抗劑也可能是無(wú)效的。由于這些受體具有直接鑒定逆向激動(dòng)劑的能力，能夠研究與這些受體有關(guān)疾病和紊亂，從而可以進(jìn)行藥物開(kāi)發(fā)。例如，現(xiàn)在對(duì)出現(xiàn)這些孤獨(dú)受體的病變組織和正常組織樣品進(jìn)行掃描而不用進(jìn)行學(xué)究式試驗(yàn)，或者可能不用遵循鑒定內(nèi)源配體的途徑。組織掃描可以在健康組織和病變組織大范圍內(nèi)進(jìn)行。對(duì)與疾病和/或紊亂有關(guān)特異性受體進(jìn)行的這種組織掃描最好是第一步。
可以把內(nèi)源組成激活的GPCR的DNA序列用來(lái)制作探針，用于對(duì)組織樣品中受體的表達(dá)進(jìn)行RT-PCR鑒定。用病變組織中出現(xiàn)的受體或病變組織中出現(xiàn)受體的測(cè)定濃度與正常組織的進(jìn)行比較，就能用來(lái)分析與疾病的相關(guān)性。利用這種技術(shù)同樣能對(duì)受體在器管中的區(qū)域進(jìn)行定位。根據(jù)具有定位受體特異性組織的已知功能，能推導(dǎo)出受體的公認(rèn)功用。
C、同源鑒定有效進(jìn)行孤獨(dú)受體與疾病和/或紊亂相關(guān)分析及鑒定是對(duì)具有與該孤獨(dú)受體同源的附加受體進(jìn)行鑒定。根據(jù)GPR6和GPR12與GPR3的同源序列，用這種方法對(duì)GPR6和GPR12進(jìn)行了鑒定，并且，根據(jù)ALO22171與GPR21的同源序列，用這種方法對(duì)ALO22171進(jìn)行了鑒定。GPR3以前已被鑒定為是一種組成激活的孤獨(dú)受體(見(jiàn)Eggerick,supra)。在本發(fā)明以前，并不知道GPR6、GPR12、GPR21和ALO22171在它們的內(nèi)源狀態(tài)中也是組成激活的。使用已知的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)(如dbEST)鑒定了GPR6、GPR12、GPR21和ALO22171。
在此公開(kāi)的本發(fā)明獨(dú)特之處的重點(diǎn)在于因教條認(rèn)為藥劑篩選依賴(lài)于受體的內(nèi)源配體鑒定和了解，現(xiàn)有技術(shù)沒(méi)有動(dòng)機(jī)來(lái)探索是否GPR3同源物在其內(nèi)源形式中是組成激活的(最多是出于研究好奇)。但是，本發(fā)明研究的動(dòng)力在于對(duì)這類(lèi)受體的逆向激動(dòng)劑進(jìn)行直接鑒定并能對(duì)這類(lèi)受體在組織樣品中的分布進(jìn)行確定，本發(fā)明明顯地不是出于這種無(wú)用的好奇，并且提供了減緩影響人體正常狀況的疾病和紊亂的方法。
D、候選化合物的篩選1、一般的GPCR篩選試驗(yàn)技術(shù)當(dāng)一種G蛋白受體變得有組成激活時(shí)，它結(jié)合到一個(gè)G蛋白(如Gq、Gs、Gi、Go)并促進(jìn)GTP與該G蛋白的結(jié)合。然后，這種G蛋白作為一種GTP酶并緩慢的把GTP水解為GDP，從而，在正常條件下受體失活。不過(guò)，組成激活的受體不斷把GDP變換成GTP。一種不能水解的GTP同類(lèi)物[35S]GTPγS能被用于監(jiān)測(cè)增強(qiáng)了的與膜結(jié)合，該膜表達(dá)組成激活的受體。據(jù)報(bào)道，[35S]GTPγS能被用于監(jiān)測(cè)G蛋白偶聯(lián)到有或無(wú)配體的膜上。在現(xiàn)有技術(shù)中這種監(jiān)測(cè)的實(shí)例是眾所周知的并且是很有效的，其中的一個(gè)例子是1995年Traynor和Nahorski報(bào)道的。這個(gè)試驗(yàn)體系的最佳使用是對(duì)候選化合物的初期篩選，因?yàn)檫@種體系一般能用于所有G蛋白偶聯(lián)受體，除了與受體的胞內(nèi)區(qū)域相互作用的特殊G蛋白以外。在GTP試驗(yàn)體系中最好利用GPCR融合蛋白。
B．2．特異性GPCR篩選試驗(yàn)體系在對(duì)候選化合物使用“一般的”G蛋白隅聯(lián)受體試驗(yàn)進(jìn)行鑒定后(即一種選擇作為激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑和逆向激動(dòng)劑化合物的試驗(yàn))，提儀進(jìn)一步篩選確認(rèn)已在受體位點(diǎn)起作用的化合物。例如，一種用“一般的”試驗(yàn)鑒定的化合物可以不與受體結(jié)合，但僅可以替換從胞內(nèi)區(qū)域伸出的G蛋白。在具有GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR、RE2和ALO22171的情況下，已證實(shí)這些受體偶聯(lián)G蛋白Gs。Gs刺激腺苷酸環(huán)化酶(另一方面，Gi抑制這種酶)。腺苷酸環(huán)化酶催化ATP向cAMP轉(zhuǎn)化；因此，由于這些受體在其內(nèi)源形式中被激活，cAMP的增加水平與此相關(guān)(另一方面，偶聯(lián)Gi蛋白的內(nèi)源受激受體與cAMP的減少水平有關(guān))。(見(jiàn)Sinauer Associates,Inc.(1992)Nichols,J.G.等編著的From Neuron To Brain(第三版)，請(qǐng)主要參見(jiàn)“Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission”,Chpt.8)。因此，檢測(cè)cAMP的試驗(yàn)就能被用于確定一種候選化合物是否是該受體的逆向激動(dòng)劑(即，這類(lèi)化合物與該受體接觸與不接觸這種受體相比會(huì)降低cAMP的水平)?，F(xiàn)有技術(shù)中已知的各種檢測(cè)cAMP的方法都可以利用，最好的方法是使用反義cAMP抗體。可以使用的另一種試驗(yàn)方法是整個(gè)細(xì)胞第二信息報(bào)告體系試驗(yàn)。基因上的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)特異基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)。循環(huán)AMP通過(guò)啟動(dòng)cAMP-反應(yīng)的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合或轉(zhuǎn)錄因子(CREB)的結(jié)合驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)，該轉(zhuǎn)錄因子隨后在被稱(chēng)作cAMP元件的特異性位點(diǎn)結(jié)合到啟動(dòng)子上，并且驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)。報(bào)告體系可以構(gòu)建為具有一個(gè)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在報(bào)告基因前具有多個(gè)cAMP反應(yīng)元件，如β-半乳糖苷酶或螢光素酶。所以，類(lèi)似GPR3的一種激活的Gs受體引起cAMP積累，隨后，cAMP激活基因并使報(bào)告蛋白表達(dá)。然后，使用標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)試驗(yàn)就能檢測(cè)到類(lèi)似β-半乳糖苷酶或螢光素酶報(bào)告蛋白(例如，參見(jiàn)Chen等，1995)。最好是使用cAMP試驗(yàn)。
當(dāng)然，也可以不采用一般試驗(yàn)方法而采用特異性試驗(yàn)方法直接對(duì)候選化合物進(jìn)行鑒定。這類(lèi)選擇基本上是技巧性選擇。對(duì)于GPR6來(lái)說(shuō)，修飾后使用，商業(yè)上使用的cAMP試驗(yàn)主要是用于對(duì)逆向激動(dòng)劑的直接鑒定。
C．3．GPCR融合蛋白在對(duì)逆向激動(dòng)劑、激動(dòng)劑和部分激動(dòng)劑進(jìn)行直接鑒定使用候選化合物篩選中利用內(nèi)源組成激活的孤獨(dú)GPCR是一種特殊性的挑戰(zhàn)，根據(jù)定義，內(nèi)源受體甚至在缺少內(nèi)源配體結(jié)合的情況下也具有活性。因此，要區(qū)別受體結(jié)合與不結(jié)合之間的差別，例如對(duì)有候選化合物的內(nèi)源受體和沒(méi)有候選化合物的內(nèi)源受體進(jìn)行區(qū)別鑒定，這種區(qū)別的目的在于了解這種候選化合物是否是一種逆向激動(dòng)劑、激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑，或者是否對(duì)這類(lèi)受體有作用，使用這種方法的好處在于可以加強(qiáng)這種區(qū)別。是好的方式是使用GPCR融合蛋白。
一般來(lái)說(shuō)，一旦確定了一種內(nèi)源孤獨(dú)GPCR具有組成激活，使用上述的試驗(yàn)技術(shù)(或其它方法)，有可能確定偶聯(lián)內(nèi)源GPCR的主要G蛋白，G蛋白對(duì)GPCR的偶聯(lián)提供可評(píng)價(jià)的信息通道。由于希望體系中具有內(nèi)源G蛋白，所以，使用哺乳動(dòng)物表達(dá)體系進(jìn)行篩選是最好的。根據(jù)定義，在這種體系中內(nèi)源組成激活的孤獨(dú)GPCR會(huì)有連續(xù)信號(hào)。根據(jù)這種認(rèn)識(shí)，以受體的逆向激動(dòng)劑為例，其益處在于當(dāng)逆向激動(dòng)劑存在的情況下會(huì)加強(qiáng)這種信號(hào)，尤其是在篩選中，更有可能使受體與逆向激動(dòng)劑接觸與否之間的區(qū)別更明顯。
GPCR融合蛋白會(huì)加強(qiáng)G蛋白偶聯(lián)內(nèi)源GPCR的效率。用內(nèi)源組成激活的GPCR進(jìn)行篩選出現(xiàn)GPCR融合蛋白是重要的，因?yàn)檫@種方式增加了這類(lèi)篩選技術(shù)中最主要使用的信號(hào)。如在此所公開(kāi)的，加強(qiáng)一種有用的“信號(hào)/噪音”比率對(duì)候選化合物的篩選是重要的。
用于表達(dá)GPCR融合蛋白的構(gòu)建是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所掌握的。商業(yè)使用的表達(dá)載體和體系的各種方式都適合研究者的特殊需要。一個(gè)主要的標(biāo)準(zhǔn)是這種GPCR融合蛋白結(jié)構(gòu)為內(nèi)源GCPR序列和G蛋白序列均是符合讀框的(可以為內(nèi)源GPCR序列是G蛋白序列的上游)，并且GPCR的“終止”密碼子在GPCR表達(dá)中必須能被檢測(cè)或取代，G蛋白也能被表達(dá)。GPCR可以直接與G蛋白聯(lián)結(jié)，或者兩者之間有隔離殘基(但不超過(guò)12，這個(gè)數(shù)是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已確認(rèn)的)。我們用測(cè)定的GPCR活性對(duì)兩種方式進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果基本上是相同的，但建議(為方便起見(jiàn))使用有隔離物的方式，把對(duì)表達(dá)不起作用的某些限定性位點(diǎn)變成隔離物。最好是在創(chuàng)建GPCR融合蛋白結(jié)構(gòu)之前鑒定偶聯(lián)該內(nèi)源GPCR的G蛋白。因?yàn)橐驯昏b定的G蛋白僅有幾個(gè)，最好是把具有G蛋白序列(即整體的G蛋白結(jié)構(gòu))的結(jié)構(gòu)有效地插入內(nèi)源GPCR序列中，所以，這種方式對(duì)具有不同序列的各種不同內(nèi)源GPCRs的大規(guī)模篩選是很有效的。
E．藥物化學(xué)一般來(lái)說(shuō)，候選化合的直接鑒定是與利用結(jié)合化學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的相關(guān)化合物來(lái)推導(dǎo)的，但并不總是如此，所以，用于這種分析的隨機(jī)制備的化合物是成千上萬(wàn)的?？偟膩?lái)說(shuō)，這種篩選的結(jié)果是化合物具有獨(dú)特的核結(jié)構(gòu)，這些化合物圍繞一個(gè)主核結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行化學(xué)修飾進(jìn)一步加強(qiáng)其藥性。在這種方式中，直接鑒定的逆向激動(dòng)劑、激動(dòng)劑和/或部分激動(dòng)劑能對(duì)以前開(kāi)發(fā)的具有這種化合物的藥物進(jìn)行改良。一般認(rèn)為，進(jìn)一步改進(jìn)成藥物所選擇的直接鑒定的化合物的結(jié)合親和力為與受體的結(jié)合親和力低于100nM，但這一般要根據(jù)技師的特珠需要參照選擇。這種技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，在本專(zhuān)利文件中將不再描述。
F．藥物組合物進(jìn)一步開(kāi)發(fā)選擇的候選化合物可以使用本領(lǐng)域已知技術(shù)制成藥物。適合的藥用載體是本領(lǐng)域常使用的，例如，1980年Mack PublishingCo.出版的Remington′s Pharmaceutical Sciences(Oslo等編著)第16版中記載的內(nèi)容。
實(shí)施例下述實(shí)施例用于解釋本發(fā)明，并不是對(duì)本發(fā)明的限定。在此公開(kāi)了特異性核酸和氨基酸的序列，相信本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員有能力對(duì)這些序列進(jìn)行微小的修飾就能獲得與上述報(bào)告相同或?qū)嵸|(zhì)上相似的結(jié)果。其目的在于本發(fā)明從屬權(quán)利要求請(qǐng)求保護(hù)的范圍包括與GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR、RE2和ALO2217具有85％同源性的同等內(nèi)源組成激活的人類(lèi)孤獨(dú)受體序列，同源性達(dá)90％效果較好，最好是同源性在95％以上。實(shí)施例1原位探針的制備GPR3、GPR6和GPR12的原位探針是已有的。下列所用的PCR流程制備了這三種探針?biāo)梅磻?yīng)條件是1×rTth DNA聚合酶Ⅱ、1.5mMMg(OAc)2、4種核苷酸均為0.2mM、0.228μg小鼠基因組DNA、各引物為0.25μM(參見(jiàn)下述)，并在50μl反應(yīng)液中具有1個(gè)單位的rTthDNA聚合酶(Perkin Elmer)。用Perkin Elmer Cetus2400熱循環(huán)儀進(jìn)行了30個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件是94℃1分、55℃1分、72℃45秒。
1．小鼠GPR3原位探針由于數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有小鼠GPR3的整體長(zhǎng)度cDNA序列，這種原位探針的DNA片段是采用PCR獲得的，使用的3′簡(jiǎn)并寡核苷酸是由已被公開(kāi)的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域3中間的人和鼠GPR3序列得到的，使用的5′簡(jiǎn)并寡核苷酸是接近5′胞外區(qū)域始端的。使用的寡核苷酸序列如下5′-GGAGGATCCATGGCCTGGTTCTCAGC-3′(SEQ.ID.NO.:1；5′寡核苷酸)5′-CACAAGCTTAGRCCGRTCCMGRCARTTCCA-3′(SEQ.ID.NO.:2；3′寡核苷酸)其中=A或G，M=A或C。
具有穿過(guò)跨膜3中部的核苷酸24的A 537bp PCR片段是用BamHⅠ和HindⅢ消化得到的，并被亞克隆進(jìn)pBluescript的Bam HⅠ-HindⅢ位點(diǎn)。
2．小鼠GPR6原位探針小鼠GPR6的原位探針DNA片段是根據(jù)已公開(kāi)的小鼠GPR6cDNA序列采用PCR獲得的。使用的這種寡核苷酸序列如下5′-GGAGAAGCTTCTGGCGGCGATGAACGCTAG-3′(SEQ.ID.NO.:3；5′寡核苷酸)5′-ACAGGATCCAGGTGGCTGCTAGCAAGAG-3′(SEQ.ID.NO.:4；3′寡核苷酸)具有穿過(guò)跨膜區(qū)域4中部的核苷酸-10的A608bpPCR片段是用Bam HⅠ和Hind Ⅲ消化得到的，并被亞克隆進(jìn)pBluescript的Bam HⅠ-HindⅢ位點(diǎn)。
3．小鼠GPR12原位探針小鼠GPR12的原位探針DNA片段是根據(jù)已公開(kāi)的小鼠GPR12cDNA序列采用PCR獲得的。使用的這種寡核苷酸序列如下5′-CTTAAGCTTAAAATGAAGGAAGACCCGAAG-3′(SEQ.ID.NO.:5；5′寡核苷酸)
5′-GGAGGATCCCCAGAGCATCACTAGCAT-3′(SEQ.ID.NO.:6；3′寡核苷酸)具有穿過(guò)跨膜區(qū)域4中部的核苷酸-5的A516bpPCR片段是用BamHⅠ和HindⅢ消化得到的，并被亞克隆進(jìn)pBluescript的Bam HⅠ-HindⅢ位點(diǎn)。
產(chǎn)生的原位探針序列如下GPR3原位探針GGAGGATCCATGGCCTGGTTCTCAGCCGGCTCAGGCAGTGTGAATGTGAGCATAGACCCAGCAGAGGAACCTACAGGCCCAGCTACACTGCTGCCCTCTCCCAGGGCCTGGGATGTGGTGCTGTGCATCTCAGGCACCCTGGTGTCCTGCGAGAATGCTCTGGTGATGGCCATCATTGTGGGCACGCCTGCCTTCCGCGCCCCCATGTTCCTGCTGGTGGGCAGCTTGGCCGTAGCAGACCTGCTGGCAGGCCTGGGCCTGGTCCTGCACTTCGCTGCTGACTTCTGTATTGGCTCACCAGAGATGAGCTTGGTGCTGGTTGGCGTGCTAGCAACGGCCTTTACTGCCAGCATCGGCAGCCTGCTGGCCATCACCGTTGACCGCTACCTTTCCCTGTACAACGCCCTCACCTACTACTCAGAGACAACAGTAACTCGAACCTACGTGATGCTGGCCTTGGTGTGGGTGGGTGCCCTGGGCCTGGGGCTGGTTCCCGTGCTGGCCTGGAACTGCCGGGACGGTCTAAGCTT(SEQ.ID.NO.:7)
GPR6原位探針AAGCTTCTGGCGGCGATGAACGCTAGCGCCGCCGCGCTCAACGAGTCCCAGGTGGTGGCAGTAGCGGCCGAGGGAGCGGCAGCTGCGGCTACAGCAGCAGGGACACCGGACACCAGCGAATGGGGACCTCCGGCAGCATCCGCGGCGCTGGGAGGCGGCGGAGGACCTAACGGGTCACTGGAGCTGTCTTCGCAGCTGCCCGCAGGACCCTCAGGACTTCTGCTTTCGGCAGTGAATCCCTGGGATGTGCTGCTGTGCGTGTCGGGGACTGTGATCGCAGGCGAAAATGCGCTGGTGGTGGCGCTCATCGCATCCACTCCCGCGCTGCGCACGCCCATGTTGTGCTCGTGGGTAGTCTGGCCACTGCTGACCTGCTGGCGGGCTGTGGCCTCATCCTACACTTCGTGTTCCAGTACGTGGTGCCCTCGGAGACTGTGAGCCTGCTCATGGTGGGCTTCCTGGTGGCGTCTCACCTACTACTCGCGCCGGACCCTGTTGGGCGTGCACCTCTTGCTAGCAGCCACCTGGATCC(SEQ.ID.NO.:8)GPR12原位探針AAGCTTAAAATGAACGAAGACCCGAAGGTCAATTTAAGCGGGCTGCCTCGGGACTGTATAGAAGCTGGTACTCCGGAGAACATCTCAGCCGCTGTCCCCTCCCAGGGCTCTGTTGTGGAGTCAGAACCCGAGCTCGTTGTCAACCCCTGGGACATTGTCTTGTGCAGCTCAGGAACCCTCATCTGCTGTGAAAATGCCGTCGTGGTCCTTATCATCTTCCACAGCCCCAGCCTGCGAGCACCCATGTTCCTGCTGATAGGCAGCCTGGCTCTTGCAGACCTGCTGGCTGGTCTGGGACTCATCATCAATTTTGTTTTTGCCTACCTGCTTCAGTCAGAAGCCACCAAGCTGGTCACAATTGGACTCATTGTCGCCTCTTTCTCTGCCTCTGTCTGCAGTTTGCTGGCTATCACTGTGGACCGCTACCTCTCGCTGTATTACGCCCTGACGTACCACTCCGAGAGGACCGTCACCTTTACCTATGTCATGCTAGTGATGCTCTGGGGATCC(SEQ.ID.NO.:9)實(shí)施例21．cDNA和載體對(duì)于GPR3和GPR6來(lái)說(shuō)，含有cDNA的表達(dá)載體是由BrianO′Dowd(University of Toronto)捐贈(zèng)的。GPR3 cDNA的載體是pcDNA3,GPR6的載體是pReCMV(把GPR6的編碼區(qū)在HindⅢ-Xbal位點(diǎn)亞克隆進(jìn)pCMV)。使用下列方式制備GPR12cDNA人類(lèi)GPR12eDNA是使用人類(lèi)基因組DNA和用來(lái)自帶有HindⅢ-Xbal限制位點(diǎn)的5′未翻譯區(qū)域的5′引物及來(lái)自帶有BamHⅠ位點(diǎn)的3′未翻譯區(qū)域的3′引物，采用PCR獲得的。引物具有以下序列5′-CTTAAGCTTGTGGCATTTGGTACT-3′(SEQ.ID.NO.:10；5′寡核苷酸)5′-TCTGGATCCTTGGCCAGGCAGTGGAAGT-3′(SEQ.ID.NO.:11；3′寡核苷酸)進(jìn)行PCR的條件是在生產(chǎn)者提供的緩沖液體系中使用rTth DNA聚合酶(Perkin Elmer)，各引物為0.25μM,4種核苷酸均為0.2mM,以0.2μg的基因組DNA作模板。循環(huán)條件是94℃1分鐘、57℃1分鐘、72℃1.5分鐘共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。把1.2kbPCR片段用HindⅢ和BamHⅠ消化，并亞克隆進(jìn)pCMV表達(dá)載體的HindⅢ-BamHⅠ位點(diǎn)。產(chǎn)生的cDNA克隆是完全按公開(kāi)的序列構(gòu)成序列的。
對(duì)于GPR21來(lái)說(shuō)，進(jìn)行PCR的條件是在生產(chǎn)者提供的緩沖液體系中使用rTth DNA聚合酶(Perkin Elmer)和作為模板的基因組DNA，各引物為0.25mM,4種核苷酸均為0.2mM。循環(huán)條件是94℃1分分鐘、62℃1分分鐘、72℃1分20秒，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。把具有序列5′-GAGAATTCACTCCTGAGCCACTTCAGAT-3′(SEQ.ID.NO.:12)的5′PCR引物激酶化，并使3′引物具有序列5′-CGGGATCCCCGTAACTGAGCCACCTTCAGAT-3′(SEQ.ID.NO.:13)和Bam HⅠ位點(diǎn)。產(chǎn)生的1.1kbPCR片段用Bam HⅠ消化，并克隆進(jìn)pCMV表達(dá)載體的EcoRⅤ-Bam HⅠ位點(diǎn)。隨后確定了人類(lèi)GPR21的核酸序列(SEQ.ID.NO.:14)和氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:15)。
對(duì)于ALO22171來(lái)說(shuō)，進(jìn)行PCR的條件是在生產(chǎn)者提供的緩沖液體系中使用rTthDNA聚合酶(Perkin Elmer)和作為模板的基因組DNA，各引物為0.25μM,4種核苷酸均為0.2mM。循環(huán)條件是94℃1分分鐘、54℃1分分鐘、72℃1分20秒，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。5′引物具有HindⅢ位點(diǎn)和下列序列5′-AGGAAGCTTTAAATTTCCAAGCCATGAATG-3′(SEQ.ID.NO.:16),3′引物含有EcoRⅠ位點(diǎn)及下列序列5′-ACCGAATTCAGATTACATTTGATTTACTATG-3′(SEQ.ID.NO.:17)。產(chǎn)生的1.15kbPCR片段用HindⅢ和EcoRⅠ消化，并克隆進(jìn)pCMV表達(dá)載體的HindⅢ-EcoRⅠ位點(diǎn)。隨后確定并修飾了人類(lèi)ALO22171的核酸序列(SEQ.ID.NO.:18)和氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:19)。
對(duì)于GPR4(基因文庫(kù)附加號(hào)L36148)來(lái)說(shuō)，含有cDNA的表達(dá)載體是由Brian O′Dowd(University of Toronto)捐贈(zèng)的。GPR4 cDNA的載體是pcDNA3，并在HindⅢ-Xbal位點(diǎn)(在HindⅢ位點(diǎn)和Apal位點(diǎn)之間5′未翻譯的區(qū)域是利用傳導(dǎo)消化/自身連接反應(yīng)來(lái)調(diào)整的)。
對(duì)于RE2(基因文庫(kù)附加號(hào)AF091890)來(lái)說(shuō)，進(jìn)行PCR的條件是在生產(chǎn)者提供的緩沖液體系中使用rTth DNA聚合酶(PerkinElmer)和作為模板的人腦cDNA，各引物為0.25μM,4種核苷酸均為0.2mM。循環(huán)條件是94℃1分分鐘、62℃1分分鐘、72℃1分30秒，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。5′PCR引物具有EcoRⅠ位點(diǎn)和序列5′-AGCGAATTCTGCCCACCCCACGCCGAGGTGCT-3′(SEQ.ID.NO.:20)，并且，3′引物含有BamHⅠ位點(diǎn)及序列5′-TGCGGATCCGCCAGCTCTTGAGCCTGCACA-3′(SEQ.ID.NO.:21)。然后，把兩片PCR產(chǎn)生的1.36kbPCR片段用BamHⅠ和EcoRⅠ消化，并克隆進(jìn)pCMV表達(dá)載體的EcoRⅠ-BamHⅠ位點(diǎn)。隨后確定了核酸序列(SEQ.ID.NO.:22)和氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:23)。
對(duì)于OGR1(基因文庫(kù)附加號(hào)U48405)來(lái)說(shuō)，進(jìn)行PCR的條件是在生產(chǎn)者提供的緩沖液體系中使用rTth DNA聚合酶(PerkinElmer)和作為模板的人類(lèi)基因組DNA，各引物為0.25μM,4種核苷酸均為0.2mM。循環(huán)條件是94℃1分分鐘、62℃1分分鐘、72℃1分20秒，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。5′引物具有HindⅢ位點(diǎn)和序列5′-GGAAGCTTCAGGCCCAAAGATGGGGAACAT-3′(SEQ.ID.NO.:24),3′引物含有BamHⅠ位點(diǎn)及序列5′-GTGGATCCACCCGCGGAGGACCCAGGCTAG-3′(SEQ.ID.NO.:25)。產(chǎn)生的1.14dbPCR片段用HindⅢ和BamHⅠ消化，并克隆進(jìn)pCMV表達(dá)載體的HindⅢ-BamHⅠ位點(diǎn)。隨后確定了核酸序列(SEQ.ID.NO.:26)和氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:27)。
對(duì)于GHSR來(lái)說(shuō)，進(jìn)行PCR的條件是在生產(chǎn)者提供的緩沖液體系中使用TaqPlus精密聚合酶(Stratagene)和作為模板的腦海馬區(qū)cDNA，各引物為0.25uM,4種核苷酸均為0.2mM。循環(huán)條件是94℃1分min、68℃1分min、72℃1分10秒，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。對(duì)于第一片PCR來(lái)說(shuō)，5′PCR引物序列為5′-ATGTGGAACGCGACGCCCAGCG-3′(SEQ.ID.NO.:40)并且，3′引物序列為5′-TCATGTATTAATACTAGATTCT-3′(SEQ.ID.NO.:41)。用兩微升第一片PCR作為模板產(chǎn)生第二片PCR，其中，激酶化用的5′引物序列為5′-TACCATGTGGAACGCGACGCCCAGCGAAGAGCCGGGGT-3′(SEQ.ID.NO.:42),3′引物具有序列5′-CGGAATTCATGTATTAATACTAGATTCTGTCCAGGCCCG-3′(SEQ.ID.NO.:43)。1.1kbPCR片段用EcoRⅠ消化，并克隆進(jìn)pCMV表達(dá)載體的平頭狀-EcoRⅠ位點(diǎn)。隨后確定了人類(lèi)GHSR的核酸序列(SEQ.ID.NO.:44)和氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:45)。
2．轉(zhuǎn)染程序第一天制好平板，使每150mm平板具有293細(xì)胞或293T細(xì)胞1×107。第二天準(zhǔn)備兩支反應(yīng)試管(各試管的比例與每個(gè)平板相應(yīng))制備的試管A中有混合了8-20μg DNA(如pCMV載體、帶有受體cDNA的pCMV載體、帶有GPCR融合蛋白的pCMV，在上部)的無(wú)DMEM(Irvine Scientific Irvine,CA)血清1-2ml,試管B中有混合了50-120μl的脂(質(zhì))轉(zhuǎn)染試劑(lipofectamine)(Gibeo BRL生產(chǎn))的無(wú)DMEM血清1-2ml，把試管A和試管B倒位(幾次)混合，隨后在室溫下溫育30-45分鐘。把該混合物用作“轉(zhuǎn)染混合物”。用1×PBS沖洗平板溫育的細(xì)胞，隨后加入無(wú)DMEM血清10-12ml，然后給細(xì)胞加上2.4ml的轉(zhuǎn)染混合物，接著在37℃15％CO2中溫育4小時(shí)。然后吸走轉(zhuǎn)染混合物，加上25mlDMEM/10％牛胎血清(Fetal Bovine Serum)，在37℃15％CO2條件下溫育細(xì)胞。
對(duì)于GPCR融合蛋白來(lái)說(shuō)，在上部的用量如下12μgDNA、2ml無(wú)DMEM血清、60μl脂(質(zhì))轉(zhuǎn)染試劑(lipofectamine)、293細(xì)胞9個(gè)，以及附加12ml無(wú)DMEM血清。實(shí)施例3GPCR的組織分布以人為例，對(duì)于某些孤獨(dú)受體來(lái)說(shuō)，區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)之處在于了解人類(lèi)中這類(lèi)受體或與疾病狀態(tài)有關(guān)的這類(lèi)受體的分布。但許多孤獨(dú)受體的這類(lèi)信息是未知的或?qū)⒉豢赡苤赖?。因此，?duì)這類(lèi)受體的理解可以為受體分布，這樣就能有機(jī)會(huì)對(duì)與特定組織相關(guān)疾病狀態(tài)或紊亂狀態(tài)有關(guān)的特定受體進(jìn)行預(yù)測(cè)，這種特定組織最好是這類(lèi)受體可以表達(dá)的組織。利用商業(yè)上使用的mRNA點(diǎn)斑格式，對(duì)各種組織類(lèi)型中內(nèi)源組成激活的GPCRs的分布進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
根據(jù)生產(chǎn)者的指導(dǎo)，使用Prime-Ⅰt ⅡTM Random Primer LabelingKit(Stratagene,#300385)，把受體的整個(gè)編碼區(qū)用于產(chǎn)生放射性同位素標(biāo)記探針。以GPR4為例，使用這種方式。
根據(jù)生產(chǎn)者的指導(dǎo)，把人類(lèi)RNA Marster BlotTMkit(Clontech,#7770-1)與本探針雜交，并在嚴(yán)格的條件下沖洗。在-80℃下過(guò)夜把印跡暴露到生物用放射性自顯影照相柯達(dá)膠片上(KodakBioMaxTMAutoradiography film)結(jié)果表示在圖3中。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，注意GPR4是通過(guò)各種類(lèi)型的胎兒組織(rowG)和非胎兒心臟(C1)及非胎兒肺(F1)表達(dá)出來(lái)的。這種方式很容易用于其它受體。實(shí)施例4GTP膜結(jié)合閃爍親近測(cè)定法當(dāng)一個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體處于激活態(tài)時(shí)，既可以是配體結(jié)合的結(jié)果也可以是組成激活的結(jié)果，受體結(jié)合到G蛋白上(在具有GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR、OGR1、RE2和ALO222171的情況下)并促進(jìn)GTP與該G蛋白的結(jié)合。這種三聚G蛋白受體復(fù)合物起GTP酶的作用，并且緩慢地把GTP水解為GDP，在GDP點(diǎn)位處受體一般是失活的。組成激活的受體不斷地把GTP交換成GDP。不能水解的GTP同系物[35S]GTPγS用于來(lái)證實(shí)[35S]GTPγS與具有表達(dá)組成激活受體膜增加的結(jié)合。用[35S]GTPγS結(jié)合來(lái)測(cè)定組成激活的優(yōu)勢(shì)在于(a)普遍適用于所有G蛋白受體；(b)接近膜表面不可能封閉影響胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的分子。
該測(cè)定法使用了G蛋白偶聯(lián)受體促進(jìn)[35S]GTPγS結(jié)合到表達(dá)相關(guān)受體膜上的能力。因此，這種測(cè)定法能被用于對(duì)已知孤獨(dú)受體及組成激活的G蛋白偶聯(lián)受體的候選化合物進(jìn)行篩選的直接鑒定方法中。該測(cè)定法是通用的，在所有G蛋白偶聯(lián)受體方面的藥物開(kāi)發(fā)都能使用。
測(cè)定的[35S]GTPγS在20mMHEPES、pH7.4的結(jié)合緩沖液中用12nM[35S]GTPγS和75μg膜蛋白(如293T細(xì)胞表達(dá)GPR3)及1μMGDP溫育1小時(shí)制得的。然后，加入麥胚凝集素玻珠(25μl,Amersham),并把該混合物在室溫下再溫育30分鐘。接著再把試管在室溫下用1500Xg離心5分鐘，然后在閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。
參照?qǐng)D4，與對(duì)照相比，GPR4被確定增加了活性，這種增加的活性并不是自分泌刺激的結(jié)果，因?yàn)檫@種數(shù)據(jù)是從制備的膜中獲得，而制備的整個(gè)細(xì)胞則沒(méi)有增加活性。實(shí)施例5受體同源性確定在證實(shí)GPR3是一種組成激活的受體后，使用商用程序DNAStar對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)(基因文庫(kù))中有用的偶聯(lián)G蛋白進(jìn)行同源性研究，證實(shí)了GPR6和GPR12是兩個(gè)高度同源受體(參見(jiàn)圖5A)，這兩個(gè)受體均為孤獨(dú)受體。雖然這些受體的序列是已前“已知的”(即它們?cè)跀?shù)據(jù)庫(kù)中能找到)，但并不知道這兩個(gè)受體的內(nèi)源形式是組成激活的(參見(jiàn)實(shí)施例6，圖7)。因此，在配體未知或還沒(méi)有被鑒定的情況下，不會(huì)有理由來(lái)研究把這類(lèi)受體在藥物開(kāi)發(fā)方案中使用，正因?yàn)槿绱耍_(kāi)發(fā)藥物的傳統(tǒng)方式可能至多是毫無(wú)意義地或更可能無(wú)關(guān)地找出GPR3、GPR6和GPR12的同源性。實(shí)施例6組成激活同源受體的分析雖然在現(xiàn)有技術(shù)中使用表達(dá)蛋白質(zhì)的各種細(xì)胞，但最好是使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞。主要原因是基于實(shí)踐，即利用，以表達(dá)GPCR的酵母細(xì)胞為例，雖然可以引入這種擬定的非哺育乳動(dòng)細(xì)胞，這種細(xì)胞可能不包含(的確，在酵母中是沒(méi)有的)偶聯(lián)受體的一般機(jī)制和用哺育乳動(dòng)物體系推導(dǎo)的信使通道，因此，從非哺乳動(dòng)物細(xì)胞獲得的結(jié)果，雖然有潛在的使用價(jià)值，但不如從哺乳動(dòng)物細(xì)胞獲得的結(jié)果可靠。尤其是使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞COS-7、293和293T細(xì)胞，盡管使用的這種特異性哺乳動(dòng)物細(xì)胞可能是根據(jù)制作者的特殊需要制作的。
1．GPR3、GPR6和GPR12的分析為了產(chǎn)生具有多個(gè)Gal4位點(diǎn)的β-半乳糖苷酶，從啟動(dòng)子中含有質(zhì)粒1.4(5×Gal)CAT(Leonard,J.等(1992)PNAS USA 89:6247-625)的促生長(zhǎng)素抑制劑中取出BglⅡ/HindⅢ片段，并克隆進(jìn)pβgal-Basic(Promega)。BglⅡ/HindⅢ片段含有最小促生長(zhǎng)素抑制啟動(dòng)子(從-71bp至+50bp相關(guān)轉(zhuǎn)錄開(kāi)始點(diǎn))，其中用酵母轉(zhuǎn)錄因子Gal4識(shí)別序列的5個(gè)拷貝取代了cAMP反應(yīng)元件(Response Element)的核4bp。當(dāng)這種報(bào)告因子與編碼Gal4-CRFB融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒共同被轉(zhuǎn)錄時(shí)，高度適應(yīng)于增加cAMP信息通道的介質(zhì)。
細(xì)胞系VIP2.0Zc是用報(bào)告基因β-半乳糖苷酶在cAMP適應(yīng)VIP啟動(dòng)子(Konig,等，Mol.Cell.Neuro.1991,2,331-337)的控制下穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的。這里使用該細(xì)胞系間接測(cè)定胞內(nèi)cAMP的積累。在轉(zhuǎn)染前當(dāng)天，在6cm平板中平板培養(yǎng)出約2百萬(wàn)細(xì)胞。每個(gè)受體DNA(5μg)混合有2.5ml含200μg/mlDEAE葡聚糖和100μM氯喹無(wú)血清的DMEM，并加到漂洗過(guò)的單層細(xì)胞中。在CO2溫育箱中溫育90分鐘后，除掉轉(zhuǎn)染基質(zhì)。用無(wú)血清的基質(zhì)沖洗細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，把細(xì)胞再放進(jìn)96孔平板中平板培養(yǎng)，每孔密度50-100K，并且在轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)內(nèi)測(cè)定β-半乳糖苷酶活性。
在測(cè)定緩沖液中含有1000mM磷酸鈉、2mM、MgSO4、0.1mMMnCl2,pH8.0。用PBS沖洗細(xì)胞，并加入由0.1×測(cè)定緩沖液構(gòu)成的25μl/孔的低滲裂解緩沖液。10分鐘后，每孔中加入含有0.5％TritonX-100和40mMβ-巰基乙醇的測(cè)定緩濁液100μl，并在室溫下溫育持續(xù)10分鐘。加入底物溶液25μl/孔，在測(cè)定緩沖液中的該底物溶液是含有5mg/ml氯酚紅-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)，把平板在37℃下溫育30分鐘后，用平板閱讀儀測(cè)定595nm下的吸光度。
使用前述體系對(duì)GPR3、GPR6和GPR12進(jìn)行測(cè)定，并確定了GPR6和GPR12均是組成激活的。參見(jiàn)圖6A。
2．對(duì)GPR21和ALO22171的分析把293細(xì)胞和293T細(xì)胞在96孔平板上制成密度為每孔2×104個(gè)細(xì)胞的平板，并進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使用脂轉(zhuǎn)染劑Regent(BRL)，持續(xù)天數(shù)按生產(chǎn)者的指示進(jìn)行。用于每6孔轉(zhuǎn)染的DNA/類(lèi)脂混合物的制備為把具有260ng質(zhì)粒DNA的100μl DMEM與具有2μl類(lèi)脂的100μlDMEM均勻混合(260ng質(zhì)粒DNA是由200ng8×CRE-Lue報(bào)告質(zhì)粒、50ng pCMV和10ng表達(dá)質(zhì)粒GPRS(在pcDNA中的GPRS(Invitrogen))構(gòu)成，pCMV包括內(nèi)源受體、非內(nèi)源受體或獨(dú)立的pCMV。8×CRE-Lue報(bào)告質(zhì)粒的制備為通過(guò)克隆pβgal-Basic載體(Ckontech)中BglⅤ-HindⅢ位點(diǎn)的鼠促生長(zhǎng)素抑制劑啟動(dòng)子(-71/+51)獲得載體SRIF-β-gal，通過(guò)PCR從腺病毒模板AdpCF126CCRE8(參見(jiàn)7 Human GeneTherapy 1883(1996))獲得8個(gè)拷貝的cMAP反應(yīng)元件，并在Kpn-BgalⅤ位點(diǎn)克隆進(jìn)SRIF-β-gal載體，產(chǎn)生8×CRE-β-gal報(bào)告載體。用從pGL3-basic載體(Promega)HindⅢ-BamHⅠ位點(diǎn)獲得的熒光素酶基因取代8×CRE-β-gal報(bào)告載體中的β-半乳糖苷酶基因，產(chǎn)生8×CRE-β-Lue報(bào)告質(zhì)粒。隨后，在室溫下溫育30分鐘，用400μl DMEM稀釋該DNA/脂類(lèi)混合物，并在每孔中加入稀釋過(guò)的混合物。在細(xì)胞培養(yǎng)溫育器中溫育4小時(shí)后在每孔中加入100μl帶有10％FCS的DMEM。把經(jīng)過(guò)一天轉(zhuǎn)染的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橛?00μl/孔帶有10％FCS的DMEM處理。8小時(shí)后，用PBS沖洗，各孔再轉(zhuǎn)變?yōu)橛?00μl/孔帶有10％FCS無(wú)酚紅的DMEM處理。第二天，使用LucLiteTM報(bào)告基因測(cè)定試劑盒(Packard)，按照生產(chǎn)者的指示，測(cè)定熒光素酶活性，在1450MicroBetaTM閃爍發(fā)光計(jì)數(shù)器(Wallac)上讀取數(shù)據(jù)。結(jié)果總結(jié)在圖6B和6C中。
使用前述體系對(duì)GPR21和ALO22171進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)結(jié)果確定了GPR21和ALO22171在其內(nèi)源形態(tài)中均是組成激活的，參見(jiàn)圖6B和6C。
3．對(duì)GPR4、RE2、OGR1和GHSR的分析在此使用規(guī)定的方案，分析確定了GPR4、RE2、OGR1和GHSR均為內(nèi)源型組成激活的類(lèi)型(未示出數(shù)據(jù))。實(shí)施例7GPR3、GPR6和GPR12的組織分布使用下列引物，采用比較RT-PCR對(duì)用于表達(dá)這些孤獨(dú)受體的組織樣品進(jìn)行檢測(cè)GPR3:
5′-CTGGTCCTGCACTTTGCTGC-3′(SEQ.ID.NO.:28)5′-AGCATCACATAGGTCCGTGTCA-3′(SEQ.ID.NO.:29)這些引物的擴(kuò)增片段為194bp。
GPR6:
5′-ACCAGAAAGGGTGTGGGTACACTG-3′(SEQ.ID.NO.:30)5′-GGAACGAAAGGGCACTTTGG-3′(SEQ.ID.NO.:31)這些引物的擴(kuò)增片段為249bp。
GPR12:
5′-GCTGCCTCGGGATTATTTAG-3′(SEQ.ID.NO.:32)5′-GCCTATTAGCAGGAACATGGGTG-3′(SEQ.ID.NO.:33)這些引物的擴(kuò)增片段為220bp。
這些擴(kuò)增子被設(shè)計(jì)為有相同的Tm′s而沒(méi)有重疊，即它們之間沒(méi)有相同的序列，以便每個(gè)引物對(duì)都能在相同的最適退火溫度下擴(kuò)增其各自的靶標(biāo)。這減少了一個(gè)引物對(duì)的擴(kuò)增子在多重復(fù)合反應(yīng)中扮演其它引物退火靶標(biāo)的機(jī)會(huì)，因此，減少了其它引物對(duì)干擾的機(jī)會(huì)。
使用TRIzolTMReagent(Gibco/BRL)，按照生產(chǎn)者的指示，從組織樣品(人類(lèi))中提取總RNA。使用2mg總RNA和一個(gè)First-strandTMcDNA合成試劑盒(Pharmacia)制得cDNA。然后把該cDNA樣品按13用H2O稀釋?zhuān)容^PCR在[32p]dCTP存在的情況下按已說(shuō)明過(guò)的方式(Jensen,J.等人(1996)J.Biol.Chem.271:187490)制備。所有反應(yīng)都包括有SPI-特異性引物，該引物擴(kuò)增一個(gè)300bp的片段，用于內(nèi)部控制。總之，使用引物，在限定的PCR條件下(1個(gè)循環(huán)95℃5分鐘；23個(gè)循環(huán)95℃30秒，58℃30秒，75℃1分鐘；1個(gè)循環(huán)72℃10分鐘)得到組成可靠質(zhì)量精確的結(jié)果。進(jìn)一步證實(shí)了在多重復(fù)合時(shí)被選擇的引物對(duì)彼此并不干擾。用變性凝膠電脈(7M脲，5％聚丙烯酰胺(LongRangerTMSolution,AT Biochemical,0.6XTBE)對(duì)PCR產(chǎn)品進(jìn)行顯色，隨后進(jìn)行放射性自顯影照相。
圖7A、7B和7C表示人類(lèi)組織中GPR3、GPR6和GPR12的分布。這種信息可以用于評(píng)價(jià)與這類(lèi)組織有關(guān)的疾病狀況，并且確定在主要表達(dá)組織中的特異性區(qū)域，因此，可以確定這種受體表達(dá)與特殊疾病狀態(tài)的關(guān)系。然后，依次可以直接鑒定沖擊這類(lèi)受體的化合物，而不需要認(rèn)識(shí)和了解這類(lèi)受體的內(nèi)源配體。根據(jù)RT-PCR分析(圖8)證明，與對(duì)照相比，進(jìn)一步的篩選表明了GPR3更高水平地表達(dá)在人類(lèi)癲癇組織樣品中(組織來(lái)源顳皮層)。實(shí)施例8A功能分析-GPR6(原位分析)在海馬中GPR6的分布說(shuō)明可能會(huì)涉及進(jìn)食行為。因此，進(jìn)行這種受體的功能分析。進(jìn)行的原位分析如下1．探針設(shè)計(jì)從被克隆進(jìn)pBluescriptSK+中HindⅢ-Smal位點(diǎn)的GPR6受體的450bp HindⅢ-Smal片段制得GPR6探針。核糖探針是使用T7轉(zhuǎn)錄體系在標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記反應(yīng)中制得的，標(biāo)記反應(yīng)的構(gòu)成為1μg線型質(zhì)粒、2μl5×轉(zhuǎn)錄緩沖液、125μCi35S-UTP、150μM的GTP、CTP及ATP,12.5mM的dithiothreitol、20U的核糖核酸酶抑制劑和6U的適當(dāng)聚酯酶。反應(yīng)在37℃下進(jìn)行90分鐘，被標(biāo)記的探針從無(wú)核苷酸的交聯(lián)葡聚糖(Sephadex)G-50自旋柱分離出來(lái)。
2．組織制備把未切割的組織在異戊烷中冷凍到-42℃，隨后在恒溫器上保持-20℃進(jìn)行切片前，在-80℃貯藏。然后把放在載玻片上的組織切片在-80℃貯存。
3．原位雜交方案把組織切片從-80℃的冷凍機(jī)中取出，用1μg/ml的蛋白酶-K溶液溫育透化組織和鈍化內(nèi)源核糖核酸酶。這種處理后，把切片在水中(1分鐘)、0.1M三乙胺中(pH8.0,1分鐘)和在具有0.25％的醋酸酐的0.1M三乙胺中(10分鐘)連續(xù)溫育。然后，把組織在2×SSC(0.3mMNaCl,0.03nM的檸檬酸鈉，pH7.2；5分鐘)沖洗，并通過(guò)梯度濃度乙醇脫水。然后，在含有75％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸酯、3×SSC、50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)、1×Denhart溶液、0.1mg/ml酵母tRNA和0.1mg/ml剪切的鮭精DNA的雜交緩沖液20μl中把切片與1.5×106dpm[35S]UTP-標(biāo)記的cRNA探針雜交。用蓋玻片蓋上組織切片，該蓋玻片是用橡膠粘結(jié)劑密封的。在50℃使載玻片溫育過(guò)夜。在第二天去掉橡膠粘結(jié)劑，把蓋玻片用2×SSC浸泡，用鮮2×SSC溶液把組織切片沖洗10分鐘。通過(guò)在37℃核糖核苷酸酶200μg/ml溶液中溫育切片30分鐘，除去未雜交的帶有內(nèi)源mRNAs單個(gè)鏈結(jié)的探針。然后，把組織用嚴(yán)格增加的SSC溶液(2×、1×和0.5×SSC，各10分鐘)沖洗，隨后在60℃用0.5×SSC沖洗1小時(shí)。在本次最終沖洗后，用梯度濃度乙醇使組織切片脫水，用空氣干燥后，備好在Kodak XAR-5膠片上用X射線自顯影照相進(jìn)行測(cè)定。
4．分析在正常雄鼠(Sprague-Dawley,Charles River)上使用上述方案，確定了GPR6是在腦部下列區(qū)域表達(dá)的下丘腦、海馬、伏隔核、尾狀核和腦皮層。參見(jiàn)圖9A表示的組織切片(GPR6受體處在暗區(qū)，圖9B提供了鼠腦的參照?qǐng)D)。
假定GPR6是在與進(jìn)食有關(guān)腦區(qū)高水平表達(dá)的，用上述的方案在型和胖型雄性Zucker鼠(Charles River)進(jìn)行了原位雜交分析。正如現(xiàn)有技術(shù)所鑒別的，Zucker動(dòng)物一般進(jìn)食表現(xiàn)為型和胖型。圖10A提供了GPR6在型Zucker動(dòng)物中表達(dá)的典型組織切片，圖10B提供了GPR6在胖型Zucker動(dòng)物中表達(dá)的典型組織切片，圖10C是鼠腦切片的參照?qǐng)D。這些結(jié)果證實(shí)內(nèi)源組成激活的孤獨(dú)受GPR6在胖型中是相對(duì)過(guò)度表達(dá)的。實(shí)施例8B功能分析-GPR12(原位分析)對(duì)GPR12進(jìn)行的原位分析如下1．探針設(shè)計(jì)從被克隆進(jìn)pBluescriptSK+中HindⅢ-BamHⅠ位點(diǎn)的鼠GPR12受體的515bp HindⅢ-BamHⅠ片段制得GPR12探針。核糖探針是使用T3/T7轉(zhuǎn)錄體系在標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記反應(yīng)中制得的，標(biāo)記反應(yīng)的構(gòu)成為1μg線型質(zhì)粒、2μl 5×轉(zhuǎn)錄緩沖液、125μCi35S-UTP、150μM的GTP、CTP及ATP，12.5mM的dithiothreitol、20U的核糖核酸酶抑制劑和6U的適當(dāng)聚酯酶。反應(yīng)在37℃下進(jìn)行90分鐘，被標(biāo)記的探針從無(wú)核苷酸的交聯(lián)葡聚糖(Sephadex)G-50自旋柱分離出來(lái)。
2．組織制備把未切割的組織在異戊烷中冷凍到-42℃，隨后在恒溫器上保持-20℃進(jìn)行切片前，在-80℃貯藏。把放在載玻片上的組織切片在-80℃貯存。
3．原位雜交方案把組織切片從-80℃的冷凍機(jī)中取出，用1μg/ml的蛋白酶-K溶液溫育透化組織和鈍化內(nèi)源核糖核酸酶。這種處理后，把切片在水中(1分鐘)、0.1M三乙胺中(pH8.0,1分鐘)和在具有0.25％的醋酸酐的0.1M三乙胺中(10分鐘)連續(xù)溫育。然后，把組織在2×SSC(0.3mMNaCl,0.03nM的檸檬酸鈉，pH7.2；5分鐘)沖洗，并通過(guò)梯度濃度乙醇脫水。然后，在含有75％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸酯、3×SSC、50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)、1×Denhart溶液、0.1mg/ml酵母tRNA和0.1mg/ml剪切的鮭精DNA的雜交緩沖液20μl中把切片與1.5×106dpm[35S]UTP-標(biāo)記的cRNA探針雜交。用蓋玻片蓋上組織切片，該蓋玻片是用橡膠粘結(jié)劑密封的。在50℃使載玻片溫育過(guò)夜。在第二天去掉橡膠粘結(jié)劑，把蓋玻片用2×SSC浸泡，用鮮2×SSC溶液把組織切片沖洗10分鐘。通過(guò)在37℃核糖核苷酸酶200μg/ml溶液中溫育切片30分鐘，除去未雜交的帶有內(nèi)源mRNAs單個(gè)鏈結(jié)的探針。然后，把組織用嚴(yán)格增加的SSC溶液(2×、1×和0.5×SSC，各10分鐘)沖洗，隨后在60℃用0.5×SSC沖洗1小時(shí)。在本次最終沖洗后，用梯度濃度乙醇使組織切片脫水，用空氣干燥后，備好在KodakXAR-5膠片上用X射線自顯影照相進(jìn)行測(cè)定。
4．分析在正常雄性鼠(Sprague-Dawley,Charles River)上使用上述方案，確定了GPR12是在腦部下列區(qū)域表達(dá)的海馬(特別是在CA3區(qū)、CA4區(qū)和齒狀腦回區(qū)；腦皮層的外層；以及杏仁狀核區(qū)-現(xiàn)有技術(shù)中已知的與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)重要區(qū)域的所用區(qū)域)和丘腦中繼核，包括外側(cè)膝狀核、內(nèi)側(cè)膝狀核和外側(cè)乳狀核(與外部中繼功能如視覺(jué)和聽(tīng)覺(jué)有關(guān)的區(qū)域)。參見(jiàn)圖11A-F表示的組織切片(GPR12受體處在暗區(qū))。實(shí)施例8C功能分析-GPR6與進(jìn)食-行為受體共位(原位分析)人類(lèi)食欲素受體OX1R，主要是孤獨(dú)受體GPCR(a.k.a.,“HFGAN72”)，已證實(shí)是在腦中外側(cè)下丘腦區(qū)，并且推測(cè)是與進(jìn)食行為的調(diào)節(jié)有關(guān)。Sakurai,T.等92(4)Cell 573(1998)。正如Sakurai中引用的，“對(duì)食欲素受體的直接藥物干涉最引人注目的是對(duì)與能量體內(nèi)平衡有關(guān)疾病新治療的研究，這類(lèi)疾病如肥胖癥和糖尿病”，Id at582。已被鑒定的黑皮質(zhì)素-3受體(MC-3)Gantz,I.等，268(11)J.Biol.Chem.8246(1993)，是與能量體內(nèi)平衡有關(guān)的類(lèi)似物。
了解與能量體內(nèi)平衡的調(diào)節(jié)與失調(diào)有關(guān)的神經(jīng)通道的重要性在于區(qū)別主要的細(xì)微差異是合理藥物計(jì)設(shè)的關(guān)鍵。僅僅影響一個(gè)受體，尤其是與受體通道更相關(guān)的“下游”受體，會(huì)導(dǎo)致時(shí)間和資源的浪費(fèi)，最終結(jié)果是藥用化合物的開(kāi)發(fā)可能性極小，即使是對(duì)一種特定疾病狀態(tài)有實(shí)質(zhì)性沖擊。例如，菜普亭，雖然明顯地與能量體內(nèi)平衡的某些狀態(tài)有關(guān)，但至今，仍不能證明在肥胖癥藥用產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)上有使用機(jī)會(huì)。OX1和MC-3受體(以及其它黑皮質(zhì)素受體)也是以某種方式與能量體內(nèi)平衡有關(guān)，例如，如果這些受體在能量體內(nèi)平衡通道中，在其內(nèi)源形態(tài)上不是組成激活的就沒(méi)有效果，而如果有一個(gè)受體在內(nèi)源狀態(tài)中是組成激活的則效果很大，但按照傳統(tǒng)的受體“拮抗劑”方式進(jìn)行的藥物開(kāi)發(fā)可能會(huì)證明是無(wú)效的而不是多效的。根據(jù)定義，內(nèi)源組成激活受體能連續(xù)地傳送信號(hào)，而內(nèi)源非組成激活受體需要結(jié)合配體來(lái)傳送信號(hào)。因此，GPR6不但在內(nèi)源形態(tài)中是組成激活的，而且在肥胖型動(dòng)物模型中表現(xiàn)為顯著上調(diào)。即使利用受體拮抗劑使這些受體達(dá)到完全阻斷，GPR6的作用基本上超過(guò)了其它與能量體內(nèi)平衡相關(guān)受體，GPR6可以連續(xù)傳遞信號(hào)。因此，確定這些受體(以及在能量體內(nèi)平衡通道中的其它受體)是否在分離的神經(jīng)區(qū)內(nèi)共位對(duì)于提供用于藥物開(kāi)發(fā)更精確的受體目標(biāo)是很有用的。
上述說(shuō)明了對(duì)GPR6、OX1R和MC-3受體的原位雜交研究。對(duì)于GPR6來(lái)說(shuō)，如實(shí)例例7A所述，使用了原位探針，對(duì)于OX1R和MC-3來(lái)說(shuō)，探針是根據(jù)已出版的鼠序列制作的，并且分別大約為950bp和441bp。組織制備(正常鼠)和原位雜交基本與實(shí)施例8A相同。
結(jié)果表示在圖12(GPR6和OX1R)和圖13(GPR6和MC-3)中，GPR6雜交的使用了紅膜，而OX1R(圖12B)和MC-3(圖13B)雜交使用了綠膜。圖12C和12D(圖12A放大的版本)是由圖12A和12B的重疊產(chǎn)生的；桔色區(qū)(來(lái)自紅綠結(jié)合)是共位區(qū)。因此，在圖12C中，可以看到GPR6和OX1R在外側(cè)弓狀核和在腹內(nèi)側(cè)丘腦核的細(xì)胞亞區(qū)是共位的，外側(cè)弓狀核和在腹內(nèi)側(cè)丘腦核與能量體內(nèi)平衡通道有關(guān)。對(duì)圖13A(GPR6)和13B(MC-3)進(jìn)行類(lèi)似重疊證明了這些受體在外側(cè)弓狀核中基本是共位的。
現(xiàn)有技術(shù)認(rèn)為信息是連續(xù)傳送到與進(jìn)食行為有關(guān)神經(jīng)通道的。該通道的一個(gè)重要組件是神經(jīng)肽，這是與灰質(zhì)有關(guān)肽(AGRP)，有時(shí)稱(chēng)為與灰質(zhì)有關(guān)轉(zhuǎn)錄(ART)。AGRP的表達(dá)大大限制了弓狀核(見(jiàn)Flier,J.S.和Marators-Flier,E.以及其中的圖1)。產(chǎn)生AGPR的細(xì)胞也產(chǎn)生神經(jīng)肽Y(NPY)。動(dòng)物研究已經(jīng)證明攝入AGPR和神經(jīng)肽(NPY)都會(huì)引起進(jìn)食行為和肥胖癥增加。已表明AGPR是黑皮質(zhì)素4(MC-4)受體的一種拮抗劑，并且已知這種MC-4受體拮抗劑會(huì)增加進(jìn)食行為和肥胖癥。因此，AGPR的出現(xiàn)涉及到至少兩條與進(jìn)食行為有關(guān)的通道。如下所述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GPR6受體在產(chǎn)生AGPR的細(xì)胞內(nèi)是共位的，根據(jù)下述實(shí)施例8中的結(jié)果，結(jié)合GPR6是一種內(nèi)源組成激活的GPCR的事實(shí)，很明顯，GPR6在某種方式上是系統(tǒng)的一種潛在“調(diào)節(jié)劑”-當(dāng)通過(guò)反義擴(kuò)增子(實(shí)施例9)減少GPR6受體的表達(dá)時(shí)，試驗(yàn)動(dòng)物的體重會(huì)極快速地下降，說(shuō)明GPR6調(diào)節(jié)著AGPR的表達(dá)。
不象上述“重疊”方式，使用Marks,D.L.等，3Mol.&Cell.Neuro.359(1992)中所述的方案對(duì)共位進(jìn)行評(píng)價(jià)。AGRP(把382bp的AGRPcDNA克隆進(jìn)Bluescript SK載體合成AGRPcRNA)與用放射性標(biāo)記的GPR6聯(lián)合進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩者在弓狀核中均是共位的(見(jiàn)圖4)。假定AGPR在體內(nèi)平衡中起作用，進(jìn)一步假定GPR6在其內(nèi)源狀態(tài)是組成激活的，那么從下面的實(shí)施例9得到的結(jié)果可能與這種幾乎直覺(jué)的資料是一致，可以用GPR6影響AGRP的程度來(lái)理解體重的顯著下降。實(shí)施例9功能分析-GPR6(活體分析GPR6反義)根據(jù)實(shí)施例7得出的結(jié)果，并且不用任何特珠的理論推測(cè)，只假定GPR6受體的表達(dá)會(huì)使inter alia、進(jìn)食行為、代謝、體重等減少，所以，使用反義寡核苷酸減少這種受體的表達(dá)，假定這類(lèi)動(dòng)物在功能性進(jìn)食行為和/或與進(jìn)食有關(guān)代謝方面是變化的。一般認(rèn)為這種假定的檢測(cè)類(lèi)同于給受體使用逆向激動(dòng)劑，逆向激動(dòng)劑可能會(huì)降低這類(lèi)受體的組成激活，類(lèi)同于減少受體本身的表達(dá)。注意這種方式結(jié)果是“獲得”受體，而不是“擊落”受體。即一般來(lái)說(shuō)，反義方式可減少約30％目標(biāo)蛋白的表達(dá)。
本研究中使用了16只成年雄性Sprague-Dawley鼠(Harlan,SanDiego)。在使用前使動(dòng)物在試驗(yàn)動(dòng)物園中適應(yīng)至少一周。把動(dòng)物放在屋中(兩組)掛著的塑料籠內(nèi)，其中裝有可隨意取得的食物和水。在手術(shù)前(確立基本體重)至少一天及整個(gè)研究過(guò)程中(評(píng)價(jià)處理效果)對(duì)動(dòng)物稱(chēng)重和進(jìn)行管理。籠中成對(duì)動(dòng)物的取食根據(jù)每天早晨再填滿(mǎn)食物前后稱(chēng)得進(jìn)食重量來(lái)測(cè)定。組類(lèi)包括反義(n=5)處理、錯(cuò)義(n=4)處理和無(wú)菌水(n=5)處理。
在戊巴比妥鈉阿奈西辛(60mg/kg)處理下進(jìn)行手術(shù)，必要是使用氟烷。用單插管(腦輸注試劑盒，Alza Pharmaceuticals)以外腹側(cè)(前囟，AP-1.0,Lat-1.5，自腦表面DV-3.8)為目標(biāo)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行腦功能區(qū)植入。通過(guò)軟管把插管進(jìn)口連接到滲透微泵(2001型，AlzaPharmaceuticals)的出口，根據(jù)生產(chǎn)者提供的說(shuō)明，皮下植入在肩片之間。
泵中有反義寡核苷酸5′-GsCAGCGTTCATCGCCGsC-3′(SEQ.ID.NO.:34反義)(這里的小“s”表示硫代磷酸鍵)或錯(cuò)義寡核苷酸5′-CsTGGACTGTATCGCCCCsG-3′(SEQ.ID.NO.:35錯(cuò)義)或無(wú)菌水載體。利用GenSet Corp合成的寡核苷酸，并用無(wú)菌水稀釋為2μg/μl。由于所用泵釋放1μg/小時(shí)，動(dòng)物接受量為反義寡核苷酸48μg/天或錯(cuò)義寡核苷酸24μl/天或無(wú)菌水24μl/天。在植入前在37℃無(wú)菌鹽水中溫育至少4小時(shí)，然后，再用泵植入。
手術(shù)后5天，用d-苯異丙胺硫酸鹽處理動(dòng)物，手術(shù)后6天，檢測(cè)基準(zhǔn)運(yùn)動(dòng)行為和苯異丙胺刺激的運(yùn)動(dòng)行為；手術(shù)后7天，把動(dòng)物無(wú)痛苦致死并迅速取下腦部冷凍，用于組織學(xué)分析。
把動(dòng)物從試驗(yàn)動(dòng)物園帶到實(shí)驗(yàn)室，放進(jìn)開(kāi)放式圍場(chǎng)(見(jiàn)下述)，對(duì)基準(zhǔn)活性測(cè)定30分鐘。30分鐘末，暫時(shí)把動(dòng)物移出圍場(chǎng)，注射d-苯異丙胺硫酸鹽(1.0mg/kgs.c.,用無(wú)菌鹽水稀釋?zhuān)籒ational Institute onDrug Abuse Drug Supply Program)，再立即放回圍場(chǎng)150分鐘。每間隔10分鐘測(cè)定運(yùn)動(dòng)行為，以便得出基準(zhǔn)活性苯異丙胺刺激活性隨時(shí)間變化。
對(duì)基準(zhǔn)運(yùn)動(dòng)行為和苯異丙胺刺激的運(yùn)動(dòng)行為測(cè)定是在San DiegoInstruments Flex Field System中進(jìn)行的，該體系由16″×16″×15″清潔有機(jī)玻璃開(kāi)放式圍場(chǎng)構(gòu)成的。圍繞開(kāi)放式的光電池列界面與采集數(shù)據(jù)的個(gè)人電腦相連。一列光電池在圍場(chǎng)地板上部2″處測(cè)定運(yùn)動(dòng)行為，第二列光電池在上部5″處測(cè)定后腿站立行為。計(jì)算機(jī)提供運(yùn)動(dòng)行為的各種測(cè)量，包括光電池總光片減弱、活動(dòng)時(shí)間、休息時(shí)間、運(yùn)動(dòng)距離、后腿站立總數(shù)、后腿站立花費(fèi)時(shí)間(未示出數(shù)據(jù))。在試驗(yàn)過(guò)程中，試驗(yàn)室用過(guò)頭頂?shù)陌谉霟襞莓a(chǎn)生的微弱光，用微弱噪聲模仿外界聲音。
結(jié)果列在圖15、16中。注意，在圖15中，接受反義寡核苷酸的動(dòng)物(“獲得”GPR6的動(dòng)物)體重下降明顯大于用錯(cuò)義寡核苷酸處理的動(dòng)物或?qū)φ仗幚淼膭?dòng)物。對(duì)于運(yùn)動(dòng)活性來(lái)說(shuō)，圖16的位置結(jié)果表明三組中基線和苯異丙胺刺激處理運(yùn)動(dòng)活性基本是相同的。實(shí)施例10GPCR融合蛋白制備制備內(nèi)源組成激活的GPCR-G蛋白的方案如下鼠G蛋白Gsα(長(zhǎng)型，Itoh,H.等，83 PNAS 3776(1986))的5′端和3′端均構(gòu)建為其上包括HindⅢ(5′-AAGCTT-3′)序列。下面證實(shí)正確序列(包括側(cè)位HindⅢ序列)，通過(guò)亞克隆利用載體的HindⅢ限制性位點(diǎn)把整個(gè)序列封密進(jìn)pcDNA3.1(-)(Invitrogen,cat.no.V795-20)。在亞克隆進(jìn)pcDNA3.1(-)后測(cè)定Gsα序列的正確順序。然后，對(duì)修飾過(guò)的在HindⅢ序列中含有鼠Gsα基因的pcDNA3.1(-)進(jìn)行變化，本受體現(xiàn)在可用作“universal”Gsa載體。peDNA3.1(-)載體在HindⅢ位點(diǎn)上游具有許多眾所周知的限制性位點(diǎn)，所以，其好處在于提供了在Gsα蛋白上游插入編碼內(nèi)源組成激活GPRS序列的能力。利用這種相同的方法也能創(chuàng)建其它“universal”G蛋白載體，當(dāng)然，利用其它商用載體或已知的特異性載體進(jìn)行反義的重要標(biāo)準(zhǔn)是GPCR序列在上游且G蛋白的序列符合讀框。
GPR3-Gsα融合蛋白結(jié)構(gòu)和GPR6-Gsα融合蛋白結(jié)構(gòu)的制作如下5′-gatcTCTAGAATGATGTGGGGTGCAGGCAGCC-3′(SEQ.ID.NO.:36正義)5′-ctagGGTACCCGGACATCACTGGGGGAGCGGGATC-3′(SEQ.ID.NO.:37反義)正義和反義引物分別含有限制性位點(diǎn)Xbal和Kpnl。對(duì)于GPR6來(lái)說(shuō)，引物如下5′-gatcTCTAGAATGCAGGGTGCAAATCCGGCC-3′(SEQ.ID.NO.:38正義)5′-ctagGGTACCCGGACCTCGCTGGGAGACCTGGAAC-3′(SEQ.ID.NO.:39反義)正義和反義引物也分別含有限制性位點(diǎn)Xbal和Kpnl。在pcDNA3.1(-)載體中這些限制性位點(diǎn)在HindⅢ位點(diǎn)的上游。
利用PCR以保證上述公開(kāi)Gsα通用載體中融合的各個(gè)受體序列，方案如下把GPR3和GPR6的100ng cDNAlk 2μl分別加入單個(gè)試管，試管中分別具有2μl(正義和反義)、3μl 10mMdNTPs、10μL10×TaqPlusTM精度緩沖液、1μLTaqPlusTM精度聚酯酶(Stratagene:#600211)和80μL水。GPR3的反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)為初期變性步驟是94℃5分鐘，每個(gè)循環(huán)為94℃30秒、55℃30秒、72℃2分鐘(對(duì)GPR3來(lái)說(shuō)，重復(fù)30次)。最后的延伸時(shí)間為72℃下10分鐘。對(duì)于GPR6來(lái)說(shuō)，初期變性步驟是96℃7分鐘，每個(gè)循環(huán)為96℃30秒、55℃30秒、72℃2分鐘，重復(fù)30次。GPR6最后的延伸時(shí)間為72℃下10分鐘。把GPR3和GPR6的PCR產(chǎn)品在1％瓊脂糖膠上電脈，然后純化(未示出數(shù)據(jù))。把每個(gè)純化的產(chǎn)品用Xbal和Kpnl(New England Biolabs)消化，并分離出想要插入的片段，純化，在各自的限制性位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)Gs通用載體。轉(zhuǎn)化和用限制性酶消化后分離出正克隆，并按后述方案使用293細(xì)胞完成表達(dá)。對(duì)GPR3:Gs-融合蛋白和GPR6:Gs-融合蛋白的每個(gè)正克隆測(cè)序，并用于對(duì)候選化合物的直接鑒定。
如上所述分析GPCR融合蛋白，并證實(shí)為組成激活的(未示出數(shù)據(jù))。實(shí)施例11方案用[35S]GTPγS對(duì)逆向激動(dòng)劑和激動(dòng)劑直接鑒定以作為逆向激動(dòng)劑為例，盡管我們利用內(nèi)源組成激活GPRs對(duì)候選化合物直接鑒定，但由于不了解其結(jié)合形態(tài)，內(nèi)部試驗(yàn)差異會(huì)更大。所以，使用了上述公開(kāi)的GPCR融合蛋白。我們已證實(shí)使用這類(lèi)蛋白內(nèi)部試驗(yàn)差異基本穩(wěn)定，從而獲得有效的信號(hào)/噪音比率。其好處是可以更好地對(duì)候選化合物進(jìn)行鑒定。
注意，重要的是使用孤獨(dú)受體得出的結(jié)果，正如使用此處公開(kāi)的技術(shù)得出的資料所示，可以直接鑒定候選化合物，這類(lèi)化合物是作為直接初選的逆向激動(dòng)劑、激動(dòng)劑和部分激動(dòng)劑調(diào)節(jié)該孤獨(dú)受體的，因此，此處公開(kāi)的方法明顯地足以可以在相同試驗(yàn)平板上對(duì)逆向激動(dòng)劑調(diào)節(jié)劑和激動(dòng)劑調(diào)節(jié)劑進(jìn)行直接鑒定。
1．制備細(xì)胞膜膜最內(nèi)側(cè)(參見(jiàn)實(shí)施例2和10)具有內(nèi)源組成激活孤獨(dú)受體GPCR融合蛋白，這種膜用于對(duì)作為逆向激動(dòng)劑、激動(dòng)劑和部分激動(dòng)劑的候選化合物進(jìn)行直接鑒定，其制備如下(a)材料刮膜緩沖液(Membrane Scrape Buffer)的構(gòu)成為20mMHEPES、10mMEDTA,pH7.4；洗膜緩沖液(Membrane Wash Buffer)構(gòu)成為20mM HEPES、0.1mMEDTA,pH7.4；結(jié)合緩沖液(BindingBuffer)的構(gòu)成為20mM HEPES、100mM NaCl和10mMMgCl2,pH7.4。
(b)制備過(guò)程在整個(gè)制備過(guò)程中把所有材料置于冰上。首先，從一個(gè)成片的單層細(xì)胞抽出基質(zhì)，用10ml冷PBS漂洗后，再進(jìn)行抽取。隨后，加上5ml刮膜緩沖液刮細(xì)胞，接著把細(xì)胞提取物轉(zhuǎn)移進(jìn)50ml離心管中(4℃,20,000rpm，離心17分)。隨后，取出上清液，給沉淀物加30ml洗膜緩沖液使沉淀再懸浮，隨后在4℃、20,000rpm條件下離心17分。然后，取出上清液，把沉淀物用結(jié)合緩沖液再懸浮。使用BrinkmanpolytronTM均漿器均漿(15-20秒爆發(fā)至所有材料均為懸浮狀)。該操作參見(jiàn)“Membrane Protein”。
2．Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定法均漿后用Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定法(蛋白質(zhì)可以稀釋為1.5mg/ml，等分，冷凍(-80℃)備用，冷凍后，操作如下在測(cè)定當(dāng)天，把冷凍的膜蛋白在室溫下緩慢解凍，旋渦后，用polytron在12×1000rpm約5-20秒進(jìn)行均漿。注意，多次制備應(yīng)當(dāng)把均漿器在不同制備均漿間完全清潔)。
(a)材料根據(jù)生產(chǎn)者的指導(dǎo)說(shuō)明(Biorad,cat.no.500-0006)，使用結(jié)合緩沖液(見(jiàn)上所述)、Bradford Dye Reagent(重染劑)、Bradford ProteinStandard(蛋白質(zhì)標(biāo)定)。
(b)操作程序準(zhǔn)備雙份試管，一試管具有膜，另一試管作為對(duì)照“空白”。每個(gè)試管中裝有800μl結(jié)合緩沖液。之后，在每個(gè)試管中加入10μlBradford Protein Standard(1mg/ml)，再在試管中加入10μl膜(空白中不加)。然后，每個(gè)試管中加入200μl Bradford Dye Reagent，再把每個(gè)試管渦旋。5分鐘后，對(duì)試管再渦旋，把材料轉(zhuǎn)移到樣品槽中。然后，用CECIL3041分光光度計(jì)在波長(zhǎng)595下對(duì)各槽讀數(shù)。
3．直接鑒定測(cè)定法(a)材料GDP緩沖液由37.5ml結(jié)合緩沖液和2mgGDP(Sigma,eat.no.G-7127)組成，用結(jié)合緩沖液進(jìn)行系列稀釋得到0.2μM GDP(每孔中GDP的最終濃度為0.1μM GDP)，每孔中有一種候選化合物，最終的200μl是由100μlGDP緩沖液(最終濃度為0.1μM GDP)、50μl含有膜蛋白的結(jié)合緩沖液和50μl含有[35S]GTPγS(0.6μM)的結(jié)合緩沖液(每10ml結(jié)合緩沖液有2.5μl[35S]GTPγS)。
(b)操作程序把候選化合物(Tripos,Inc.ST.Louis,MO)放入96孔平板(可以在-80℃冷凍過(guò))?；景涯さ鞍?或除去了融合蛋白的帶有表達(dá)載體的膜，如對(duì)照)均漿至為懸浮狀。然后，用Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定法如上所述測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。再把膜蛋白(和對(duì)照)用結(jié)合緩沖液(最后測(cè)定濃度為12.5μg/孔)稀釋至0.25mg/ml。隨后，給Wallac ScintistripTM(Wallac)的每個(gè)孔中加入100μlGDP緩沖液。然后用5μl注射器把5μl候選化合物轉(zhuǎn)移進(jìn)孔中(即5μl在200μl總測(cè)定量中的比例為1∶40，這樣候選化合物最終篩選濃度為10μM)。再次強(qiáng)調(diào)，為了避免污染，在每步轉(zhuǎn)移后都要把注射器用三種沖洗液沖洗，這三種沖洗液為水(1×)、乙醇(1×)和水(1×)至更多次，每次沖洗后用試驗(yàn)紙或Kimsipes紙巾擦干。然后，再給每孔加5μl膜蛋白(也可以使用沒(méi)有GPCR融合蛋白的膜作為對(duì)照)，在室溫下預(yù)溫5-10分鐘(用箔片襯托蓋住平板，其中從Trrpos獲得的候選化合物是光敏型的)。隨后，每孔中加入50ul含有[35S]GTPγS(0.6μM)的結(jié)合緩沖液，接著在室溫下振蕩器上搖合溫育60分鐘(再次強(qiáng)調(diào)，在這個(gè)實(shí)施例中是用箔片襯托蓋住平板)。然后，在22℃、4000RPM下自旋15分鐘停止測(cè)定。隨后用8道多頭管抽吸平板并用平板蓋密封平板。隨后，在Wallac1450上用“Prot.#37”讀取平板的數(shù)據(jù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于圖17A(GPR3:Gs融合蛋白)和圖17B(GPR6:Gs融合蛋白)中，其中，每個(gè)標(biāo)號(hào)表示含有一種不同候選化合物的孔，標(biāo)準(zhǔn)差用反應(yīng)百分率表示，是根據(jù)每板在虛線和垂直線的平均結(jié)果得出的。圖17A孔標(biāo)號(hào)C4的注解為本化合物是直接鑒定作為GPR3受體的逆向激動(dòng)劑的。圖17B孔標(biāo)號(hào)G7和H9的注解為這些化合物是分別直接鑒定作為GPR6受體的逆向激動(dòng)劑和激動(dòng)劑的。這兩種情況下，受體均為孤獨(dú)受體。
按照這種直接鑒定，可以確定IC50(逆向激動(dòng)劑)和EC50(激動(dòng)劑)的數(shù)據(jù)，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已經(jīng)認(rèn)識(shí)到可以選擇利用IC50和EC50測(cè)定方案。實(shí)施例12方案確認(rèn)試驗(yàn)如上所述在使用一種獨(dú)立的測(cè)定方法得到直接鑒定的候選化合物后，最好使用定性測(cè)定法。在這種情況下，建議確認(rèn)試驗(yàn)用環(huán)化酶基試驗(yàn)法。
按照下列方案，使用已有模式化的Flash PlateTM Adenylyl Cyclase試劑盒(New England Nuclear,Cat.No.SMP004A)，對(duì)直接鑒定作內(nèi)源組成激活受體GPCRs的逆向激動(dòng)劑和激動(dòng)劑的候選化合物進(jìn)行確認(rèn)。
在轉(zhuǎn)染后大約三天取出受轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在緩沖液中把懸浮細(xì)胞均漿制備膜，該緩沖液pH7.4并具有20mM HEPES和10μM MgCl2。使用Brinkman PolyreonTM在冰上進(jìn)行均漿約10秒。把產(chǎn)生的上清液在4℃、49,000×g下離心15分鐘。把沉淀物用pH7.4并具有20mM HEPES和0.1μM MgCl2的緩沖液再懸浮，接著，在4℃、49,000×g下離心15分鐘。在使用前可以把產(chǎn)生的沉淀物貯存在-80℃中。在直接鑒定篩選的當(dāng)天，把膜沉淀物在室溫下緩慢解凍，用pH7.4并具有20mM HEPES和10μM MgCl2的緩沖液再懸浮，最終蛋白質(zhì)濃度為0.60mg/ml(在使用前把再懸浮的膜放在冰上)。
根據(jù)生產(chǎn)者的指導(dǎo)說(shuō)明制備和保存cAMP標(biāo)定物和測(cè)定緩沖液(包括把2μCi示蹤劑[125I]cAMPl00μl加到11ml測(cè)定緩沖液中)。新制備篩選用試驗(yàn)緩沖液，其pH7.4并具有20mM HEPES、10μM MgCl2、20μM磷酸肌酸(Sigma)、0.1單位/ml肌酸磷酸激酶(Sigma)、50μMGTP(Sigma)和0.2μM ATP(Sigma)，使用前可以把試驗(yàn)緩沖液存放在冰上。
具有把如上所述的被鑒定的候選化合物(如果是冷凍的要在室溫下緩慢解凍)加在平板孔中(3μl/孔)，同時(shí)加入40μl膜蛋白(30μg/孔)和50μl試驗(yàn)緩沖液。然后把該混合液在室溫下均勻搖蕩溫育30分鐘。
之后，每孔加入100μl測(cè)定緩沖液，溫育2-24小時(shí)。然后，把平板放進(jìn)Wallac MicroBetaTM平板讀數(shù)器，采用“Prot.:#31”(按生產(chǎn)者的指導(dǎo)說(shuō)明)讀數(shù)。
雖然各種表達(dá)載體是現(xiàn)有技術(shù)中使用的，但最好使用載體pCMV。按照國(guó)際承認(rèn)用于專(zhuān)利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，把這種載體于1998年10月13日保存在美國(guó)典型培養(yǎng)物收集中心(American Type Culture Collection)(ATCC)(10801 UniversityBlvd.,Manassas,VA20110-2209 USA)。該載體經(jīng)ATCC試驗(yàn)是具有活性的。ATCC給定的保存號(hào)為pCMV:ATCC#203351。圖18給出了pCMV(包括限制性位點(diǎn))的圖譜。
特此指出，本發(fā)明是參考本專(zhuān)利文件中提到的各項(xiàng)專(zhuān)利、申請(qǐng)和打印出版物全部?jī)?nèi)容得出的。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，不脫離本發(fā)明的精神可以對(duì)本發(fā)明的最佳實(shí)施例進(jìn)行區(qū)別、各種變化及修飾。所有這類(lèi)變化都在本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的范圍內(nèi)。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人比漢，多米尼克P.(Behan,Dominic P.)查默斯，德里克T.(Chalmers，Derek T.)廖王蓁(Liaw,chen)林伊玲(Lin,I-Lin)洛斯，凱文P.(Lowitz,Kevin P.)陳若平(Chen,Ruoping)(ⅱ)發(fā)明名稱(chēng)內(nèi)源組成激活G蛋白偶聯(lián)孤獨(dú)受體(ⅲ)序列數(shù)45(ⅳ)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人(B)街道(C)城市(D)州(E)國(guó)家(F)郵政編碼(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S(B)申請(qǐng)日(C)分類(lèi)號(hào)(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名米歇爾P.斯特拉爾(Michael P.Straher)(B)注冊(cè)號(hào)38,325(ⅸ)電信信息
(A)電話(huà)(B)傳真(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:GGAGGATCCATGGCCTGGTTCTCAGC(3)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:CACAAGCTTAGRCCRTCCMGRCARTTCCA(4)SEQ ID NO:3信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:GGAGAAGCTTCTGGCGGCGATGAACGCTAG(5)SEQ ID NO:4信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:ACAGGATCCAGGTGGCTGCTAGCAAGAG(6)SEQ ID NO:5信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:CTTAAGCTTAAAATGAACGAAGACCCGAAG(7)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:GGAGGATCCCCAGAGCATCACTAGCAT(8)SEQ ID NO:7信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度530個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:GGAGGATCCA TGGCCTGGTT CTCAGCCGGC TCAGGCAGTG TGAATGTGAG CATAGACCCA 60GCAGAGGAAC CTACAGGCCC AGCTACACTG CTGCCCTCTC CCAGGGCCTG GGATGTGGTG120CTGTGCATCT CAGGCACCCT GGTGTCCTGC GAGAATGCTC TGGTGATGGC CATCATTGTG180GGCACGCCTG CCTTCCGCGC CCCCATGTTC CTGCTGGTGG GCAGCTTGGC CGTAGCAGAC240CTGCTGGCAG GCCTGGGCCT GGTCCTGCAC TTCGCTGCTG ACTTCTGTAT TGGCTCACCA300GAGATGAGCT TGGTGCTGGT TGGCGTGCTA GCAACGGCCT TTACTGCCAG CATCGGCAGC360CTGCTGGCCA TCACCGTTGA CCGCTACCTT TCCCTGTACA ACGCCCTCAC CTACTACTCA420GAGACAACAG TAACTCGAAC CTACGTGATG CTGGCCTTGG TGTGGGTGGG TGCCCTGGGC480CTGGGGCTGG TTCCCGTGCT GGCCTGGAAC TGCCGGGACG GTCTAAGCTT 530(9)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度601個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:AAGCTTCTGG CGGCGATGAA CGCTAGCGCC GCCGCGCTCA ACGAGTCCCA GGTGGTGGCA 60GTAGCGGCCG AGGGAGCGGC AGCTGCGGCT ACAGCAGCAG GGACACCGGA CACCAGCGAA120TGGGGACCTC CGGCAGCATC CGCGGCGCTG GGAGGCGGCG GAGGACCTAA CGGGTCACTG180GAGCTGTCTT CGCAGCTGCC CGCAGGACCC TCAGGACTTC TGCTTTCGGC AGTGAATCCC240TGGGATGTGC TGCTGTGCGT GTCGGGGACT GTGATCGCAG GCGAAAATGC GCTGGTGGTG300GCGCTCATCG CATCCACTCC CGCGCTGCGC ACGCCCATGT TTGTGCTCGT GGGTAGTCTG360GCCACTGCTG ACCTGCTGGC GGGCTGTGGC CTCATCCTAC ACTTCGTGTT CCAGTACGTG420GTGCCCTCGG AGACTGTGAG CCTGCTCATG GTGGGCTTCC TGGTGGCGTC CTTCGCCGCC480TCAGTCAGCA GCCTGCTCGC TATCACAGTG GACCGTTACC TGTCCCTTTA CAACGCGCTC540ACCTACTACT CGCGCCGGAC CCTGTTGGGC GTGCACCTCT TGCTAGCAGC CACCTGGATC600C601(10)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度510個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:AAGCTTAAAA TGAACGAAGA CCCGAAGGTC AATTTAAGCG GGCTGCCTCG GGACTGTATA 60GAAGCTGGTA CTCCGGAGAA CATCTCAGCC GCTGTCCCCT CCCAGGGCTC TGTTGTGGAG120TCAGAACCCG AGCTCGTTGT CAACCCCTGG GACATTGTCT TGTGCAGCTC AGGAACCCTC180ATCTGCTGTG AAAATGCCGT CGTGGTCCTT ATCATCTTCC ACAGCCCCAG CCTGCGAGCA240CCCATGTTCC TGCTGATAGG CAGCCTGGCT CTTGCAGACC TGCTGGCTGG TCTGGGACTC300ATCATCAATT TTGTTTTTGC CTACCTGCTT CAGTCAGAAG CCACCAAGCT GGTCACAATT360GGACTCATTG TCGCCTCTTT CTCTGCCTCT GTCTGCAGTT TGCTGGCTAT CACTGTGGAC420CGCTACCTCT CGCTGTATTA CGCCCTGACG TACCACTCCG AGAGGACCGT CACCTTTACC480(11)SEQ ID NO:10信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:CTTAAGCTTGTGGCATTTGGTACT(12)SEQ ID NO:11信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:TCTGGATCCTTGGCCAGGCAGTGGAAGT(13)SEQ ID NO:12信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:GAGAATTCAC TCCTGAGCTC AAGATGAACT(14)SEQ ID NO:13信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:CGGGATCCCC GTAACTGAGC CACTTCAGAT(15)SEQ ID NO:14信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1050個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:ATGAACTCCA CCTTGGATGG TAATCAGAGC AGCCACCCTT TTTGCCTCTT GGCATTTGGC 60TATTTGGAAA CTGTCAATTT TTGCCTTTTG GAAGTATTGA TTATTGTCTT TCTAACTGTA120TTGATTATTT CTGGCAACAT CATTGTGATT TTTGTATTTC ACTGTGCACC TTTGTTGAAC180CATCACACTA CAAGTTATTT TATCCAGACT ATGGCATATG CTGACCTTTT TGTTGGGGTG240AGCTGCGTGG TCCCTTCTTT ATCACTCCTC CATCACCCCC TTCCAGTAGA GGAGTCCTTG300ACTTGCCAGA TATTTGGTTT TGTAGTATCA GTTCTGAAGA GCGTCTCCAT GGCTTCTCTG360GCCTGTATCA GCATTGATAG ATACATTGCC ATTACTAAAC CTTTAACCTA TAATACTCTG420GTTACACCCT GGAGACTACG CCTGTGTATT TTCCTGATTT GGCTATACTC GACCCTGGTC480TTCCTGCCTT CCTTTTTCCA CTGGGGCAAA CCTGGATATC ATGGAGATGT GTTTCAGTGG540TGTGCGGAGT CCTGGCACAC CGACTCCTAC TTCACCCTGT TCATCGTGAT GATGTTATAT600GCCCCAGCAG CCCTTATTGT CTGCTTCACC TATTTCAACA TCTTCCGCAT CTGCCAACAG660CACACAAAGG ATATCAGCGA AAGGCAAGCC CGCTTCAGCA GCCAGAGTGG GGAGACTGGG720GAAGTGCAGG CCTGTCCTGA TAAGCGCTAT GCCATGGTCC TGTTTCGAAT CACTAGTGTA780TTTTACATCC TCTGGTTGCC ATATATCATC TACTTCTTGT 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Lys Pro Leu Thr Tyr Asn Thr Leu Val Thr Pro Trp130 135 140Arg Leu Arg Leu Cys Ile Phe Leu Ile Trp Leu Tyr Ser Thr Leu Val145 150 155 160Phe Leu Pro Ser Phe Phe His Trp Gly Lys Pro Gly Tyr His Gly Asp165 170 175Val Phe Gln Trp Cys Ala Glu Ser Trp His Thr Asp Ser Tyr Phe Thr180 185 190Leu Phe Ile Val Met Met Leu Tyr Ala Pro Ala Ala Leu Ile Val Cys195 200 205Phe Thr Tyr Phe Asn Ile Phe Arg Ile Cys Gln Gln His Thr Lys Asp210 215 220Ile Ser Glu Arg Gln Ala Arg Phe Ser Ser Gln Ser Gly Glu Thr Gly225 230 235 240Glu Val Gln Ala Cys Pro Asp Lys Arg Tyr Ala Met Val Leu Phe Arg245 250 255Ile Thr Ser Val Phe Tyr Ile Leu Trp Leu Pro Tyr Ile Ile Tyr Phe260 265 270Leu Leu Glu Ser Ser Thr Gly His Ser Asn Arg Phe Ala Ser Phe Leu275 280 285Thr Thr Trp Leu Ala Ile Ser Asn Ser Phe Cys Asn Cys Val Ile Tyr290 295 300Ser Leu Ser Asn Ser Val Phe Gln Arg Gly Leu Lys Arg Leu Ser Gly305 310 315 320Ala Met Cys Thr Ser Cys Ala Ser Gln Thr Thr Ala Asn Asp Pro TyrThr Val Arg Ser Lys Gly Pro Leu Asn Gly Cys His Ile340 345(17)SEQ ID NO:16信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:AGGAAGCTTT AAATTTCCAA GCCATGAATG(18)SEQ ID NO:17信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:ACCGAATTCA GATTACATTT GATTTACTAT G(19)SEQ IDNO:18信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1086個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:ATGAATGAAT CCAGGTGGAC TGAATGGAGG ATCCTGAACA TGAGCAGTGG CATTGTGAAT 60GTGTCCGAGC GTCACTCCTG CCCACTTGGA TTTGGCCACT ACAGTGTGGT GGATGTCTGC120ATCTTCGAGA CAGTGGTTAT TGTGTTGCTG ACATTTCTGA TCATTGCTGG GAATCTAACA180GTTATCTTTG TCTTTCATTG TGCTCCACTG TTACATCATT ATACTACCAG CTATTTCATT240CAGACGATGG CATATGCTGA TCTTTTCGTT GGAGTTAGCT GCTTGGTTCC TACTCTGTCA300CTTCTCCACT ACTCCACAGG TGTCCACGAG TCATTGACTT GCCAGGTTTT TGGATATATC360ATCTCAGTTC TAAAAAGTGT TTCTATGGCA TGTCTTGCTT GCATCAGTGT GGATCGTTAT420CTTGCAATAA CCAAGCCTCT TTCCTACAAT 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(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)(ⅱ)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(基因組的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:45:MWNATPSEEP GFNLTLADLD WDASPGNDSL GDELLQLFPA PLLAGVTATC VALFVVGIAGNLLTMLVVSR FRELRTTTNL YLSSMAFSDL LIFLCMPLDL VRLWQYRPWN FGDLLCKLFQFVSESCTYAT VLTITALSVE RYFAICFPLR AKVVVTKGRV KLVIFVIWAV AFCSAGPIFVLVGVEHENGT DPWDTNECRP TEFAVRSGLL TVMVWVSSIF FFLPVFCLTV LYSLIGRKLWRRRRGDAVVG ASLRDQNHKQ TVKMLAVVVF AFILCWLPFH VGRYLFSKSF EPGSLEIAQISQYCNLVSFV LFYLSAAINP ILYNIMSKKY RVAVFRLLGF EPFSQRKLST LKDESSRAWTESSINT
附錄AA2-杏仁狀核；A3-尾狀核；A4-小腦；A5-腦皮層；A6-前額皮層；A7-海馬；A8-延髓B1-枕骨皮層；B2-殼核；B3-黑質(zhì)；B4-顳皮層；B5-丘腦；B6-亞丘腦核；B7-脊髓C1-心臟；C2-主動(dòng)脈；C3-骨骼肌肉；C4-結(jié)腸；C5-膀胱，囊；C6-子宮；C7-前列腺；C8-胃，中腸D1-睪丸；D2-卵巢；D3-胰；D4-腦垂體，垂體脈；D5-腎上腺；D6-甲狀脈；D7-唾液脈；D8-乳脈E1-腎；E2-肝；E3-小腸；E4-脾；E5-胸脈；E6-周?chē)准?xì)胞，周?chē)籽颍籈8-淋巴節(jié)；E9-骨髓F1-扁桃體；F2-肺；F3-氣管；F4-胎盤(pán)G1-胎腦；G2-胎心；G3-胎腎；G4-胎肝；G5-胎脾；G6-胎胸腺；G7-胎肺
權(quán)利要求
1．一種對(duì)候選化合物進(jìn)行直接鑒定的方法，該化合物是作為內(nèi)源組成激活G蛋白偶聯(lián)孤獨(dú)受體的逆向激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑和激動(dòng)劑被選擇的，包括步驟(a)把候選化合物與GPCR融合蛋白接觸，所述的GPCR融合蛋白由內(nèi)源組成激活G蛋白偶聯(lián)孤獨(dú)受體和G蛋白構(gòu)成；(b)通過(guò)測(cè)定該化合物對(duì)所述被接觸受體的作用來(lái)確定是否所述的化合物是所述受體的逆向激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑或激動(dòng)劑。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于作為所述孤獨(dú)受體的逆向激動(dòng)劑的該化合物是直接被鑒定的。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于作為所述孤獨(dú)受體的激動(dòng)劑的該化合物是直接被鑒定的。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于作為所述孤獨(dú)受體的部分激動(dòng)劑的該化合物是直接被鑒定的。
5．一種混合物具有一種由權(quán)利要求2所述方法鑒定的化合物。
6．一種混合物具有一種由權(quán)利要求3所述方法鑒定的化合物。
7．一種混合物具有一種由權(quán)利要求4所述方法鑒定的化合物。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的孤獨(dú)受體選自GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、OGR1、GHSR、RE2和ALO22171。
9．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的孤獨(dú)受體是GPR6。
10．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述G蛋白選自Gs、Gi、Gq和Go。
11．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所G蛋白是Gsα。
12．一種對(duì)候選化合物進(jìn)行直接鑒定的方法，該化合物是作為內(nèi)源組成激活G蛋白偶聯(lián)孤獨(dú)受體的逆向激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑和激動(dòng)劑被選擇的，包括步驟(a)把一種候選化合物與GPCR融合蛋白接觸，所述的GPCR融合蛋白是由內(nèi)源組成激活G蛋白偶聯(lián)孤獨(dú)受體和Gsα蛋白構(gòu)成；(b)通過(guò)測(cè)定該化合物對(duì)所述被接觸受體的作用來(lái)確定是否所述的化合物是所述受體的逆向激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑或激動(dòng)劑。
13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述的孤獨(dú)受體選自GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、OGR1、GHSR、RE2和ALO22171。
14．根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述的孤獨(dú)受體是GPR6。
15．根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述化合物是直接被鑒定作為一種逆向激動(dòng)劑和一種激動(dòng)劑的被選化合物。
16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于所述化合物是一種逆向激動(dòng)劑。
17．一種混合物具有權(quán)利要求16所述的化合物。
18．一種用于模擬G蛋白偶聯(lián)孤獨(dú)受體的方法包括把所述受體與用權(quán)利要求1所述方法鑒定的一種化合物接觸。
19．一種用于模擬G蛋白偶聯(lián)孤獨(dú)受體的方法包括把所述受體與用權(quán)利要求12所述方法鑒定的一種化合物接觸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了直接鑒定候選化合物的技術(shù),該化合物作為對(duì)內(nèi)源組成激活的G蛋白偶聯(lián)孤獨(dú)受體的激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑和/或最適合的逆向激動(dòng)劑。這種直接鑒定的化合物最適合應(yīng)用于藥物中。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1323396SQ99812265
公開(kāi)日2001年11月21日 申請(qǐng)日期1999年7月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月31日
發(fā)明者多米尼克·P·比漢, 德里克·T·查默斯, 廖王蓁, 林伊玲, 凱文·洛斯, 陳若平 申請(qǐng)人:阿瑞那制藥公司