專利名稱：棉花高強(qiáng)纖維基因主效基因位點(diǎn)及其分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開(kāi)了棉花高強(qiáng)纖維基因主效基因位點(diǎn)及其分子標(biāo)記，屬于新基因資源的發(fā)掘及利用方法。專用于快速棉花纖維比強(qiáng)度的分子標(biāo)記輔助選擇，開(kāi)展棉花纖維品質(zhì)的分子育種、生產(chǎn)與品質(zhì)檢測(cè)。
(二)技術(shù)背景棉纖維是重要的紡織工業(yè)原料，隨著紡織技術(shù)的不斷革新以大力降低成本提高紡織效率，氣流轉(zhuǎn)子紡、噴氣紡和摩擦紡技術(shù)正迅速淘汰老式環(huán)錠紡技術(shù)，這些新的紡織技術(shù)由于不能充分利用棉纖維的內(nèi)在品質(zhì)潛力，對(duì)纖維品質(zhì)則有更高的要求。因此迫切需要迅速提高我國(guó)棉花纖維品質(zhì)。近15年來(lái)我國(guó)自育的棉花品種產(chǎn)量略高于美國(guó)，但纖維品質(zhì)則有些差距。我國(guó)當(dāng)家品種的纖維品質(zhì)中等，基本能滿足紡織工業(yè)的要求，但品質(zhì)單一，纖維強(qiáng)度偏低，紡高支紗的優(yōu)質(zhì)棉需大量進(jìn)口(項(xiàng)時(shí)康等，1999，論我國(guó)棉花質(zhì)量現(xiàn)狀，棉花學(xué)報(bào)，11(1)1-10)。我國(guó)的棉花育種工作者為了提高棉花纖維內(nèi)在品質(zhì)，做了大量研究，但進(jìn)展緩慢一方面是因?yàn)槿狈Υ笈績(jī)?yōu)質(zhì)纖維的基因資源，同時(shí)也由于纖維品質(zhì)與產(chǎn)量存在較大的負(fù)相關(guān)，培育的品系產(chǎn)量普遍較常規(guī)推廣品種低一成以上，都未能在生產(chǎn)上推廣種植。
美國(guó)棉花品質(zhì)育種的研究已有50多年的歷史。Culp等人從1946年開(kāi)始PD種質(zhì)改良計(jì)劃，歷時(shí)40余年，發(fā)放了30多個(gè)種質(zhì)系和3個(gè)品種。這些種質(zhì)系或品種的纖維品質(zhì)，尤其是纖維強(qiáng)度較常規(guī)品種有較大的提高，產(chǎn)量達(dá)到推廣品種的水平。1982年以來(lái)，為適應(yīng)紡織工業(yè)設(shè)備的改造，美國(guó)加快了對(duì)棉花纖維品質(zhì)的改良。僅1982-1986年度鼓勵(lì)棉纖維強(qiáng)度育種的獎(jiǎng)金就高達(dá)560萬(wàn)美元。從1980年起，美國(guó)纖維比強(qiáng)度每年提高0.25g/tex，到1991年平均達(dá)到了21.7cN/tex。
要提高現(xiàn)有陸地棉品種的纖維品質(zhì)水平，首先要收集高強(qiáng)纖維種質(zhì)系作親本與現(xiàn)有高產(chǎn)推廣品種進(jìn)行一系列雜交和互交，以便打破強(qiáng)度與產(chǎn)量之間的負(fù)相關(guān)，但在每輪回交中，都要對(duì)纖維品質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，成本很高，而且要等到收花期結(jié)束一段時(shí)間后才能知道結(jié)果，而且，要求育種群體大，盲目性也大。因此，品質(zhì)育種的成本很高，難度較大，進(jìn)展緩慢。
分子標(biāo)記輔助選擇可以將傳統(tǒng)的表型選擇轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯舆x擇基因型，從而大大提高選擇效率。為了提高棉花纖維品質(zhì)育種的效率，從1994年起，美國(guó)已開(kāi)展了高強(qiáng)纖維的分子標(biāo)記研究。Jiang等利用海陸雜種F2群體識(shí)別出3個(gè)與比強(qiáng)度有關(guān)的QTLs，單個(gè)位點(diǎn)能解釋9.7％～13.3％的表型變異。Kohel等同樣在陸海雜種后代中找到4個(gè)QTLs與強(qiáng)度有關(guān)，單個(gè)位點(diǎn)的效應(yīng)在10.4～23.1％之間；利用陸地棉雜種群體，Shapply等找到了6個(gè)與強(qiáng)度有關(guān)的QTLs，Ulloa等找到了3個(gè)與比強(qiáng)度有關(guān)的QTLs，能解釋10.6～24.1％的變異。到目前為止，所發(fā)現(xiàn)單個(gè)QTL的效應(yīng)在9.7％～24.0％之間。

發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題 本發(fā)明棉花高強(qiáng)纖維基因主效基因位點(diǎn)及其分子標(biāo)記目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中品質(zhì)育種的成本很高，難度較大，進(jìn)展緩慢的缺陷，發(fā)掘出優(yōu)質(zhì)的纖維基因資源，為棉花的品質(zhì)育種提供基因資源和標(biāo)記輔助選擇的技術(shù)，從而大大提高高強(qiáng)纖維的選擇效率，盡快提高我國(guó)棉花品種的纖維品質(zhì)，并應(yīng)用于高強(qiáng)纖維棉花品種的生產(chǎn)與品質(zhì)檢測(cè)。
技術(shù)方案本發(fā)明所提供的棉花高強(qiáng)纖維基因主效基因位點(diǎn)，其特征在于主效基因位點(diǎn)QTLfs-2，有3個(gè)SSR標(biāo)記與之連鎖，由標(biāo)記NAU/SSR/FS130，NAU/SSR/FS2160，NAU/SSR/FS3160定位，分別為NAU/SSR/Fs1，用SSR1017引物可擴(kuò)增出130對(duì)核苷酸長(zhǎng)的DNA片段；NAU/SSR/Fs2，用SSR1122引物可擴(kuò)增出160對(duì)核苷酸長(zhǎng)的DNA片段；NAU/SSR/Fs3，用SSR1395引物可擴(kuò)增出160對(duì)核苷酸長(zhǎng)的DNA片段；該主效基因位點(diǎn)位于棉花第16染色體上，以加性和隱性遺傳效應(yīng)為主，在高強(qiáng)纖維種質(zhì)系HS427-10和遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1進(jìn)行雜交的F2群體中可解釋12.5％的表型變異，在HS427-10×TM-1的F2:3中可解釋16.9％的表型變異。
上述棉花高強(qiáng)纖維基因主效基因位點(diǎn)，是通過(guò)以下方法獲得標(biāo)記定位的1)選出純合穩(wěn)定的陸地棉株系HS427-10，纖維強(qiáng)度42.3g/tex，纖維長(zhǎng)度32.6mm，纖維細(xì)度5.18，陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1，纖維強(qiáng)度31.33g/tex，纖維長(zhǎng)度30.7mm，纖維細(xì)度5.39；2)將株系HS427-10與TM-1進(jìn)行雜交，F(xiàn)1種子自交產(chǎn)生F2種子，用CTAB法提取F2分離群體的單株DNA，吐絮后，單株收花、取樣、進(jìn)行纖維品質(zhì)測(cè)定；3)檢驗(yàn)HS427-10×TM-1 F3株行中單株的纖維強(qiáng)度，以便用平均值來(lái)估算HS427-10×TM-1F2的單株水平；4)利用P1、P2、F1、F2和F2:3五世代的纖維品質(zhì)數(shù)據(jù)，采用主基因與多基因混合遺傳模型的多世代聯(lián)合分析的方法，估算棉纖維品質(zhì)的最適模型為多基因加性——顯性遺傳模型，所檢測(cè)的多基因以加性遺傳效應(yīng)為主，負(fù)向顯性；5)用487對(duì)SSR引物首先對(duì)HS427-10和TM-1親本的DNA多態(tài)性進(jìn)行初步分析，PCR反應(yīng)體積為10ul67mM of Tris-Hcl(PH8.8)，16mM(NH4)SO4，2.5mM of Mgcl2，0.2mM of dNTPs，0.6uM of primer，0.5 unit of Taqase和基因組DNA 20ng，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性2分鐘后，94℃變性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸60秒，循環(huán)35次，最后72℃延伸7分種；在PE9600擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在PAGE膠上電泳，然后銀染；分子標(biāo)記初步篩選結(jié)果表明，有37對(duì)SSR引物在雙親上有差異，將這37對(duì)引物分析182個(gè)F2分離單株，共獲得44個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，用MAPMAKER/EXP 3.0構(gòu)建HS427-10×TM-1F2群體的連鎖圖譜，共獲得7個(gè)連鎖群，利用MAPMAKER/QTL 3.0進(jìn)行纖維品質(zhì)性狀QTL檢測(cè)，篩選到兩個(gè)與纖維比強(qiáng)度有關(guān)的QTL，其中一個(gè)QTL位于染色體16，有3個(gè)SSR標(biāo)記與之連鎖，分別為NAU/SSR/Fs1，NAU/SSR/Fs2，NAU/SSR/Fs3，該QTL在HS427-10×TM-1 F2群體中可解釋12.5％的表型變異，在HS427-10×TM-1 F2:3中可解釋16.9％的表型變異。
利用NAU/SSR/FS1130，NAU/SSR/FS2160，NAU/SSR/FS31603個(gè)分子標(biāo)記輔助篩選發(fā)現(xiàn)，基因QTLfs-2在二倍體野生種和一般常規(guī)品種中都不存在，只出現(xiàn)在大部分的高強(qiáng)纖維種質(zhì)系中，QTLfs-2在不同年份，不同環(huán)境表現(xiàn)穩(wěn)定。
本發(fā)明主效基因位點(diǎn)QTLfs-2的分子標(biāo)記為NAU/SSR/FS1130，NAU/SSR/FS2160或NAU/SSR/FS3160。
有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果1.通過(guò)高強(qiáng)纖維種質(zhì)系HS427-10和遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1進(jìn)行雜交，F(xiàn)2、F2:3的遺傳研究，發(fā)現(xiàn)HS427-10高強(qiáng)纖維的遺傳方式為加性遺傳效應(yīng)為主，負(fù)向顯性；2.在F2、F2:3遺傳分析的基礎(chǔ)上，通過(guò)分子標(biāo)記的基因組掃描，發(fā)現(xiàn)在第16染色體上有一個(gè)能顯著提高棉花纖維強(qiáng)度的主效基因位點(diǎn)QTLfs-2，其中有3個(gè)SSR標(biāo)記，NAU/SSR/FS1130，NAU/SSR/FS2160，NAU/SSR/FS3160與之緊密連鎖(圖1)，該主效基因位點(diǎn)以加性和隱性遺傳效應(yīng)為主，在HS427-10×TM-1的F2群體中可解釋12.5％的表型變異，在HS427-10×TM-1的F2:3中可解釋16.9％的表型變異。
3.利用NAU/SSR/FS1130等3個(gè)分子標(biāo)記輔助篩選發(fā)現(xiàn)，這一標(biāo)記的基因或QTL在4個(gè)二倍體野生種和一般常規(guī)品種中都不存在，但出現(xiàn)在大部分的高強(qiáng)纖維種質(zhì)系中(圖2)，說(shuō)明大多數(shù)的高強(qiáng)纖維種質(zhì)系都有QTLfs-2這一相同的基因，因此它具有很高的利用價(jià)值。
4.育種實(shí)踐證明QTLfs-2在不同年份，不同環(huán)境表現(xiàn)穩(wěn)定。這為盡快提高我國(guó)棉花品種的纖維品質(zhì)水平打下了基礎(chǔ)。
5.本發(fā)明不但有助于打破強(qiáng)度與產(chǎn)量之間的負(fù)相關(guān)，而且克服了現(xiàn)有育種技術(shù)對(duì)纖維品質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)成本很高，要求育種群體大，盲目性大，棉花種子產(chǎn)業(yè)發(fā)展遲緩的問(wèn)題，利用本發(fā)明棉花高強(qiáng)纖維基因主效基因位點(diǎn)及其分子標(biāo)記，大大提高高強(qiáng)纖維的選擇效率，盡快提高我國(guó)棉花品種的纖維品質(zhì)，并應(yīng)用于高強(qiáng)纖維棉花品種的生產(chǎn)與品質(zhì)檢測(cè)，大大加快我國(guó)高強(qiáng)纖維棉花品種種子產(chǎn)業(yè)化。


圖1 第16染色體，有3個(gè)SSR標(biāo)記，NAU/SSR/FS1130，NAU/SSR/FS2160，NAU/SSR/FS3160與基因QTLfs-2緊密連鎖圖2 基因QTLfs-2在二倍體野生種和一般常規(guī)品種中都不存在，只出現(xiàn)在大部分的高強(qiáng)纖維種質(zhì)系中1.分子量標(biāo)記，2.HS427-10，3.TM-1，4.Acala 3080，5.PD4381，6.7235，7.海7124，8.PD6992，9.蘇棉12號(hào)，10.蘇棉16號(hào)，11.中棉所35，12.泗棉3號(hào)，13.中棉所41，14.SGK321，15.743208，16.743209，17.低酚棉品系具體實(shí)施方式
本發(fā)明的實(shí)施程序是將引自美國(guó)農(nóng)業(yè)部南方平原研究中心作物種質(zhì)資源研究室的陸地棉高強(qiáng)纖維種質(zhì)系HS427-10進(jìn)行單株選擇，并測(cè)定纖維品質(zhì)，選出純合穩(wěn)定的株系HS427-10，據(jù)2000年和2001年的測(cè)定結(jié)果，株系HS427-10兩年纖維品質(zhì)平均數(shù)分別為纖維強(qiáng)度42.3g/tex，纖維長(zhǎng)度32.6mm，纖維細(xì)度5.18，陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1(美國(guó)岱字棉14品種自交15代以上，由美國(guó)德克薩斯州大學(xué)城農(nóng)業(yè)部南方平原農(nóng)業(yè)研究中心的Kohel博士提供)為纖維強(qiáng)度31.33g/tex，纖維長(zhǎng)度30.7mm，纖維細(xì)度5.39。
1999年將株系HS427-10與TM-1進(jìn)行雜交，年底F1種子送到海南島，自交產(chǎn)生F2種子。2000年將HS427-10×TM-1的F2分離群體種在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)站。用CTAB法提取這一分離群體的單株DNA。吐絮后，單株收花、取樣、進(jìn)行纖維品質(zhì)測(cè)定。2001年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)站種植(HS427-10×TM-1)F3株行，以便用F3株行中單株的纖維強(qiáng)度平均值來(lái)估算(HS427-10×TM-1)F2的單株水平。所有棉樣均送到河南安陽(yáng)農(nóng)業(yè)部纖維品質(zhì)和種子質(zhì)量檢測(cè)中心進(jìn)行纖維品質(zhì)檢驗(yàn)。
利用P1、P2、F1、F2和F2:3五世代的纖維品質(zhì)數(shù)據(jù)，采用蓋均鎰等提出的主基因與多基因混合遺傳模型的多世代聯(lián)合分析的方法(蓋鈞鎰，王建康.利用回交或F2:3家系世代鑒定數(shù)量性狀主基因-多基因混合遺傳模型。作物學(xué)報(bào)，1998，24(4)402-409)，估算棉纖維品質(zhì)的遺傳方式，其理論基礎(chǔ)是混合分布理論，將分離世代的分布看成為多個(gè)主基因型在多基因與環(huán)境修飾下形成的多個(gè)正態(tài)分布的混合分布，主要方法是通過(guò)極大似然法和EM算法對(duì)混合分布的有關(guān)成分分布參數(shù)做出估計(jì)，然后通過(guò)AIC值判別及適合性檢驗(yàn)，從中選擇最適遺傳模型，并由此估計(jì)出相應(yīng)的主基因與多基因效應(yīng)值，方差及有關(guān)遺傳參數(shù)，該方法的主要步驟為1樣本似然函數(shù)與遺傳模型的建立；2用迭代ECM算法估計(jì)模型的分布函數(shù)；3、用AIC準(zhǔn)則和適合性檢驗(yàn)選擇最優(yōu)模型；4、用最小二乘法估計(jì)入選模型的有關(guān)遺傳參數(shù)。結(jié)果為纖維強(qiáng)度的最適模型為C0模型(多基因加性——顯性遺傳模型)，適合性檢驗(yàn)全部通過(guò)，即由多基因加性——顯性遺傳模型控制，未能檢測(cè)出主基因。所檢測(cè)的多基因以加性遺傳效應(yīng)為主，負(fù)向顯性。
用487對(duì)SSR引物首先對(duì)HS427-10和TM-1親本的DNA多態(tài)性進(jìn)行初步分析。301對(duì)微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記引物購(gòu)自美國(guó)Research Genetics公司。186對(duì)微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記引物依據(jù)美國(guó)Reddy博士，美國(guó)農(nóng)業(yè)部南方研究中心John博士，美國(guó)密西西比洲立大學(xué)Saha教授等提供的序列由上海生工生物技術(shù)公司合成。Taq酶、dNTPs等PCR反應(yīng)試劑均購(gòu)自Sigma公司。PCR反應(yīng)體積為10ul，其中，67mM of Tris-Hcl(PH8.8)，16mM(NH4)SO4，2.5mM of Mgcl2，0.2mM ofdNTPs，0.6uM of primer，0.5 unit of Taqase和基因組DNA 20ng。PCR反應(yīng)在Thermal Cycle 9600(Perkin-Elmer)和PTC-225(MJ Research)上擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性2分鐘后，94℃變性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸60秒，循環(huán)35次，最后72℃延伸7分種；在PE9600擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在PAGE膠上電泳，然后銀染，銀染過(guò)程為固定(10％酒精，0.5％冰醋酸)12分鐘，0.2％AgNO3中染色12分鐘，水洗2次，每次2分鐘，顯色液(1.5％NaOH，％HCHOH)中顯色，記錄結(jié)果。分子標(biāo)記初步篩選結(jié)果表明，有37對(duì)SSR引物在雙親上有差異。將這37對(duì)引物分析182個(gè)F2分離單株，共獲得44個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。用MAPMAKER/EXP 3.0構(gòu)建(HS427-10×TM-1)F2群體的連鎖圖譜，共獲得7個(gè)連鎖群，其中6個(gè)分別定位于棉花染色體23(含有11個(gè)位點(diǎn))、染色體16(3個(gè)位點(diǎn))(圖1)、染色體12(4個(gè)位點(diǎn))、染色體9(3個(gè)位點(diǎn))、染色體5(2個(gè)位點(diǎn))和染色體20(2個(gè)位點(diǎn))利用MAPMAKER/QTL 3.0進(jìn)行纖維品質(zhì)性狀QTL檢測(cè)，篩選到兩個(gè)與纖維比強(qiáng)度有關(guān)的QTL，其中一個(gè)QTL位于染色體16，有3個(gè)SSR標(biāo)記與之連鎖，分別為NAU/SSR/Fs1(用SSR1017引物可擴(kuò)增出130對(duì)核苷酸長(zhǎng)的DNA片段)，NAU/SSR/Fs2(用SSR1122引物可擴(kuò)增出160對(duì)核苷酸長(zhǎng)的DNA片段)，NAU/SSR/Fs3(用SSR1395引物可擴(kuò)增出160對(duì)核苷酸長(zhǎng)的DNA片段)。該QTL在(HS427-10×TM-1)F2群體中可解釋12.5％的表型變異，在(HS427-10×TM-1)F2:3中可解釋16.9％的表型變異。該QTL以加性和隱性遺傳效應(yīng)為主。因此，用分子標(biāo)記輔助選擇可有效地開(kāi)展棉花的高強(qiáng)纖維育種。美國(guó)學(xué)者在陸地棉第16染色體上均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)能提高纖維強(qiáng)度的基因(R.J.Kohel等.Molecular mapping and characterization of traitscontrolling fiber quality in cotton.Euphytica，2001，121163-172.C X Jiang etal，Polyploid formation created unique avenues for response to selection inGossypium(cotton)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1998，954419-4424.)另外，我們選擇了四個(gè)棉屬二倍體野生種(分別為異常棉、瑟伯氏棉和陸地棉的兩個(gè)供體親本非洲草棉、雷蒙德氏棉)，5個(gè)陸地棉高強(qiáng)纖維種質(zhì)系(分別為7235、Acala3080、PD4381、PD6992和渝棉1號(hào)，1個(gè)海島棉(海7124)，10個(gè)陸地棉常規(guī)品種(分別為蘇棉12、蘇棉16、中棉所35、中棉所41、泗棉3號(hào)、SGK321、徐棉6號(hào)、湘雜棉2號(hào)的兩個(gè)親本和1個(gè)低酚棉品種)以及本試驗(yàn)的兩親本HS427-10和TM-1，用三個(gè)SSR引物SSR1017、SSR1122、SSR1395分析這些材料，以研究與之相連鎖的纖維基因的QTLfs-2起源以及不同高強(qiáng)纖維種質(zhì)(7235、Acala3080、PD4381和渝棉1號(hào))中是否存在該標(biāo)記。結(jié)果為這三個(gè)標(biāo)記在四個(gè)二倍體野生種中都不存在，而出現(xiàn)在6個(gè)高強(qiáng)纖維種質(zhì)的5個(gè)(7235、Acala3080、PD4381和渝棉1號(hào))中，而在所有供試的10個(gè)常規(guī)品種中都不存在該標(biāo)記(圖2)，說(shuō)明與SSR1122連鎖的高強(qiáng)纖維基因可能來(lái)源于Acala或PD種質(zhì)，目前大多數(shù)的高強(qiáng)纖維種質(zhì)可能有相同的起源，該標(biāo)記可能是纖維比強(qiáng)度的通用標(biāo)記，因此具有很高的利用價(jià)值。
利用SSR1395共顯性分子標(biāo)記，對(duì)(泗棉3號(hào)×7235)BC1F6分離群體中的443株DNA進(jìn)行了分子標(biāo)記的檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)分子標(biāo)記純合的190株棉株的纖維強(qiáng)度為24.87cN/tex，顯著高于沒(méi)有分子標(biāo)記的棉株的23.62cN/tex(表1)。這說(shuō)明，利用我們篩選出的分子標(biāo)記可顯著提高棉花纖維強(qiáng)度的選擇效率。
表1 (泗棉3號(hào)×7235)BC1F6分離群體SSR1395分子標(biāo)記輔助選擇QTLFS-2的效果標(biāo)記 基因型 植株數(shù) 纖維比強(qiáng)度 差異 T值 P(cN/tex)SSR1395 ++ 190 24.87 1.25 6.07**＜0.01-- 207 23.62++ 190 24.87 0.27 0.84＞0.05+- 46 24.60+- 46 24.60 0.98 2.78**＜0.01-- 207 23.62+有QTLFS-2的分子標(biāo)記-無(wú)QTLFS-2的分子標(biāo)記
權(quán)利要求
1.棉花高強(qiáng)纖維基因主效基因位點(diǎn)，其特征在于主效基因位點(diǎn)QTLfs-2，有3個(gè)SSR標(biāo)記與之連鎖，由標(biāo)記NAU/SSR/FS1130，NAU/SSR/FS2160，NAU/SSR/FS3160定位，分別為NAU/SSR/Fs1，用SSR1017引物可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為130對(duì)核苷酸的DNA片段；NAU/SSR/Fs2，用SSR1122引物可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為160對(duì)核苷酸的DNA片段；NAU/SSR/Fs3，用SSR1395引物可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為160對(duì)核苷酸的DNA片段；該主效基因位點(diǎn)位于棉花第16染色體上，以加性和隱性遺傳效應(yīng)為主，在高強(qiáng)纖維種質(zhì)系HS427-10和遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1進(jìn)行雜交的F2群體中可解釋12.5％的表型變異，在HS427-10×TM-1的F23中可解釋16.9％的表型變異。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花高強(qiáng)纖維基因主效基因位點(diǎn)，其特征在于這一主效基因位點(diǎn)是通過(guò)以下方法獲得標(biāo)記定位的1)選出純合穩(wěn)定的陸地棉株系HS427-10，纖維強(qiáng)度42.3g/tex，纖維長(zhǎng)度32.6mm，纖維細(xì)度5.18，陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1，纖維強(qiáng)度31.33g/tex，纖維長(zhǎng)度30.7mm，纖維細(xì)度5.39；2)將株系HS427-10與TM-1進(jìn)行雜交，F(xiàn)1種子自交產(chǎn)生F2種子，用CTAB法提取F2分離群體的單株DNA，吐絮后，單株收花、取樣、進(jìn)行纖維品質(zhì)測(cè)定；3)檢驗(yàn)HS427-10×TM-1 F3株行中單株的纖維強(qiáng)度，以便用平均值來(lái)估算HS427-10×TM-1F2的單株水平；4)利用P1、P2、F1、F2和F23五世代的纖維品質(zhì)數(shù)據(jù)，采用主基因與多基因混合遺傳模型的多世代聯(lián)合分析的方法，估算棉纖維品質(zhì)的最適模型為多基因加性——顯性遺傳模型，所檢測(cè)的多基因以加性遺傳效應(yīng)為主，負(fù)向顯性；5)用487對(duì)SSR引物首先對(duì)HS427-10和TM-1親本的DNA多態(tài)性進(jìn)行初步分析，PCR反應(yīng)體積為10ul67mM of Tris-Hcl(PH8.8)，16mM(NH4)SO4，2.5mM of Mgcl2，0.2mM of dNTPs，0.6uM of primer，0.5unit of Taqase和基因組DNA20ng，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性2分鐘后，94℃變性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸60秒，循環(huán)35次，最后72℃延伸7分種；在PE9600擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在PAGE膠上電泳，然后銀染；分子標(biāo)記初步篩選結(jié)果表明，有37對(duì)SSR引物在雙親上有差異，將這37對(duì)引物分析182個(gè)F2分離單株，共獲得44個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，用MAPMAKER/EXP 3.0構(gòu)建HS427-10×TM-1F2群體的連鎖圖譜，共獲得7個(gè)連鎖群，利用MAPMAKER/QTL 3.0進(jìn)行纖維品質(zhì)性狀QTL檢測(cè)，篩選到兩個(gè)與纖維比強(qiáng)度有關(guān)的QTL，其中一個(gè)QTL位于染色體16，有3個(gè)SSR標(biāo)記與之連鎖，分別為NAU/SSR/Fs1，NAU/SSR/Fs2，NAU/SSR/Fs3，該QTL在HS427-10×TM-1 F2群體中可解釋12.5％的表型變異，在HS427-10×TM-1 F23中可解釋16.9％的表型變異。
3.權(quán)利要求1或2所述棉花高強(qiáng)纖維基因主效基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記，其特征在于主效基因位點(diǎn)QTLfs-2的分子標(biāo)記為NAU/SSR/FS1130，NAU/SSR/FS2160或NAU/SSR/FS3160。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了棉花高強(qiáng)纖維基因主效基因位點(diǎn)及其分子標(biāo)記，專用于快速棉花纖維比強(qiáng)度的分子標(biāo)記輔助選擇。主效基因位點(diǎn)QTLfs－2，有3個(gè)SSR標(biāo)記與之連鎖，由標(biāo)記NAU/SSR/FS文檔編號(hào)C12P19/00GK1528912SQ200310106110
公開(kāi)日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2003年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月21日
發(fā)明者張?zhí)煺? 沈新蓮, 郭旺珍 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)