專利名稱:α-淀粉酶變體的制作方法
α-淀粉酶變體
本發(fā)明申請(qǐng)是基于申請(qǐng)日為1999年11月16日，申請(qǐng)?zhí)枮?9815544. 6 (國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/DK99/006^)，發(fā)明名稱為“ α -淀粉酶變體”的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及親代Termamyl-樣α -淀粉酶的新變體，相對(duì)于親代α -淀粉酶而言， 所述變體具有經(jīng)改變的特性。所述特性包括例如在酸性ρΗ，低鈣濃度和/或高溫下增加的穩(wěn)定性。所述變體適于多種用途，特別是工業(yè)淀粉處理(如淀粉液化或糖化)。
發(fā)明背景
α -淀粉酶(α -1，4-葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，EC 3. 2. 1. 1)構(gòu)成一組能催化淀粉和其它線性和分支1，4_葡糖苷寡-和多糖水解的酶。
大量專利和科學(xué)文獻(xiàn)中涉及這一類在工業(yè)上非常重要的酶?？蓮睦鏦O 90/11352, WO 95/10603, WO 95/26397, WO 96/23873 和 WO 96/23874 中了解多種 α -淀粉酶(如Termamyl-樣α -淀粉酶)的變體。
WO 96/23874提供了 Termamyl-樣α -淀粉酶的三維，X-射線晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，該 α -淀粉酶由解淀粉芽孢桿菌α -淀粉酶的300個(gè)N-末端氨基酸殘基，和含有氨基酸序列的地衣芽孢桿菌α -淀粉酶C-末端的氨基酸301-483組成(后者有商品TermamylTM(商標(biāo)名))，因此，與工業(yè)上重要的芽孢桿菌α-淀粉酶(在本發(fā)明的上下文中，包含在術(shù)語(yǔ)“Termamyl-樣α -淀粉酶”的定義中，它特別地包括地衣芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶)密切相關(guān)。WO 96Λ3874進(jìn)一步描述了在分析親代 Termamyl-樣α -淀粉酶結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)親代TermamyI-樣α -淀粉酶變體的方法學(xué)，相對(duì)于親代而言，所述變體表現(xiàn)出有所改變的特性。
發(fā)明簡(jiǎn)述
本發(fā)明涉及Termamyl-樣α-淀粉酶的新的α -淀粉分解變體(突變體)，尤其是在高溫和酸性PH下(相對(duì)于親代而言)表現(xiàn)出增加的穩(wěn)定性的變體，如美國(guó)專利 3，912，590和歐洲專利公開(kāi)號(hào)252，730和63，909所述，所述變體有利于對(duì)淀粉進(jìn)行工業(yè)處理(淀粉液化，糖化等)。
淀粉轉(zhuǎn)化
“傳統(tǒng)”的淀粉轉(zhuǎn)化方法將淀粉降解為較低分子量的碳水化合物成分，如糖或脂肪替代物，該方法包括脫支步驟。
“淀粉至糖”的轉(zhuǎn)化
當(dāng)將淀粉轉(zhuǎn)化為糖時(shí)，淀粉被解聚。所述解聚過(guò)程由預(yù)處理步驟和兩個(gè)或三個(gè)連續(xù)處理步驟(即液化處理，糖化處理，根據(jù)所需終產(chǎn)物，還任選包括異構(gòu)化處理)組成。
預(yù)-處理天然淀粉
天然淀粉由室溫下不溶于水的微粒組成。加熱水淀粉漿液時(shí)，微粒膨脹，最后脹破，將淀粉分子分散至溶液中。在“凝膠化”處理的過(guò)程中，粘度顯著增加。由于一般工業(yè)過(guò)程中的固體水平為30-40%，因此不得不稀釋或“液化”淀粉以使其便于處理。目前，主要通過(guò)酶促降解使粘度降低。[0016]
在液化步驟中，通過(guò)α-淀粉酶(如本文的Termamyl SEQ ID NO :4)將長(zhǎng)鏈淀粉分解為分支的和線性的較短單位(麥芽糖糊精)。液化過(guò)程在105-110°C進(jìn)行5至10分鐘，接著在95°C進(jìn)行1-2小時(shí)。pH為5.5至6.2之間。為了確保這些條件下最佳的酶穩(wěn)定性，需加入ImM鈣GOppm游離的鈣離子)。如此處理之后，液化淀粉的“葡萄糖當(dāng)量”(DE) 為 10-15。
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液化過(guò)程之后，通過(guò)加入葡糖淀粉酶(如AMG )和脫支酶，如異淀粉酶(美國(guó)專利 4，335，208)或支鏈淀粉酶(如Promozyme )(美國(guó)專利4，560，651)，將麥芽糖糊精轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?。在此步驟之前，將PH值降低為4. 5以下，維持高溫(95°C以上)以滅活液化α-淀粉酶，減少不能被脫支酶正確水解的短寡糖(被稱為“潘糖前體”)的形成。
將溫度降低為60°C，加入葡糖淀粉酶和脫支酶。將糖化過(guò)程進(jìn)行M-72小時(shí)。
通常，當(dāng)在液化步驟之后變性α -淀粉酶時(shí)，約0. 2-0. 5 %的糖化產(chǎn)物是分支的三糖62_ α-葡糖基麥芽糖(潘糖)，該糖不能被支鏈淀粉酶降解。如果糖化過(guò)程中存在得自液化步驟的活性淀粉酶(即未變性)，該水平可以高至1_2%，這非常不合乎需要，因?yàn)樗@著降低了糖化產(chǎn)量。
異構(gòu)化
當(dāng)所需的最終糖產(chǎn)物是例如高果糖漿時(shí)，葡萄糖漿可被轉(zhuǎn)變?yōu)楣?。糖化過(guò)程之后，將PH值增加為6-8，優(yōu)選為ρΗ7. 5，通過(guò)離子交換除去鈣。然后使用例如固定化的葡萄糖異構(gòu)酶(如Sweetzyme )將葡萄糖漿轉(zhuǎn)變?yōu)楦吖菨{。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“酸性pH”指的是pH低于7.0，尤其是低于上述傳統(tǒng)工業(yè)淀粉液化過(guò)程中所用的PH范圍，即為pH5. 5-6. 2。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“低鈣濃度”指的是濃度低于傳統(tǒng)的工業(yè)淀粉液化過(guò)程中所用的正常水平，如濃度為0-40ppm，優(yōu)選為10-30ppm，如15_25ppm鈣。正常濃度根據(jù)谷物中游離Ca2+的濃度而變化。通常加入相當(dāng)于lmM(40ppm)的劑量，該劑量與谷物中的鈣水平一起給出40-60ppm游離的Ca2+。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“高溫”指的是溫度為95至160°C，尤其是正常進(jìn)行工業(yè)淀粉液化處理所用的溫度范圍，所述范圍是95至105°C。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼本發(fā)明變體的DNA構(gòu)建體，制備本發(fā)明變體的方法，和本發(fā)明變體單獨(dú)或與其它α -淀粉分解酶聯(lián)合用于多種工業(yè)過(guò)程，尤其是淀粉液化的用途。
命名法
在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求
書(shū)中，使用了常規(guī)的氨基酸殘基一字母和三字母密碼。
為了易于參照，利用下述命名法描述本發(fā)明的α -淀粉酶變體原來(lái)的氨基酸位置取代的氨基酸。
根據(jù)該命名法，用天冬酰胺取代第30位的丙氨酸被表示為Ala30ASn或Α30Ν，在相同位置處缺失丙氨酸被表示為Ala3(f或A30*，而插入另一個(gè)氨基酸殘基，如賴氨酸被表示為Ala30AlaLyS或A30AK。缺失連續(xù)的一段氨基酸殘基，如氨基酸殘基30-33被表示為 (30-33)*或 Δ (Α30-Ν33)。
當(dāng)特定的α -淀粉酶相對(duì)于其它α _淀粉酶而言含有“缺失”，并在該位置插入某個(gè)氨基酸，例如在第36位插入天冬氨酸時(shí)，被表示為*36Asp或。60。
多個(gè)突變由加號(hào)隔開(kāi)，即Ala30Asp+Glu;34Ser或A30N+E34S分別表示在第30和 34位，丙氨酸和谷氨酸分別用天冬酰胺和絲氨酸取代。多個(gè)突變也可以由下列與加號(hào)意義相同的符號(hào)隔開(kāi)Ala30Asp/Glu34Ser 或 A30N/E34S。
當(dāng)在給定的位置插入一個(gè)或多個(gè)其它氨基酸殘基時(shí)，被表示為A30N，E或A30N或 A30E。
另外，當(dāng)本文鑒定出適于修飾的位置，而沒(méi)有暗示任何具體的修飾時(shí)，應(yīng)理解為可用任何氨基酸殘基取代該位置存在的氨基酸殘基。因此，例如，當(dāng)提到修飾第30位的丙氨酸，但未具體說(shuō)明時(shí)，應(yīng)理解為丙氨酸可被缺失，或用任何其它氨基酸取代，即下列任何一個(gè)氨基酸所取代=R, N，D，A, C，Q，Ε, G，H，I，L，K，Μ, F，P，S，Τ, W, Y，V。
具體地，本發(fā)明涉及如下方面
1 )親代Termamyl-樣α-淀粉酶的變體，與親代α-淀粉酶相比，所述α -淀粉酶變體中，表面有一個(gè)或多個(gè)暴露于溶劑的氨基酸殘基發(fā)生變化以使該α-淀粉酶的總體親水性增加和/或表面上所述暴露于溶劑的氨基酸殘基的側(cè)鏈中甲基總數(shù)增加。
2)1)的變體，其中向內(nèi)彎曲的凹面上的一個(gè)或多個(gè)暴露于溶劑的氨基酸殘基變?yōu)楦呤杷缘陌被釟埢?br>3) 1)的變體，其中凸面上的一個(gè)或多個(gè)暴露于溶劑的氨基酸殘基經(jīng)改變后增加了側(cè)鏈中的甲基數(shù)目。
4)親代Termamyl-樣α -淀粉酶的變體，該變體在選自下列的一個(gè)或多個(gè)位置處具有變化:E376, S417, Α420, S356, Υ358 ；
其中(a)所述變化各為
(i)在占用上述位置的氨基酸的下游插入一個(gè)氨基酸，
(ii)缺失占用上述位置的氨基酸，或
(iii)用不同的氨基酸取代占用上述位置的氨基酸，
(b)所述變體具有α -淀粉酶活性，和(c)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于具有SEQ IDNO 4氨基酸序列的親代Termamyl-樣α -淀粉酶的氨基酸序列位置。
5)4)的變體，所述變體的一個(gè)或多個(gè)暴露于溶劑的氨基酸殘基具有如1)- 中任一項(xiàng)所定義的變化。
6) 1) -5)中任一項(xiàng)的變體，其中親代Termamyl-樣α -淀粉酶得自地衣芽孢桿菌， 解淀粉芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌株，芽孢桿菌菌種NCIB12^9，NCIB 12512，NCIB 12513 或 DSM 9375。
7)6)的變體，其中親代α -淀粉酶得自地衣芽孢桿菌菌株ATCC 27811。
8)1)-6)的變體，其中親代Termamyl-樣α -淀粉酶是選自SEQ ID NO =1,2,3,4, 5，6，7和8所示的任何α-淀粉酶。
9) 1)-8)中任一項(xiàng)的變體，其中親代Termamyl-樣α -淀粉酶具有的氨基酸序列與 SEQ ID NO :4的同一性程度至少為65%，優(yōu)選為70%，更優(yōu)選至少為80%，甚至更優(yōu)選至少約為90%，甚至更優(yōu)選至少為95%，甚至更優(yōu)選至少為97%，甚至更優(yōu)選至少為99%。
10)1)-10)中任一項(xiàng)的變體，其中親代Termamyl-樣α -淀粉酶由能在中度嚴(yán)緊， 優(yōu)選為高度嚴(yán)緊的條件下與SEQ ID NO :12的核酸序列雜交的核酸序列編碼。[0052]11) 1)-10)的變體，其中親代Termamyl-樣α -淀粉酶是SEQ ID NO 4所示地衣芽孢桿菌α -淀粉酶和SEQ ID NO 5所示解淀粉芽孢桿菌α -淀粉酶的雜合體。
12) 11)的變體，其中親代雜合Termamyl-樣α -淀粉酶是LE174。
13)1)-12)中任一項(xiàng)的變體，其中親代α-淀粉酶還在下列的一個(gè)或多個(gè)位置處具有突變:Κ176, 1201和Η205 (使用SEQ ID NO 4的編號(hào))。
14) 13)的變體，其中親代α -淀粉酶具有一個(gè)或多個(gè)下列取代K176R，1201F和/ 或H205N(使用SEQ ID NO 4的編號(hào))。
15) 14)的變體，其中親代α -淀粉酶具有下列取代K176R+I201F+H205N(使用SEQ ID NO 4的編號(hào))。
16)1)至15)的變體，其中相對(duì)于親代α-淀粉酶而言，所述變體在低于7.0的 PH(酸性ρΗ)和/或低鈣濃度和/或95-160°C的溫度范圍(高溫)下具有增加的穩(wěn)定性。
17) 1)至16)中任一項(xiàng)的變體，所述變體具有一個(gè)或多個(gè)下列取代E376K，S417T， A420Q, R, S356A, Y358F。
18) DNA構(gòu)建體，其含有編碼1)至17)中任一項(xiàng)的α -淀粉酶變體的DNA序列。
19)重組表達(dá)載體，其攜有18)的DNA構(gòu)建體。
20)被18)的DNA構(gòu)建體或19)的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
21)20)的細(xì)胞，其為微生物。
22)21)的細(xì)胞，其為細(xì)菌或真菌。
23) 22)的細(xì)胞，其為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌。
24)去污劑添加劑，其含有1)至17)中任一項(xiàng)的α -淀粉酶變體，所述變體任選為不成粉末的顆粒，穩(wěn)定化的液體或被保護(hù)的酶的形式。
25)24)的去污劑添加劑，其含有0. 02_200mg酶蛋白質(zhì)/g添加劑。
26)24)或25)的去污劑添加劑，其中還含有另一種酶，例如蛋白酶，脂肪酶，過(guò)氧化物酶，另一種淀粉分解酶和/或纖維素酶。
27)去污劑組合物，其含有1)至17)中任一項(xiàng)的α -淀粉酶變體。
28)27)的去污劑組合物，其中還含有另一種酶，例如蛋白酶，脂肪酶，過(guò)氧化物酶， 另一種淀粉分解酶和/或纖維素酶。
29)手用或機(jī)用洗碟去污劑組合物，其含有1)至17)中任一項(xiàng)的α -淀粉酶變體。
30) 29)的洗碟去污劑組合物，其中還含有另一種酶，例如蛋白酶，脂肪酶，過(guò)氧化物酶，另一種淀粉分解酶和/或纖維素酶。
31)手用或機(jī)用洗衣組合物，其含有1)至17)中任一項(xiàng)的α -淀粉酶變體。
32) 31)的洗衣組合物，其中還含有另一種酶，例如蛋白酶，脂肪酶，過(guò)氧化物酶，淀粉分解酶和/或纖維素酶。
3 組合物，其含有
(i)具有SEQ ID NO :4所示序列的地衣芽孢桿菌α -淀粉酶與得自具有SEQ ID NO 3所示序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶(作為親代Termamyl-樣α -淀粉酶)的 1)至17)中任一項(xiàng)的一種或多種變體的混合物；或[0076](ii)具有SEQ ID NO 3所示序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶與得自一種或多種其它親代Termamyl-樣α -淀粉酶的1)至17)中任一項(xiàng)的一種或多種變體的混合物； 或
(iii)得自具有SEQ ID NO 3所示序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶(作為親代Termamyl-樣α -淀粉酶)的1)至17)中任一項(xiàng)的一種或多種變體與得自一種或多種其它親代Termamyl-樣α -淀粉酶的本發(fā)明的一種或多種變體的混合物。
34)含有1)至17)中任一項(xiàng)的變體的組合物，其中親代α -淀粉酶是含有SEQ ID NO :5所示解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶的N-末端部分和SEQ ID NO :4所示地衣芽孢桿菌 α -淀粉酶的C-末端部分的雜合α -淀粉酶。
35) 34)的組合物，其中親代雜合Termamyl-樣α -淀粉酶是LE174。
36) 3 的組合物，其中親代Termamyl-樣α-淀粉酶是在一個(gè)或多個(gè)下列位置具有改變的 LE174 :Κ176, 1201 和 Η205。
37) 36)的組合物，其中親代Termamyl-樣α -淀粉酶是在一個(gè)或多個(gè)下列取代的 LE174 :K176R, I201F 和 H205N。
38) 1)至17)中任一項(xiàng)的α -淀粉酶變體或33)至37)的組合物用于洗滌和/或洗碟的用途。
39) 1)至17)中任一項(xiàng)的α -淀粉酶變體或33)至37)的組合物用于織物脫漿的用途。
40) 1)至17)中任一項(xiàng)的α -淀粉酶變體或33)至37)的組合物用于淀粉液化的用途。
41)產(chǎn)生親代Termamyl-樣α -淀粉酶的變體的方法，其中變體相對(duì)于親代而言， 在高溫下表現(xiàn)出增加的穩(wěn)定性，所述方法包括
(a)對(duì)編碼親代Termamyl-樣α -淀粉酶的DNA序列進(jìn)行隨機(jī)誘變，
(b)在宿主細(xì)胞中表達(dá)步驟(a)中得到的突變DNA序列，和
(c)篩選表達(dá)突變?chǔ)?-淀粉酶的宿主細(xì)胞，相對(duì)于親代TermamyI-樣α -淀粉酶而言，所述變體在高溫下具有增加的穩(wěn)定性。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是本發(fā)明上下文中6個(gè)親代Termamyl-樣α -淀粉酶的氨基酸序列對(duì)比。最左邊的數(shù)字表示以下各個(gè)氨基酸序列
1 =SEQ ID NO 2,
2 淀粉[0093]3 :SEQ ID NO 1,
4 :SEQ ID NO :5，
5 :SEQ ID NO :4，
6 :SEQ ID NO :3。
圖2表示實(shí)施例1中所用的PCR策略。
發(fā)明詳述
Termamyl-樣 α -淀粉酶
眾所周知，通過(guò)芽孢桿菌種產(chǎn)生的多種α-淀粉酶在氨基酸水平上高度同源。
7例如，已發(fā)現(xiàn)含有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(商品為 Termamyl )與含有SEQ ID NO :5所示氨基酸序列的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶約89%同源，與含有SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶約79%同源。其它同源的α-淀粉酶包括得自芽孢桿菌菌種NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513或DSM 9375的α -淀粉酶(皆詳細(xì)描述于WO 95/26397)，和描述于Tsukamoto等，生物化學(xué)和生物物理研究通訊，151 (1988)，ρ25-31中的α -淀粉酶。
其它同源的α-淀粉酶包括由EP 025沈66所述的地衣芽孢桿菌菌株(ATCC 27811)所產(chǎn)生的α-淀粉酶，和WO 91/00353和WO 94/18314中鑒定的α -淀粉酶。其它可商購(gòu)的iTermamyl-樣地衣芽孢桿菌α -淀粉酶是Optitherm 和Takatherm (可得自 Solvay)，Maxamy 1 (可得自 Gist-brocades/Genencor)，Spezym AA 禾口 Spezyme Delta AA (可得自 Genencor)和 Keistase (可得自 Daiwa)。
由于這些α-淀粉酶基本上同源，因此可以認(rèn)為它們屬于同一類α-淀粉酶，即 “Termamyl-樣 α -淀粉酶”。
因此，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“Termamyl-樣α -淀粉酶”欲指在氨基酸水平上與TermamylTM(即具有本文SEQ ID NO 4所示氨基酸序列的地衣芽孢桿菌α -淀粉酶)基本上同源的α-淀粉酶。換句話說(shuō)，Termamyl-樣α -淀粉酶是具有本文SEQ ID Ν0:1,2, 3，4，5，6，7 或 8 所示氨基酸序列，和 W095/26397 的 SEQ ID Ν0:1(與本文 SEQ ID NO -JpJf 示氨基酸序列相同)或W095/26397的SEQ ID Ν0:2(與本文SEQ ID NO :8所示氨基酸序列相同)或iTsukamoto等，1988 (其氨基酸序列示于本文SEQ ID NO 6)所示氨基酸序列的 α-淀粉酶，或者，Termamyl-樣α-淀粉酶是i)與SEQ ID NO :1或2或3或4或5或6或 7或8所示的至少一個(gè)所述氨基酸序列的同源性(同一性)至少為60%，優(yōu)選至少為70%， 更優(yōu)選至少為75 %，甚至更優(yōu)選至少為80 %，尤其是至少為85 %，尤其優(yōu)選至少為90 %，尤其是至少為95 %，甚至尤其更優(yōu)選至少為97 %，尤其是至少為99 %的α -淀粉酶，和/或 )能與針對(duì)一種或多種所述α-淀粉酶產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的α-淀粉酶，和/ 或iii)由能在低至很高嚴(yán)緊條件下(所述條件在下文中描述)與編碼上述-特定α-淀粉酶的DNA序列雜交的DNA序列編碼的α -淀粉酶，所述特定α -淀粉酶的DNA序列分別示于本申請(qǐng)的SEQ ID NO :9，10，11，12和32 (分別編碼本文SEQ IDNO 1，2，3，4和5所示的氨基酸序列)，WO 95/26397的SEQ ID NO 4 (該DNA序列與終止密碼子TAA —起示于本文SEQ ID NO :13，它編碼本文SEQ IDNO 8所示的氨基酸序列)和WO 95/26397的SEQ ID NO :5(示于本文 SEQ IDNO 14)。
關(guān)于特性i)，可利用任何常規(guī)的算法測(cè)定“同源性”(同一性)，優(yōu)選使用GCG程序包第8版(1994年8月)的缺口程序，該程序使用缺口得分的缺省值，即缺口產(chǎn)生得分為 3. 0，缺口延伸得分為0. l(Genetic ComputerGroup (1991) GCG程序包程序手冊(cè)，第8版，575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，親代Termamyl-樣α -淀粉酶骨架具有的氨基酸序列與SEQ ID NO :4的同一性程度(按上述方法測(cè)定)至少為65%，優(yōu)選至少為70%，優(yōu)選至少為 75%，更優(yōu)選至少為80%，更優(yōu)選至少為85%，甚至更優(yōu)選至少約為90%，甚至更優(yōu)選至少為95%，甚至更優(yōu)選至少為97%，甚至更優(yōu)選至少為99%。
可使用Termamyl (SEQ ID NO 4)和Termamyl-樣α -淀粉酶之間的結(jié)構(gòu)對(duì)比鑒定其它Termamyl-樣α _淀粉酶中等同的/相應(yīng)的位置。得到所述結(jié)構(gòu)對(duì)比的一個(gè)方法是使用GCG程序包中的Pile Up程序，該程序使用缺省的缺口得分值，即缺口產(chǎn)生得分為 3. 0，缺口延伸得分為0. 1。其它結(jié)構(gòu)對(duì)比方法包括疏水簇分析O^aboriaud等，(1987)，F(xiàn)EBS LETTERS 224，p. 149-155)和反向穿梭(threading)法(Huber，T ；Torda, AE，蛋白質(zhì)科學(xué)， 卷 7，1 期，142-149(1998))。
例如，在已提及的多種Termamyl-樣α -淀粉酶的氨基酸序列中，地衣芽孢桿菌 α -淀粉酶C-結(jié)構(gòu)域中靶殘基的相應(yīng)位置如下
權(quán)利要求
1.親代Termamyl-樣α-淀粉酶的變體，其中該變體選自下組 K176R+I201F+H205N ； K176R+I201F+H205N+E376K+A420R K176R+I201F+H205N+S417T+A420Q K176R+I201F+H205N+S356A+Y358F 其中(a)所述變體具有α-淀粉酶活性，和(b)每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于具有SEQ ID NO 4氨基酸序列的親代Termamyl-樣α -淀粉酶的氨基酸序列位置。
2.權(quán)利要求
1的變體，其中親代Termamyl-樣α-淀粉酶得自地衣芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌株，芽孢桿菌菌種NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513或 DSM 9375。
3.DNA構(gòu)建體，其含有編碼權(quán)利要求
1或2的α -淀粉酶變體的DNA序列。
4.重組表達(dá)載體，其攜有權(quán)利要求
3的DNA構(gòu)建體。
5.被權(quán)利要求
3的DNA構(gòu)建體或權(quán)利要求
4的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
6.去污劑添加劑，其含有權(quán)利要求
1或2的α-淀粉酶變體，所述變體任選為不成粉末的顆粒，穩(wěn)定化的液體或被保護(hù)的酶的形式。
7.權(quán)利要求
1或2的α-淀粉酶變體或權(quán)利要求
6的去污劑添加劑用于洗滌和/或洗碟、織物脫漿或淀粉液化的用途。
專利摘要
本發(fā)明涉及親代Termamyl-樣α-淀粉酶的變體，該變體在2，3，4，5，或6個(gè)區(qū)域/位置中含有突變。所述變體在高溫下(相對(duì)于其親代)具有增加的穩(wěn)定性。本發(fā)明還涉及含有編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體之DNA序列的DNA構(gòu)建體，攜帶本發(fā)明DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載體，用本發(fā)明的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，本發(fā)明的α-淀粉酶變體在洗滌和/或洗碟、織物退漿、淀粉液化方面的用途，含有本發(fā)明的α-淀粉酶變體的去污劑添加劑，含有本發(fā)明的α-淀粉酶變體的手洗或機(jī)洗洗碟劑組合物，產(chǎn)生親代Termamyl-樣α-淀粉酶的變體的方法，所述變體顯示增加。
文檔編號(hào)C12N15/01GKCN101240269 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200810003302
公開(kāi)日2012年4月18日 申請(qǐng)日期1999年11月16日
發(fā)明者亨里克·比斯加德弗蘭岑, 卡斯滕·安德森, 索倫·謝魯爾夫, 阿倫·斯文德森 申請(qǐng)人:諾維信公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan