專利名稱：：選擇等位基因交換突變體的方法最近發(fā)展的用于在分枝桿菌中導(dǎo)入并表達(dá)基因的技術(shù)開辟了分子遺傳學(xué)操作的道路，可以作為一種進(jìn)一步了解這些種的方法(Jacobsetal.，1991)。通常，在遺傳上，按照Koch’s分子假定(Falkow，1988)表征毒性因子(i)克隆所需的基因；(ii)對基因的特異性失活毒性的影響；和(iii)通過與野生型等位基因互補(bǔ)，致病性的恢復(fù)。但是，由于缺少通過同源重組以產(chǎn)生特定突變體的有效工具，所以分枝桿菌的遺傳分析受到阻礙(Jacobs，1992)。了解基因功能的“反向遺傳學(xué)”方法是通過研究細(xì)胞的同源重組特性以便用失活的拷貝取代功能等位基因，來特異性地破壞所研究的基因(RuvkunandAusubel，1981)。通常，通過插入抗生素抗性標(biāo)記來失活所述基因，以便在選擇性培養(yǎng)基上很容易檢測重組情況。應(yīng)當(dāng)指明的是，這種方法適用于使用PyrF基因的恥垢分枝桿菌(Hussonetal.，1990)。然而，由于雙交換很罕見，所以完成等位基因交換很麻煩，要大規(guī)模的篩選分離基因交換突變體。在同源重組比不合理重組少的生長緩慢的分枝桿菌中證明該方法極為無效，所述不合理重組即指以未知機(jī)制，在一位點(diǎn)而不是所選的基因發(fā)生重組。許多研究人員不能檢測任何基因取代(Aldovinietal.，1993；Kalpanaetal.，1991)。但是，最近在生長緩慢的分枝桿菌中成功地鑒定了等位基因交換，盡管頻率低(Marklundetal.，1995；Normanetal.，1995；Reyratetal.，1995；Balasubramanianetal.，1996)。顯然，等位基因交換很大程度上得益于可以對因基因取代而產(chǎn)生的突變體進(jìn)行陽性篩選的一個(gè)系統(tǒng)。已經(jīng)描述了在真核細(xì)胞和一些細(xì)菌的基因取代實(shí)驗(yàn)中，不合理重組水平高，而重組頻率低(CaiandWolk，1990；Desomeretal.，1991)。用雙篩選策略，可以克服這些問題(Stibitz，1994)。用于誘變的載體應(yīng)帶有可進(jìn)行轉(zhuǎn)化體初步篩選的抗生素標(biāo)記，而第二個(gè)標(biāo)記具有有條件的顯性致死作用以反篩選已丟失了載體DNA的克隆，減少對更廣泛篩選的需要。目前尚未有用于分枝桿菌的反篩選標(biāo)記，而表明rpsL基因在恥垢分枝桿菌中有顯性致死作用。這表明在該種細(xì)菌中進(jìn)行雙篩選是可能的(Sanderetal.，1995)。有必要設(shè)計(jì)一種用于基因交換誘變的通用方法，克服因不合理重組水平高和同源重組頻率低而產(chǎn)生的問題。目前提出了一種可能的策略，以使用更長的線性同源DNA片段(20kb或更長)為基礎(chǔ)(Balasubramanianetal.，1996)。用這種方法表明可以提高結(jié)核分枝桿菌leuD基因的同源重組頻率。等位基因交換突變體的比例由不可檢測水平增長到占轉(zhuǎn)化體的約6％(Balasubramanianetal.，1996)。但是，這種方法可能的限制是由于粘粒相當(dāng)長，因此，其操作相對比較困難。本發(fā)明通過如Stibitz(1994)所述，在雙篩選策略中使用條件顯性致死標(biāo)記，而克服了現(xiàn)有技術(shù)中所描述的困難。將存在于自殺性傳遞載體上的所述標(biāo)記插入到從單同源重組或不合理重組而產(chǎn)生的克隆的染色體中，使其在選擇性培養(yǎng)基上死亡。其后果是提高了等位基因交換突變體的比例，使得轉(zhuǎn)化體的篩選更容易。最近，描述了在恥垢分枝桿菌中的反篩選標(biāo)記，并說明，在該細(xì)菌中，等位基因交換突變體的陽性篩選是可能的rpsL基因賦予對鏈霉素敏感的顯性表型(Sanderetal.，1995)。本發(fā)明首次提供了第二反篩選標(biāo)記枯草芽孢桿菌SacB基因，賦予蔗糖敏感性(在Pelicic等人的分子微生物學(xué)，1996中作了描述)。SacB是特別有效的工具，因?yàn)榭梢栽趩尾襟E或兩步驟篩選中將其用于突變體的陽性篩選。在單步驟方法中，將自殺載體電穿孔到恥垢分枝桿菌中，在蔗糖上直接篩選等位基因交換突變體。在兩步驟篩選中，先篩選單重組轉(zhuǎn)化體，然后在液體肉湯中繁殖以有利于發(fā)生第二次交換。然后，鋪在蔗糖上，可以陽性篩選出在第二次交換中丟失了SacB基因的突變體。在本發(fā)明前，后者在生長緩慢的分枝桿菌中應(yīng)是特別需要的，但不是顯而易見的。的確，一步篩選不適用于大量基因，而在經(jīng)典實(shí)驗(yàn)中，雙重組體無法檢測(Jacksonpers.comm.；RuvkinandAusubel，1981)。即使已經(jīng)表明SacB賦予生長緩慢的分枝桿菌以蔗糖敏感性(Pelicicetal.J.Bacteriol.，1996)，但在本發(fā)明前，并未證明可以將其用作等位基因交換突變體陽性篩選標(biāo)記。因此，這是第一次在以UreC基因?yàn)槟Ｐ偷纳L緩慢的分枝桿菌中，開發(fā)了兩步篩選法。因此，本發(fā)明提供了取代分枝桿菌菌株基因組中核苷酸序列的方法。該方法包括提供含有編碼果聚糖蔗糖酶的SacB基因和所需核苷酸序列的載體。通過例如電穿孔或接合，用所述載體轉(zhuǎn)染分枝桿菌菌株。通過在用蔗糖補(bǔ)充的培養(yǎng)基中繁殖轉(zhuǎn)染的克隆，以便從所得的轉(zhuǎn)染分枝桿菌克隆中篩選有核苷酸序列取代的克隆。如果需要，分離重組菌株。在本發(fā)明方法中適用的典型分枝桿菌菌株包括結(jié)核分枝桿菌，恥垢分枝桿菌，牛分枝桿菌，BCG-牛分枝桿菌，非洲分枝桿菌，田鼠分枝桿菌，鳥分枝桿菌，戈特氏分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，分枝桿菌是生長緩慢的分枝桿菌。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，在所述方法中所用的載體含有標(biāo)記基因，該選擇步驟在通過于用選擇分子補(bǔ)充的培養(yǎng)基中繁殖克隆而對克隆進(jìn)行第一次篩選的步驟之后。例如，標(biāo)記基因可以是編碼抗生素，如慶大霉素或卡那霉素抗性的基因。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述方法中所用的載體含有在例如大腸桿菌中有功能的復(fù)制起點(diǎn)。所需的核苷酸序列可以是被轉(zhuǎn)染分枝桿菌的內(nèi)源基因?？梢酝ㄟ^增加，取代或缺失至少一個(gè)核苷酸來修飾核苷酸序列。術(shù)語“取代”和“缺失”指單個(gè)堿基的改變。優(yōu)選，修飾后的核苷酸序列在其全長內(nèi)不含有多于3％的取代或缺失?！霸黾印笨梢灾缚梢圆迦氲捷d體所含之核苷酸序列中間的基因的全部序列(所述核苷酸序列代表分枝桿菌基因組中被取代序列的配對物)。例如，所述增加可以是插入抗生素抗性基因或編碼外源抗原或免疫原的基因。另外，對于被轉(zhuǎn)染的分枝桿菌來說，所述核苷酸序列可以是外源的。本發(fā)明的外源核苷酸序列是非天然存在于被重組之分枝桿菌中的，或存在于所述分枝桿菌中的另一座位，而不是通過本發(fā)明等位基因交換方法將其插入之座位的核苷酸序列。所述外源序列含有所需外源核苷酸序列，在5’和3’末端，與至少1kb長的同源核苷酸序列鄰接，所述同源核苷酸序列是分枝桿菌基因組序列質(zhì)粒的配對物以便可以進(jìn)行等位基因交換。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，被取代的核苷酸序列可以是質(zhì)?；蛉旧w核苷酸序列。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所需的核苷酸序列可以是編碼融合多肽的雜交分子。本發(fā)明還提供了所描述的典型方法，其中所述融合多肽含有對于被轉(zhuǎn)染的分枝桿菌菌株來說異源的抗原決定基，所述抗原決定基更容易被患者血清而不是開始的內(nèi)源抗原決定基識別。在本發(fā)明方法中可以使用的適宜抗原決定基包括，但不限于1)由Sorensen等人(1995)描述的6kD早期分泌抗原靶(ESAT-6)(例如，可以將ESAT-6作為含有BCG牛分枝桿菌之已知非必需核苷酸序列的融合序列插入到BCG牛分枝桿菌菌株中，因此改進(jìn)常規(guī)使用的BCG菌株，因?yàn)橹亟M菌株能夠表達(dá)結(jié)核分枝桿菌特異性的免疫原決定基。然后，這些重組菌株可提供一種改進(jìn)的方法以生產(chǎn)有效的疫苗制劑)；2)來自結(jié)核分枝桿菌的45/47kD的免疫原蛋白，描述于國際專利申請PCT/FR96/0166中；3)在法國專利申請F(tuán)R7921811中描述的來自乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)；和4)編碼全部或部分HIV糖蛋白的核苷酸序列，例如在專利申請GB8324800，EP84401834或EP85905513公開的來自HIV-1的基因組序列；或在專利申請EP87400151中描述的HIV-2的基因組序列。本發(fā)明還提供了重組分枝桿菌菌株。所述菌株在其基因組中有修飾過的核苷酸序列，不同于所述分枝桿菌的野生型序列，而且所述重組分枝桿菌菌株可以含有或不含有插入載體的序列。本發(fā)明還提供重組載體，所述載體特別適用于本發(fā)明。另外，本發(fā)明還提供了篩選蔗糖敏感的分枝桿菌的方法。所述方法包括在用蔗糖補(bǔ)充的培養(yǎng)基中培養(yǎng)分枝桿菌；同時(shí)在不含蔗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)分枝桿菌；然后篩選含SacB基因之基因組的，對蔗糖敏感的克隆。最后，本發(fā)明提供了評估結(jié)核分枝桿菌毒力機(jī)制的方法。眾所周知，細(xì)菌毒力機(jī)制的理解很大程度依賴于設(shè)計(jì)有效的誘變系統(tǒng)。以前，尚未有用于結(jié)核分枝桿菌的所述有效的誘變系統(tǒng)。因此，本發(fā)明首次提供了能夠陽性篩選分枝桿菌插入突變體的系統(tǒng)，所述突變體已經(jīng)丟失了的傳遞載體。所述方法可以構(gòu)建含106以上突變體的結(jié)核分枝桿菌轉(zhuǎn)座子突變體文庫，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過在每個(gè)非必需基因中得到至少一個(gè)插入片段所需的理論數(shù)。使用本發(fā)明方法和產(chǎn)品的分枝桿菌的轉(zhuǎn)座子誘變也可用于設(shè)計(jì)隨機(jī)重組營養(yǎng)缺陷型分枝桿菌。作為新疫苗候選物，營養(yǎng)缺陷型是有用的，例如，其中篩選毒力基因受影響的突變體作為不能在巨嗜細(xì)胞中長期存活的克隆。這些分枝桿菌突變體也可用于提供其他有關(guān)殘留毒力和保護(hù)作用的信息。所述有價(jià)值的工具使得首次可以構(gòu)建抗結(jié)核病的新疫苗。在設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)座子突變體文庫中所用的優(yōu)選載體是攜帶下列組分的載體a)含選擇標(biāo)記基因的插入序列，如由卡那霉素抗性基因中斷的插入序列IS1096(IS1096Km)；b)條件性的功能復(fù)制起始區(qū)，如條件性的熱敏感復(fù)制起始區(qū)；和c)SacB基因。參考附圖更充分地理解本發(fā)明，其中圖1是通過在蔗糖上一步篩選或兩步篩選得到的來自同源重組之代表性克隆的Southern印跡分析。列出了兩個(gè)Ura+和兩個(gè)Ura-克隆。WT表示恥垢分枝桿菌野生型DNA。用Sph1消化基因組DNA，然后與攜帶pyrF基因的2.5kbSph1片段雜交。圖2表示用兩步篩選法，在分枝桿菌中產(chǎn)生不明顯突變的常用策略。在含慶大霉素(LUG)平板上進(jìn)行第一次篩選。在LUS上進(jìn)行第二次篩選以陽性篩選丟失了SacB基因的克??；pyrF*和SacB*表示那些基因的突變等位基因。圖3是在用圖2所述的兩步篩選策略，通過整合pPR34而得到的不同克隆的Southern印跡分析。用Sph1消化基因組DNA，然后與pyrF探針雜交。圖4是在2％蔗糖上篩選后(第二步)得到的代表性克隆5Ure和6Ure+的Southern印跡分析。已經(jīng)包括了兩個(gè)對照，BCG是對應(yīng)于牛分枝桿菌BCG的野生型DNA，BCGpPR24是單重組體。用PstI消化基因組DNA，然后與作為探針的pPR24載體雜交。圖5是用于在2％蔗糖上，通過兩步篩選法的等位基因交換誘變所常用的策略。第一步，在卡那霉素或慶大霉素上篩選單重組體。第二步，在2％蔗糖上陽性篩選丟失了SacB基因的克隆。SacB*表示SacB基因的突變等位基因?？s寫ureA，ureB和ureC是分枝桿菌脲酶的三個(gè)亞單位(Reyratetal.，1995)；Km，編碼卡那霉素抗性的Tn903基因；Gm，編碼慶大霉素抗性的aacCI基因；ori，大腸桿菌的復(fù)制起始區(qū)。圖6是描述質(zhì)粒pPR26的圖譜(C.N.C.M.No.I-1729)。圖7是描述質(zhì)粒pPR34的圖譜(C.N.C.M.No.I-1731)。圖8是描述質(zhì)粒pPV23(1)的圖譜(C.N.C.M.No.I-1726)。圖9是描述質(zhì)粒pPR27的圖譜(C.N.C.M.No.I-1730)。圖10是描述質(zhì)粒pPR25的圖譜(C.N.C.M.No.1-1728)。圖11是描述質(zhì)粒pPR24的圖譜(C.N.C.M.No.I-1727)。圖12是描述質(zhì)粒pPR2的圖譜(C.N.C.M.No.I-1725)。圖13描述用于陽性篩選稀少遺傳過程的新載體(以pPR27為例)。只列出了一個(gè)限制位點(diǎn)，可用該位點(diǎn)隨后克隆轉(zhuǎn)座子或突變的等位基因。圖14是代表性結(jié)核分枝桿菌Tn5368克隆的Soutbern印跡分析，和轉(zhuǎn)座突變體預(yù)期的雜交圖。隨機(jī)撿出5個(gè)突變體(克隆1-5)。以結(jié)核分枝桿菌103DNA(WT)為對照，并且，正如預(yù)期的，沒有雜交信號。用BamHI或XhoI消化基因組DNA，然后與pPR32載體雜交。分子量用kb表示。圖15描述了數(shù)個(gè)結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG轉(zhuǎn)座突變體之克隆插入位點(diǎn)的序列。用IS1096外向引物α和β確定位于轉(zhuǎn)座子側(cè)面的約500bp的DNA序列，但只列出了同向重復(fù)序列(DR)。有下劃線的是不完全重復(fù)的核苷酸。已經(jīng)表明編碼分泌酶果聚糖蔗糖酶(蔗糖2，6-β-D-果聚糖6-β-D-果糖基轉(zhuǎn)移酶；EC2.4.1.10)的枯草芽孢桿菌SacB基因在10％蔗糖上賦予分枝桿菌以蔗糖敏感性(Pelicicetal.，J.Bacteriol.1996)。篩選效率，恥垢分枝桿菌是的5×10-4，牛分枝桿菌BCG的是10-6，與已經(jīng)用SacB陽性篩選等位基因交換的其他細(xì)菌類似(CaiandWolk，1990；Cianciottoetal.，1988；Kanigaetal.，1991；Kamounetal.，1992；Schaferetal.，1994；Schweizer，1992)。檢測在分枝桿菌中用SacB作為基因取代過程的陽性篩選系統(tǒng)的可能性。選恥垢分枝桿菌的pyrF基因作為模型，因?yàn)橐郧?，已?jīng)將其用于該種中的同源重組試驗(yàn)。pyrF突變體是尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型，因此可以很容易地篩選。發(fā)現(xiàn)在蔗糖上用一步或兩步篩選很容易鑒定因等位基因交換而得到的pyrF突變體。用兩步篩選，將尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型突變體與pyrF基因中無標(biāo)記的確定的突變分開。這些結(jié)果表明，可以如何使用SacB以便有利于在分枝桿菌中完成有關(guān)等位基因交換的實(shí)驗(yàn)。pyrF等位基因交換的一步篩選pJQ200是攜帶活性分枝桿菌的慶大霉素抗性基因和枯草芽孢桿菌SacB基因的克隆載體(QuandtandHynes，1993)。從pY6002(Hussonetal.，1990)得到用aph盒破壞的pyrF基因，賦予卡那霉素抗性(pyrFKm)，然后插入到pJQ200中以得到pPR26。用pPR26通過電穿孔轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌。在用尿嘧啶補(bǔ)充的Luria-Bertani(L)培養(yǎng)基(LU)上篩選因同源整合而得到的轉(zhuǎn)化體，該培養(yǎng)基含有(i)卡那霉素(LUK)，作為用于重組頻率的經(jīng)典試驗(yàn)或(ii)卡那霉素和蔗糖(LUKS)以評估蔗糖篩選的可能性。在LUK上，電穿孔1μg載體得到約100個(gè)轉(zhuǎn)化體，而在LUKS平板上只有約5個(gè)，少20倍。在相同的條件下，于LUK和LUKS平板上，不含SacB基因的pY6002產(chǎn)生相同數(shù)目的菌落(數(shù)據(jù)未列出)。因此，當(dāng)在蔗糖上篩選時(shí)，在pPR26上的SacB導(dǎo)致大多數(shù)轉(zhuǎn)化體死亡。通過在不同的選擇培養(yǎng)基上影印培養(yǎng)來表征所述轉(zhuǎn)化體的表型。在LUK平板上篩選的大部分克隆(95％)是卡那霉素抗性(KmR)，慶大霉素抗性(GmR)，蔗糖敏感性(SucS)，尿嘧啶陽性(Ura+)，而且產(chǎn)生于pyrF基因的單重組(表1)。表1用pPR26轉(zhuǎn)化后，蔗糖的存在對從一步篩選回收的pyrF等位基因交換突變體之比例的影響總克隆的百分比(％)a生長培養(yǎng)基Ura-，KmR，GmsUra+，KmRGmR(等位基因交換)(簡單重組)LUK595LUKS1000a兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值用pyrF探針，通過Southern印跡分析這些轉(zhuǎn)化體的基因組DNA。這些克隆含插入到pyrF基因中的pPR26的完整拷貝，因此，擁有完整(2.5kbp)和失活的pyrF拷貝(3.8kbp)(圖1)。剩余的克隆5％是真正的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型，表型為KmR，Gms，SucR，Ura-。pyrF基因的內(nèi)源等位基因，相當(dāng)于Southern印跡上2.5kbp的Sph1片段，已經(jīng)被相應(yīng)于3.8kbp片段的失活拷貝所取代(圖1)。增加的1.3kbp相當(dāng)于用于使pyrF失活的卡那霉素抗性基因的大小。此外，用載體pJQ200作為探針，在營養(yǎng)缺陷體中未檢測到雜交信號(數(shù)據(jù)未列出)，表明已丟失了所述載體序列。在LUKS平板上篩選的所有轉(zhuǎn)化體(100％)表現(xiàn)KmR，Gms，SucR，Ura-表型，而且是在pyrF基因通過等位基因交換產(chǎn)生的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷體(表1)。通過Southern印跡分析來確定，得到雜交圖譜，所述圖譜不同于用在LUK平板上得到的營養(yǎng)缺陷體所觀察到的圖譜。參見圖1。在蔗糖上的一步篩選100％有效，因?yàn)槌チ讼鄳?yīng)于單重組的所有克隆(摻入了攜帶SacB基因的整個(gè)載體)。因此，用攜帶SacB基因的自殺載體進(jìn)行同源重組實(shí)驗(yàn)時(shí)，通過鋪在蔗糖上，可以直接篩選產(chǎn)生于等位基因交換的突變體。兩步篩選法接下來研究用兩步篩選等位基因交換的可能性。如果有關(guān)基因的基因交換頻率太低，而不能一步回收突變體，該方法就會有用。在第一步中，從在前述實(shí)驗(yàn)的LUK平板上得到的那些克隆中隨機(jī)篩選一個(gè)克隆。用表型(KmR，GmR，SucS，Ura+)和Southern印跡分析確定，該克隆相當(dāng)于pyrF基因的單重組。在用尿嘧啶補(bǔ)充的7H9培養(yǎng)基(Difco)(沒有抗生素篩選)中過夜繁殖所述克隆以便在pyrF座位發(fā)生缺失重組。任何所述重組均可以消除野生型或中斷的pyrF基因的等位基因。將培養(yǎng)物鋪在LUKS平板上(步驟2)以篩選丟失了SacB基因的細(xì)胞。得到了幾千個(gè)菌落，分析近200個(gè)克隆。正如用表型分析(表2)和Southern雜交(圖1)確定的，三分之二是尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型。剩余的菌落(1/3)，盡管是SucR，但不是尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型(KmR，GmR，SucR，Ura+)，可能相應(yīng)于在SacB基因有突變的克隆。表2蔗糖的存在對從兩步篩選回收的pyrF等位基因交換突變體之比例的影響總克隆的百分比(％)b轉(zhuǎn)化DNA生長培養(yǎng)基Ura-，GmS，SucRUra+，GmR，SucRUra+(等位基因交換)(SacB突變體)(回復(fù)體)pPR28LUKS6634NDPPR26LUS35758pPR34LUS27469a在第二步篩選中所用的培養(yǎng)基。b在各實(shí)驗(yàn)中分析至少192個(gè)克隆。ND檢測不到通過Southern印跡用pJQ200檢測基因組DNA這表明SacB突變是點(diǎn)突變(載體大小不改變)或可能因插入可轉(zhuǎn)座因子而產(chǎn)生的2kbp插入(數(shù)據(jù)未列出)?？赡懿东@的序列相當(dāng)于IS1096，它是用β-半乳糖苷酶作為報(bào)道基因，以相似的方法在恥垢分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)的(Cirilloetal.，1991)。這表明在恥垢分枝桿菌中，可以用SacB作為轉(zhuǎn)座子陷井，因?yàn)橐呀?jīng)將其用在大腸桿菌中(Gayetal.，1985)。重復(fù)所述實(shí)驗(yàn)，但在蔗糖平板上的第二個(gè)篩選步驟不含有卡那霉素(LUS)。與在LUKS平板上篩選相比，以相同的稀釋度稀釋可以得到多三倍的菌落。因此，認(rèn)為LUS平板上的大部分克隆均是對卡那霉素敏感的，而且是因丟失了中斷的pyrF等位基因(pyrFKm)(因此是Km盒)而產(chǎn)生的。通過表型(KmS，GmS，SucR，Ura+)(表2)和Southern印跡分析(圖1)來證明。少量的克隆(7％)是產(chǎn)生于SacB基因的突變。但得到的大量克隆是尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型(三分之一)，對應(yīng)于等位基因交換突變體。因此，用兩步法，可以在蔗糖上陽性篩選等位基因交換事件，甚至在第二篩選步驟中不使用抗生素篩選也可以。產(chǎn)生未標(biāo)記突變體在第二步，沒有抗生素篩選的情況下，兩步篩選的可行性表明可以產(chǎn)生如對其它細(xì)菌所描述的(Donnenbergetal.，1991；ReidandColimer，1987；Schaferetal.，1994；Soupèneetal.，1995)未標(biāo)記突變體。用BamH1從突變的等位基因pyrFKm(Hussonetal.，1990)切割aph基因，通過用T4DNA聚合酶補(bǔ)平，然后再連接產(chǎn)生移碼突變。將未標(biāo)記突變拷貝的pyrF基因(pyrF+)插入到pJQ200中以得到pPR34(圖2)。通過電穿孔，用pPR34轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌，在用慶大霉素補(bǔ)充的LU(LUG)上篩選從單同源重組事件產(chǎn)生的克隆pJQ200載體攜帶賦予慶大霉素抗性的sacC1基因(QUandtandHynes，1993)。表型和Southern印跡分析表明篩選的克隆產(chǎn)生于pyrF基因的單交換(數(shù)據(jù)未列出)。如上所述，在LUS培養(yǎng)基上完成第二步篩選。將克隆復(fù)制到M63基本培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。約1/3的克隆不能在基本培養(yǎng)基上生長，因此是尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型(表2)。這與前面用pPR26所做的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，在第二步中，沒有抗生素抗性選擇壓力(表2)。由于導(dǎo)入到pyrF基因中的移碼突變破壞了BamH1位點(diǎn)，所以在用BamH1酶切的DNA進(jìn)行的Southern印跡分析中，通過其營養(yǎng)缺陷型表型鑒定的等位基因交換突變體應(yīng)有不同的雜交圖譜。用Southern印跡分析數(shù)個(gè)Ura+回復(fù)體和Ura-突變體。正如預(yù)期的，回復(fù)體克隆有兩個(gè)與pyrF探針雜交的2.5kbp和5kbp片段。未標(biāo)記的營養(yǎng)缺陷型突變體有7.5kbp的單雜交BamH1片段，表明丟失了中心的BamH1位點(diǎn)(圖3)。因此，在第二步中，含有蔗糖篩選的兩步篩選能夠使我們分離在pyrF基因中攜帶已知，特異性損傷的未標(biāo)記突變體。總之，最近用rpsL基因作為逆可選擇標(biāo)記，將雙篩選策略用于恥垢分枝桿菌(Sandereta1.，1995)。然而，尚未描述所述策略適用于生長緩慢的分枝桿菌。rspL是賦予鏈霉素抗性菌株以鏈霉素敏感性的顯性標(biāo)記，所述鏈霉素抗性菌株在內(nèi)源rpsL等位基因中帶有突變。當(dāng)作為逆可選擇標(biāo)記時(shí)，rpsL產(chǎn)生鏈霉素(一種抗生素，仍是數(shù)種組合的抗結(jié)核病化療中的常用組分(WHO，1991))抗性的等位基因交換突變體。SacB有幾種令人感興趣的特征，使其在陽性篩選分枝桿菌的基因交換事件中可作為逆可選擇標(biāo)記。首先，SacB誘導(dǎo)致死現(xiàn)象不要求抗生素抗性菌株。第二，可以在兩步篩選策略中使用SacB。證明若所需基因的等位基因交換頻率很低而不能進(jìn)行一步篩選的情況下，該方法是有用的。第三，在兩步策略中，在蔗糖上的篩選效率很高，可以檢測產(chǎn)生未標(biāo)記確定突變體的稀少缺失。盡管抗生素標(biāo)記對于遺傳學(xué)研究是有用的，但在生產(chǎn)用作新疫苗的菌株時(shí)，未標(biāo)記突變體是必需的。此外，在構(gòu)建有多突變的菌株時(shí)，不需要相應(yīng)數(shù)量的抗生素抗性標(biāo)記。存在10％蔗糖的情況下，SacB(編碼果聚糖蔗糖酶的枯草芽孢桿菌基因)的表達(dá)對于分枝桿菌來說是致死的。本文描述了用SacB作為標(biāo)記用于陽性篩選恥垢分枝桿菌中的基因取代事件。用蔗糖逆可選擇自殺質(zhì)粒將失活的pyrF基因拷貝(pyrFKm)傳遞到恥垢分枝桿菌基因組中。在含卡那霉素和10％蔗糖的平板上，在一步篩選中，只有尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型克隆(因內(nèi)源pyrF等位基因取代而產(chǎn)生的)可以存活。這表明針對保持帶有SacB基因的載體在蔗糖上篩選是100％有效，能夠陽性篩選出等位基因交換突變體。兩步篩選也是可行的，用其構(gòu)建未標(biāo)記的pyrF突變體，其中通過移碼突變使所述基因失活。這種產(chǎn)生未標(biāo)記，正向突變的方法迅速簡單，從而使其成為遺傳表征分枝桿菌的有效工具。轉(zhuǎn)座子誘變轉(zhuǎn)座子誘變(常用于鑒定細(xì)菌毒力因子)是一種最有效的誘變方法。包括使用活動元件以便在轉(zhuǎn)座后可以隨機(jī)破壞染色體中的基因。用常規(guī)策略，即將轉(zhuǎn)座子傳遞到不能在分枝桿菌中復(fù)制的載體上，在牛分枝桿菌BCG，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物的成員中，一些分枝桿菌轉(zhuǎn)座子，包括McAdam等人(1995)描述的IS1096和IS6120以及IS6100衍生物(未公開的數(shù)據(jù))有轉(zhuǎn)座。由于電穿孔效率和轉(zhuǎn)座頻率很低，每次試驗(yàn)只能得到不到100個(gè)突變體(McAdam等人，1995)。然而，由于結(jié)核分枝桿菌估計(jì)含有3000個(gè)基因，因此，為了在每個(gè)基因中都產(chǎn)生突變，就需要得到近10000個(gè)突變體。因此，自殺傳遞載體不適用于構(gòu)建突變體的代表性文庫。產(chǎn)生突變體的另一方法是等位基因交換誘變。最近，在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物的細(xì)菌中有低頻率的等位基因交換，然后再用自殺傳遞載體證實(shí)(Reyratetal.，1995；Azadetal.，1996)，已經(jīng)開發(fā)了可以更容易地檢測等位基因交換突變體的新方法(Normanetal.，1995；Balasubramanianetal.，1996；Pelicicetal.，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.1996)。此外，就轉(zhuǎn)座子誘變而言，低轉(zhuǎn)化效率和高頻率的不合法重組妨礙了檢測極稀少的等位基因交換事件。因此，用現(xiàn)有技術(shù)，對許多基因仍很難進(jìn)行等位基因交換。顯然，兩種誘變系統(tǒng)均需要設(shè)計(jì)更有效的方法。通過使用在特定條件下可以有效丟失的可復(fù)制傳遞載體，可以繞開所碰到的問題。使導(dǎo)入的傳遞載體復(fù)制避免了低轉(zhuǎn)化效率而帶來的問題。然后在逆選擇條件下，除去了仍含所述載體的克隆，可以檢測很稀少的遺傳事件。已經(jīng)開發(fā)了一個(gè)所述系統(tǒng)用在39℃，恥垢分枝桿菌中有效丟失的條件可復(fù)制載體，用該快速生長模型菌株(Guilhotetal.，1994)構(gòu)建第一個(gè)分枝桿菌插入突變體文庫。此外，所用的熱敏感性載體只是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物緩慢生長分枝桿菌中的弱熱敏感性的，因此在這些種中，這些載體不能用于轉(zhuǎn)座或等位基因交換誘變(未公開數(shù)據(jù))。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了一個(gè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用SacB基因的逆選擇特性，和分枝桿菌熱敏感性復(fù)制起始區(qū)，并且能夠陽性篩選插入突變體。首先用基本方法將IS1096(Cirilletal.，1991)的衍生物傳遞到結(jié)核分枝桿菌的染色體中，從而構(gòu)建有關(guān)該重要病原體的第一個(gè)轉(zhuǎn)座突變體文庫。分析該文庫，而且是有代表性的。在構(gòu)建了本發(fā)明分枝桿菌轉(zhuǎn)座突變體文庫(具體為致病源)后，以其在所接種宿主中的增殖能力為基礎(chǔ)篩選其毒力減弱了的重組克隆。由于轉(zhuǎn)座突變體文庫含許多重組克隆(范圍為104-107cfu)，所以就需要進(jìn)行大量的工作來篩選在宿主巨噬細(xì)胞中有低增殖指數(shù)的所需克隆。這是由于用特定克隆感染至少5個(gè)動物以確保其增殖和免疫原和/或保護(hù)特性的事實(shí)。結(jié)果，優(yōu)選使用插入在轉(zhuǎn)座子中可以精確鑒定每個(gè)克隆的寡核苷酸標(biāo)記。寡核苷酸標(biāo)記是已知序列的雙鏈多核苷酸，長度為20-40個(gè)核苷酸。然后，將所述標(biāo)記連接到用于構(gòu)建轉(zhuǎn)座子突變體文庫的所需轉(zhuǎn)座子中。該技術(shù)使得可以同時(shí)給動物(例如Balb/c小鼠)施用一百個(gè)以上的重組標(biāo)記克隆，然后篩選在宿主中有所需增殖特性的克隆。然后用所述寡核苷酸標(biāo)記為探針，精確鑒定所選的克隆。Hensel等人(1995)和Mahan等人(1993)(引入本文作為參考)詳細(xì)描述了該技術(shù)?？梢杂帽景l(fā)明的載體轉(zhuǎn)座將穩(wěn)定拷貝的所需基因?qū)氲椒种U菌菌株中。所需基因優(yōu)選是編碼抗原蛋白質(zhì)的基因，因此可以在例如BCG疫苗菌株中克隆保護(hù)性抗原。利用本發(fā)明的重組載體，在分枝桿菌菌株中，轉(zhuǎn)座子插入(也稱為插入序列)的另一應(yīng)用是隨機(jī)失活編碼與起始分枝桿菌致病菌株毒力有關(guān)之蛋白質(zhì)的基因。一旦鑒定了所述基因后，就可以針對使所述蛋白質(zhì)失活或使所鑒定基因的表達(dá)無效的特性篩選治療價(jià)值化合物。在下列實(shí)施例中將更詳細(xì)地描述本發(fā)明的代表性實(shí)施方案。等位基因交換的實(shí)驗(yàn)方法細(xì)菌菌株和培養(yǎng)基在該研究中所用的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒列于表3。大腸桿菌常規(guī)生長在液體或固體Luria-Bertanl(“L”)培養(yǎng)基中，使用20μg/ml的卡那霉素和慶大霉素。恥垢分枝桿菌生長在用0.2％甘油和0.05％吐溫補(bǔ)充的液體Middlebrook7H9培養(yǎng)基(Dufco)，或固體L培養(yǎng)基中。需要時(shí)，可以包含下列濃度的抗生素卡那霉素20μg/ml和慶大霉素5μg/ml。表3在該研究中所用的細(xì)菌質(zhì)粒和菌株菌株/質(zhì)粒相關(guān)特征來源/文獻(xiàn)菌株大腸桿菌Dh5αφ80dlacZ△M15recA1endA1GibcoBRLhsdR17(rk，mk-)恥垢分枝桿菌mc155高度可轉(zhuǎn)化突變體Snapper等人(1990)質(zhì)粒pY6001在Sau3A1片段上含有恥垢分支Husson等人(1990)桿菌pyrF基因的pUC19pY6002aph盒插入在pY6001的BamHI中Husson等人(1990)得到pyrFkmpJQ2000含SacB和aacC1的克隆載體QuandtandHynes(1993)pPR2b在pY6002的XbaI-MluI片段上含本工作pyrFkm的pJQ200pPR33切割pY6002的aph基因，補(bǔ)平得到pyrF+本工作pPR34在pPR33XbaI-MluI片段上含pyrF+本工作的pJQ200在用卡那霉素(LUK)或慶大霉素(LUG)補(bǔ)充的LU培養(yǎng)基(含0.2mM尿嘧啶的L培養(yǎng)基)上篩選轉(zhuǎn)化體。在指示處加入10％蔗糖(LUS或LUKS平板)。根據(jù)其不能在以葡萄糖為唯一碳源的M63基本培養(yǎng)基上生長來鑒定尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型。DNA操作限制酶，T4DNA聚合酶和T4DNA連接酶分別購自BoehringerMannheim，Amersham，和GibcoBRL。所有的酶均按制造商的說明使用。用Qiagen制劑(QiagenInc.)分離質(zhì)粒DNA。用GenecleanII試劑盒(BIO101Inc.)凝膠純化在克隆過程和放射性標(biāo)記中所用的DNA片段。電轉(zhuǎn)化細(xì)菌用稍加改變的Sander等人(1995)的方法制備電感受態(tài)細(xì)菌。使細(xì)菌在400mlL(大腸桿菌)或7H9培養(yǎng)基(恥垢分枝桿菌)中生長，達(dá)到OD600＝0.4。用10％甘油洗滌三次后，將細(xì)胞重新懸浮在1ml10％甘油中。用單脈沖(2.5kv，25μF，200ohms)在0.2cm小杯(Bio-Rad)中用1μg載體DNA電穿孔新鮮制備的等份(100μl)mc2155細(xì)胞。溫育3-4天后，撿出單個(gè)菌落，然后重懸在于96孔微滴定板中等分的7H9培養(yǎng)基中。用影印培養(yǎng)器(Sigma)在不同的選擇性培養(yǎng)基上同時(shí)復(fù)制48個(gè)克隆。分離基因組DNA并進(jìn)行Southern分析按如下分離分枝桿菌基因組DNA離心(15分鐘，5000xg)沉淀來自5ml培養(yǎng)物的細(xì)胞。將沉淀重懸在250μl溶液1(25％蔗糖，50mMTris-HCl，pH8.0，50mMEDTA，500μg/ml溶菌酶)中，并在37℃溫育過夜。然后加入250微升的溶液II(100mMTris-HCl，pH8.0，1％SDS，400μg/ml蛋白酶K)，55℃將樣品溫育4小時(shí)。用酚-氯仿將DNA抽提2次，然后用乙醇沉淀濃縮。用過量限制酶(30U)過夜消化1微克基因組DNA，然后用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離。用Hybond-N+尼龍膜(Amersham)在20xSSPE(150mMNaCl，8.8mMNaH2PO4，1mMEDTA，pH7.4)中用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等人，1989)完成Southern印跡。用Megaprime隨機(jī)引發(fā)的標(biāo)記試劑盒(Amersham)和5μmCi|α-32P|-dCTP標(biāo)記探針。通過Nick柱(Pharmacia)過濾除去未摻入的標(biāo)記。用RH緩沖液(Amersham)，按制造商所述65℃完成預(yù)雜交和雜交。按如下完成系列的15分鐘洗滌用2xSSPE，0.1％SDS洗滌2次，用1xSSPE，0.1％SDS洗滌1次，用0.7xSSPE，0.1％SDS洗滌2次。于-80℃將印跡暴露于X-OmatARX-射線膠片(柯達(dá))過夜。構(gòu)建載體通過將平整末端的XbaI-MluI片段(5.9kbp)(含有從pY6002(Hussonetal.，1990)上切割的pyrFKm等位基因)插入到SmaI切割的pJQ200載體(QuandtandHynes，1993)來構(gòu)建pPR26。通過BamHI消化從pY6002中切下用于使pyrF基因失活的aph盒，通過用T4DNA聚合酶制成平整末端，然后再連接而在pyrF基因中導(dǎo)入一移碼突變，得到pPR33。通過將平整末端的XbaI-MluI片段(4.6kbp)(含突變拷貝的pyrF+)克隆到pJQ200的SmaI位點(diǎn)來構(gòu)建pPR34。在構(gòu)建pPR33的過程中，在再連接前，去掉制成平整末端步驟來重建pY6001(Hussonetal.，1990)。在Southern印跡實(shí)驗(yàn)中，用相當(dāng)于pyrF基因的pY6001的2.5kbpSphI片段作為探針。在過去的十年間，分枝桿菌的遺傳表征很大程度上得益于有效遺傳系統(tǒng)的發(fā)展，這種發(fā)展導(dǎo)致鑒定了在毒力中可以起作用的數(shù)個(gè)基因(Jacobs，1992)。但是，由于很難完成等位基因交換，所以妨礙了構(gòu)建確定的突變體，所述突變體可以更好地理解結(jié)核病的生理病理學(xué)(Jaeobs等人，1991)。由于雙交換事件的稀少以及不合法重組的水平高，如果有一點(diǎn)可能的話，分離基因交換突變體也是很困難的。盡管有這些困難，用傳統(tǒng)誘變方法(RuvkinandAusubel，1981)已經(jīng)完成了在快速生長的恥垢分枝桿菌中的等位基因交換(Hussonetal.，1990)；將通過插入了抗生素抗性標(biāo)記而體外失活的基因放在自殺載體上而傳遞進(jìn)入了細(xì)菌中。等位基因交換突變體的比例是可變的而且通常很低，占不到轉(zhuǎn)化體的10％(Hussonetal.，1990)。在緩慢生長的分枝桿菌中，雙交換與單重組和不合法重組的比例甚至更不適宜。這可以部分解釋為什么在來自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物的分枝桿菌中完成等位基因交換的努力均未成功(Aldovinietal.，1993；Kalpanaetal.，1991)。盡管如此，還是表明用編碼脲酶亞單位的UreC基因，可以在牛分枝桿菌B(G中完成等位基因交換(Reyratetal.，1995)。Reyrat等人利用了用簡單的比色試驗(yàn)可以監(jiān)測脲酶活性的事實(shí)，這樣簡化了其它費(fèi)時(shí)的轉(zhuǎn)化體篩選步驟(Reyratetal.，1995)。Ure克隆只占轉(zhuǎn)化體的4％。同時(shí)，另兩組在生長緩慢的分枝桿菌中成功地鑒定了低頻等位基因交換(Marklundetal.，1995；Normanetal.，1995)。因此雙重組體的總比例通常比恥垢分枝桿菌的低，它主要是依賴所選的基因。此外，幾個(gè)不同基因LeuD(Balasubramanianetal.，1996)，purC(Jackson，pers.comm.)的同源重組頻率太低以致不能在經(jīng)典基因交換實(shí)驗(yàn)中檢測雙重組體(RuvkinandAusubel，1981)。存在蔗糖SacB的情況下，SacB的表達(dá)對于分枝桿菌來說是致死的，使其作為有用的逆可選擇標(biāo)記用于陽性篩選基因取代事件，正如在快速生長的恥垢分枝桿菌中所說明的。用相同的方法，用蔗糖逆選擇載體，可以將失活拷貝的ureC基因(ureCKm)傳遞到牛分枝桿菌BCG基因組中，所述ureC基因編碼分枝桿菌脲酶。在2％蔗糖上的兩步篩選方法使得可以陽性篩選基因交換突變體。因此，該方法對于遺傳分析致病分枝桿菌特別方便。ureC單重組體的篩選就在恥垢分枝桿菌中的實(shí)驗(yàn)而言，我們所用的蔗糖逆選擇自殺載體是pJQ200(QuandtandHynes，1993)。從pJ△64K(Reyrat等人，1995)切下在SacI-KpnI片段上的ureCKm突變等位基因，制成平整末端，沿插入片段的方向，插入到SmaI切割的pJQ200中以產(chǎn)生pPR24或pPR25。隨機(jī)選擇pPR24以用于隨后的實(shí)驗(yàn)，然后通過電穿孔用于轉(zhuǎn)化牛分枝桿菌BCG。然而，用pPR25得到相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未列出)。在用卡那霉素補(bǔ)充的7H10培養(yǎng)基上選擇因?qū)PR24同源或不合法重組到染色體中而得到的轉(zhuǎn)化體。電穿孔1μg的閉合環(huán)狀(cc)pPR24載體得的相似。用尿/吲哚比色試驗(yàn)(MeyerandDavid，1979)通過表型表征轉(zhuǎn)化體菌落將紅色的記為Ure+，將黃色的記為Ure-。只有4％的轉(zhuǎn)化體是Ure，因此是產(chǎn)生于等位基因交換事件(表4)。表42％蔗糖對ureC等位基因交換突變體比例的影響培養(yǎng)基a總克隆的百分比(％)bUre-cUre+c不含蔗糖(一步)496含2％蔗糖(兩步)2674a選擇培養(yǎng)基是用卡那霉素(20μg/ml)補(bǔ)充的7H10。b分析50個(gè)克隆。cUre-沒有顏色改變；Ure+顏色變成紅色。結(jié)果與在起始等位基因交換實(shí)驗(yàn)(Reyrat等人，1995)中，由Reyrat等人已經(jīng)描述的絕對一致。為了按上述在蔗糖上對恥垢分枝桿菌進(jìn)行兩步篩選(Pelicicetal，Mol.Microbiol.1996)，人們需要選擇在靶基因中對應(yīng)單重組的克隆。在7H9中增殖5個(gè)隨機(jī)選擇的Ure+轉(zhuǎn)化體直到飽和。提取基因組DNA并用載體pPR24為探針，用Southern印跡分析。令人驚奇的是，所有克隆均對應(yīng)單同源重組事件，而且含有插入到ureC基因中的完整拷貝的pPR24(圖4)。這與以前，用其它基因所作的等位基因交換試驗(yàn)中所描述的相反，分析的大部分克隆，高達(dá)80％均產(chǎn)生于不合法重組，而不是同源重組(Aldovinietal.，1993；Kalpanaetal.，1991)。這種差異可能是由于所用基因的長度和結(jié)構(gòu)。兩步法陽性篩選等位基因交換突變體當(dāng)在不含抗生素的7H9中增殖時(shí)，上述單重組可能要經(jīng)兩種變化，賦予其Kmr，Sucr(i)在第二次交換中，細(xì)胞可能丟失SacB基因，(ii)SacB可能因點(diǎn)突變，缺失或插入而失活(圖5)。第二次同源重組的頻率很低，在恥垢分枝桿菌的pyrF基因中估計(jì)為10-5(Hussonetal.，1990)。因此，盡管對于有確定和容易篩選表型的基因來說，檢測等位基因交換突變體是可能的，但對于篩選是在Southern印跡實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上的絕大部分基因來說實(shí)際上是不可能的。在用2％蔗糖補(bǔ)充的7H10-Km上，以1/50的稀釋度鋪展單重組克隆培養(yǎng)物。與我們的前述實(shí)驗(yàn)相反(Pelicicetal.，J.Bacteriol.1996；Pelicicetal.，Mol.Microbiol.1996)，因?yàn)榇嬖?0％蔗糖時(shí)，未轉(zhuǎn)化的牛分枝桿菌BCG的生長顯著降下來，所以將蔗糖濃度降到2％(Pelicicetal.，J.Bacteriol.1996)。篩選效率仍然相同，而在2％蔗糖上，生長速率不受影響(Pelicicetal.，J.Bacteriol.1996)。從1ml培養(yǎng)物中得到500個(gè)Sucr，Kmr菌落，用表型試驗(yàn)分析50個(gè)克隆。Ure-突變體的比例比經(jīng)典實(shí)驗(yàn)中的高得多，增加了6倍(表4)。也是用Southern印跡確定的，試驗(yàn)的近1/4的菌落(26％)相當(dāng)于等位基因交換突變體(圖4)。剩余的克隆(74％)盡管有Sucr，但是Ure-，可能相當(dāng)于在SacB基因有突變的克隆。在Southern印跡實(shí)驗(yàn)中，用pPR24檢測其基因組DNA，表明載體大小沒有顯著改變，說明SacB突變是點(diǎn)突變或微缺失(圖4)。與在恥垢分枝桿菌中觀察到的不同，用pyrF基因，觀察不到對應(yīng)于IS元件插入的突變體?？傊砻饔肧acB作為逆可選擇標(biāo)記，可以用兩步法陽性篩選等位基因交換突變體，而且在生長緩慢的牛分枝桿菌BCG中很有效。就用相同的方法，在恥垢分枝桿菌中得到的結(jié)果而言，在蔗糖上篩選的高比例克隆是等位基因交換突變體。在可以用經(jīng)典誘變方法進(jìn)行等位基因交換的情況下，在蔗糖上的一步篩選大大減少了為了分離突變體而待檢測的克隆數(shù)量。因此，已經(jīng)設(shè)計(jì)了一種通用方法，使在結(jié)核分枝桿菌中產(chǎn)生確定突變體比現(xiàn)在的更容易，從而為進(jìn)一步遺傳表征這種重要的病原體鋪平了道路。此外，當(dāng)通過移碼突變?nèi)〈虻目股乜剐院校缓笤诓缓股貕毫Φ恼崽桥囵B(yǎng)基上進(jìn)行兩步篩選時(shí)，該方法可以產(chǎn)生未標(biāo)記突變體。轉(zhuǎn)座子誘變的實(shí)驗(yàn)方法細(xì)菌菌株和培養(yǎng)條件在該克隆實(shí)驗(yàn)研究中所用的菌株大腸桿菌DH5α常規(guī)生長在液體或固體Luria-Bertani(L)培養(yǎng)基中。使恥垢分枝桿菌mc2155(Snapperetal.，1990)，結(jié)核分枝桿菌103(從結(jié)核病患者中分離的)和牛分枝桿菌BCG巴斯德在用0.2％甘油和0.05％吐溫補(bǔ)充的液體Middlebrook7H9培養(yǎng)基(Difco)或固體Middlebrook7H10培養(yǎng)基(Difco)上生長。需要時(shí)，以下列濃度包含抗生素對于分枝桿菌卡那霉素20μg/ml，慶大霉素5μg/ml，對于大腸桿菌慶大霉素20μg/ml。按照標(biāo)明的，分別對恥垢分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物細(xì)菌加入10％或2％蔗糖(Pelicicetal.，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.1996；Pelicicetal.，J.Bacteriol.1996)。電轉(zhuǎn)化按上述，但稍加改變制備電感受態(tài)細(xì)胞。使結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG在200ml7H9培養(yǎng)基中生長到OD600＝0.4。用10％甘油將細(xì)胞洗滌3次，然后重懸在1ml10％甘油中。用單脈沖(2.5kv；25pF；200(ohms)，在0.2cm小杯(Biorad)中，存在1μg載體DNA的條件下，電穿孔新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞等份試樣(100μl)。然后加入5ml新鮮培養(yǎng)基，在鋪平板前，將培養(yǎng)物在32℃溫育24小時(shí)，以表達(dá)抗生素抗性。32℃溫育7-8星期后，記錄轉(zhuǎn)化體。DNA提取和Southern分析按所述，但稍加改變分離分枝桿菌基因組DNA將100μlD-環(huán)絲氨酸(1mg/ml)加到10ml飽和的培養(yǎng)物中，然后在37℃溫育過夜。離心(15分鐘，5000xg)沉淀細(xì)胞。將沉淀重懸在250μl溶液I(25％蔗糖，50mMTris-HCl，pH8.0，50mMEDTA，500μg/ml溶菌酶)中，并在37℃溫育過夜。然后加入250微升的溶液II(100mMTris-HCl，pH8.0，1％SDS，400μg/ml蛋白酶K)，55℃將樣品溫育4小時(shí)。用酚-氯仿抽提溶菌物2次，然后用乙醇沉淀濃縮DNA。用過量限制酶(30U)過夜消化約1微克基因組DNA，然后用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離片段。用Hybond-N+尼龍膜(Amersham)在20xSSPE(150mMNaCl，8.8mMNaH2PO4，1mMEDTA，pH7.4)中完成Southern印跡。用Megaprime隨機(jī)引發(fā)的標(biāo)記試劑盒(Amersham)和5μCi[α-32P]-dCTP標(biāo)記探針。通過Nick柱(Pharmacia)過濾除去未摻入的標(biāo)記。用RH緩沖液(Amersham)，按制造商所述65℃完成預(yù)雜交和雜交。按如下完成系列的15分鐘洗滌用2xSSPE，0.1％SDS洗滌2次，用1xSSPE，0.1％SDS洗滌1次，用0.7xSSPE，0.1％SDS洗滌2次。于-80℃將BioMaxMSX-射線膠片(柯達(dá))暴露于印跡4小時(shí)。構(gòu)建基因組文庫用KpnI或BamHI消化來自轉(zhuǎn)座子突變體的染色體DNA，在轉(zhuǎn)座子中不切割，用QIAquick核苷酸去除試劑盒(QIAGBN)純化。用KpnI-或BamHI-消化的并去磷酸化的“即將克隆的”載體pUC18(Appligene)構(gòu)建質(zhì)粒文庫。在L-卡那霉素上篩選對應(yīng)于整合轉(zhuǎn)座子和側(cè)序列的轉(zhuǎn)化體。DNA測序用DNAAnalysisSystem373型(AppliedBiosystems)和TaqDyeDeoxyTerminatorCycleSequencing試劑盒(AppliedBiosystems)確定雙鏈質(zhì)粒DNA的序列。用以IS1096序列(Cirilloetal.，19910)為基礎(chǔ)的外向引物α5’-CTTCCGCTTCTTCTCCGG-3’和β5’-CCATCATCGGAAGACCTC-3’。構(gòu)建載體從5kbBamHI(完整pAL5000)或3.7kbEc0RV+KpnI(最小復(fù)制起始區(qū))片段(Guilhot等人，1992)上的pB4D★提取存在于ts-SacB傳遞載體中的pAL5000的熱敏感復(fù)制起始區(qū)。將片段制成平整末端，然后克隆到含SacB基因的BamHI切割的pJQ200(QuandtandHynes，1993)中。3.7kb“短”插入片段得到了兩個(gè)方向的(pPR23-1和pPR23-2)，5kb插入片段只有一個(gè)方向(pPR27)。通過將平整末端的HindIII(4kbp)片段(含IS1096Km衍生物，從pYUB285和pYUB297(McAdam等人，1995)中切出)，插入到平整末端的BamHI切割的pPR23或pPR27載體中構(gòu)建誘變載體。按照傳遞載體(pPR23或pPR27)，使用的轉(zhuǎn)座子(Tn5367或Tn5368)和轉(zhuǎn)座子方向，得到5個(gè)不同的誘變載體pPR28到pPR32。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，已經(jīng)將IS1096Km保藏在巴黎的微生物培養(yǎng)物國家收集中心(C.N.C.M.)，登記號為。設(shè)計(jì)并試驗(yàn)用于篩選插入突變體的新方法如上所討論的，我們現(xiàn)已表明，存在蔗糖時(shí)，表達(dá)來自枯草芽孢桿菌的SacB基因?qū)τ诜种U菌是致死的。因此SacB可以作為逆選擇標(biāo)記。因此，我們檢測SacB是否可用于陽性篩選插入突變體。構(gòu)建一系列的條件復(fù)制載體，結(jié)合SacB基因和分枝桿菌熱敏感性復(fù)制起始區(qū)的逆選擇特性(圖13)。將這些ts-SacB載體通過電穿孔導(dǎo)入到恥垢分枝桿菌mc2155(Snapperetal.，1990)中。使在32℃7H10-慶大霉素上篩選的恥垢分枝桿菌轉(zhuǎn)化體在7H9中于32℃生長直到飽和。然后通過在不同溫度，將100μl這些培養(yǎng)物的樣品鋪在含有或不含10％蔗糖的7H10-慶大霉素平板上，然后計(jì)數(shù)菌落形成單位(CFU)來估計(jì)不同逆選擇的效率。通過將樣品在39℃(復(fù)制的限制溫度)鋪板，不加蔗糖，來測量pAL5000熱敏感性復(fù)制起始區(qū)的穩(wěn)定性。存在10％蔗糖的情況下，通過將樣品在32℃鋪板估算SacB逆選擇的效率。通過39℃鋪在蔗糖平板上，估算總逆選擇(表5)。逆選擇壓力，蔗糖和生長溫度單獨(dú)均很低而且只會導(dǎo)致有限地丟失載體。然而，當(dāng)就SacB和熱敏感性復(fù)制起始區(qū)逆選擇轉(zhuǎn)化體時(shí)，逆選擇效率非常高(表5)。表5蔗糖和溫度對用pPR27轉(zhuǎn)化的恥垢分枝桿菌的影響a生長條件每100μlCFU逆選擇效率32℃1.2×107…39℃50004.2×10-432℃蔗糖30002.5×10-439℃蔗糖65×10-7a用pPR23得到相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未給出)。該結(jié)果表明可以用ts-SacB載體將轉(zhuǎn)座子或突變等位基因傳遞到結(jié)核分支桿菌的染色體中以便分別構(gòu)建插入突變體文庫或基因交換突變體?？梢詫⒃摵Y選方法用于所有隨后的誘變實(shí)驗(yàn)。由于轉(zhuǎn)化體可以在允許的條件下生長，所以避免了因低轉(zhuǎn)化效率而帶來的問題。在該復(fù)制步驟中，因等位基因交換或轉(zhuǎn)座而產(chǎn)生的突變體可以積累，克服了因等位基因交換和轉(zhuǎn)座頻率低而帶來的問題。最后，除去了仍含有載體的大部分克隆，顯著提高了存活者中的突變體比例。構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG的轉(zhuǎn)座突變體文庫首先在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物的細(xì)菌中試驗(yàn)ts-SacB載體的轉(zhuǎn)座子誘變情況。所發(fā)明的篩選方法意味著含逆選擇SacB基因的傳遞載體應(yīng)在轉(zhuǎn)座后丟失以便陽性篩選轉(zhuǎn)座突變體。換句話說，所用的轉(zhuǎn)座子應(yīng)以保守方式轉(zhuǎn)座(McAdam等人，1994)。唯一適用于我們系統(tǒng)的已知分枝桿菌活動元件是IS1096(Cirillo等人，1991)在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物分枝桿菌的染色體中未發(fā)現(xiàn)該元件；其轉(zhuǎn)座是隨機(jī)的而且多半保守。此外，IS1096衍生物(在該活動元件內(nèi)插入了卡那霉素抗性盒)(IS1096Km)能夠在牛分枝桿菌BCG中轉(zhuǎn)座(McAdam等人，1995)。將兩種不同的IS1096衍生物，Tn5367和Tn5368克隆到pPR23和pPR27傳遞載體中，得到一系列誘變載體，通過電穿孔將這些載體導(dǎo)入到結(jié)核分枝桿菌103和牛分枝桿菌BCG中。使用上述的選擇策略。39℃，在7H10-卡那霉素+2％蔗糖平板上篩選推測的插入突變體，其中IS1096Km可能已轉(zhuǎn)座到染色體中。當(dāng)鋪展107個(gè)細(xì)菌起始接種物時(shí)，結(jié)核分枝桿菌和疫苗菌株分別為104和105個(gè)菌落。用Southern印跡，以pPR32為探針，分析隨機(jī)撿出的5個(gè)結(jié)核分枝桿菌(pPR32)轉(zhuǎn)化體。使用BamHI時(shí)，預(yù)期有兩個(gè)不同大小的雜交片段(圖14)。由于XhoI在IS1096Km中切兩次，所以預(yù)期轉(zhuǎn)座突變體存在3個(gè)雜交片段(圖14)一個(gè)保守長度的片段(是活動元件固有的)，和因轉(zhuǎn)座是隨機(jī)的，而使得突變體之間大小不同的兩個(gè)片段。所試驗(yàn)的所有克隆的雜交圖譜均與Tn5368轉(zhuǎn)座到結(jié)核桿菌染色體的轉(zhuǎn)座一致(圖14)。這也用其它限制酶得到確定(數(shù)據(jù)未列出)。以傳遞載體為探針，即不含插入的轉(zhuǎn)座子的pPR27分析相同印跡。未檢測到雜交信號(數(shù)據(jù)未列出)，表明在轉(zhuǎn)座過程中已經(jīng)丟失了傳遞載體。用結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG，將獨(dú)立的轉(zhuǎn)座實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)5次，所有誘變載體均得到了相似的Southern雜交結(jié)果。用Southern印跡分析檢測了200個(gè)以上的突變體，95％以上的克隆產(chǎn)生于IS1096Km轉(zhuǎn)座到染色體中。但是，應(yīng)注意到在某些實(shí)驗(yàn)中，數(shù)個(gè)克隆有相同的雜交圖譜，表明它們是同胞。這是未預(yù)料到的，可能是因?yàn)檎T變方法包括一個(gè)步驟，其中可能的突變體能夠進(jìn)行復(fù)制。盡管如此，大多數(shù)不同克隆的雜交圖譜是特有的，表明IS1096轉(zhuǎn)座按前述隨機(jī)發(fā)生(McAdam等人，1995)。為了證明轉(zhuǎn)座的隨機(jī)性，克隆并測序幾個(gè)插入位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)了屬于轉(zhuǎn)座子的同向重復(fù)(DR)，表明克隆的確是產(chǎn)生于轉(zhuǎn)座事件(圖15)。2個(gè)克隆myc3和myc6有不完全的DR，可能是產(chǎn)生于復(fù)制錯(cuò)誤。此外，結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG突變體之間的DR的長度不同分別為7bp和8bp。就我們所知，這是所述現(xiàn)象的第一個(gè)報(bào)道DR長度對于發(fā)生轉(zhuǎn)座的菌株是有特異性的。這種菌株特異性的機(jī)制尚不知道。重要的是，盡管優(yōu)先A+T豐富的靶，但I(xiàn)S1096似乎沒有位點(diǎn)特異性，因?yàn)樗蟹治龅牟迦胛稽c(diǎn)均不同(圖15)。這些結(jié)果證實(shí)，ts-SacB載體的確適合將轉(zhuǎn)座子傳遞到結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物細(xì)菌的染色體中。此外，該方法可靠而且完全可重復(fù)，能夠構(gòu)建含106以上不同轉(zhuǎn)座突變體的插入突變體文庫?？傊?，本發(fā)明首次提供一個(gè)單一的，非常簡單的系統(tǒng)，可以用其通過等位基因交換或轉(zhuǎn)座很容易地誘變結(jié)核分枝桿菌。用ts-SacB載體成功地將分枝桿菌轉(zhuǎn)座子傳遞到結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物的兩種細(xì)菌結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG的染色體中。絕大部分篩選的克隆(95％以上)是插入突變體，在其染色體中插入了IS1096Km拷貝。此外，Southern印跡分析(圖14)和側(cè)區(qū)測序(圖15)表明突變體文庫是代表性的，其數(shù)量大于106個(gè)突變體，含插入在各種位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座子?？赡芡蛔凅w庫含克隆，其中已經(jīng)將3000個(gè)非必需分枝桿菌基因突變了至少一次。因此這些文庫對于鑒定無致病力突變體(可能不能侵入上皮細(xì)胞或不能在巨噬細(xì)胞中復(fù)制)是極為有用的，其中已經(jīng)破壞了必需的毒力因子(逐步進(jìn)行)。本發(fā)明根據(jù)Koch的分子假設(shè)(Falkow，1988；Jacobs，1992)對結(jié)核分枝桿菌致病性的遺傳學(xué)分析產(chǎn)生了很大影響它使得通過等位基因交換或轉(zhuǎn)座子誘變(兩者以前均是困難或甚至不可行的)產(chǎn)生了分枝桿菌突變體。它不僅打開了研究確定的分枝桿菌基因(它們與其它細(xì)菌病原體的已知致病因子可能存在或不存在相似性)在致病性方面作用的道路，而且使得可以合理構(gòu)建減毒的菌株，其作為抗結(jié)核疫苗比BCG更有效。參考文獻(xiàn)Aldovini，A.，Husson，R.N.，andYoung，R.A.(1993)TheuraAlocusandhomologousrecombinationinMycobacteriumbovisBCG.J.Bacteriol1757282-7289.Azad，A.K.，Sirakova，T.D.，Rogers，L.M.&Kolattukudy，P.B.(1996)Proc.Nat.Acad.Sci.USA934787-4792.Balasubramanian，V.，Pavelka，Jr.M.S.，Bardarov，S.S.，Martin，J.Weisbrod，T.R.，McAdam，R.，Bloom.B.R.，andJacobs，Jr.W.R.(1996)AllelicexchangeinMycobacteriumtuberculosiswithlonglinearrecombinationsubstrates.J.Bacteriol178273-279.Cai，Y.，andWolk，P.C.(1990)UseofaconditionallylethalgeneinAnabaenasp.strainPCC7120toselectfordoublerecombinantsandtoentrapinsertionsequences.J.Bacteriol1723138-3145.Clanciotto，N.P.，Long，R.，Eisenstein，B.I.，andEngleberg，N.C.(1988)Site-specificmutagenesisinLegionellapneumophilabyallelicexchangeusingcounter-selectableColE1veclors.FEMSMicrobiolLett56203-208.Cirillo，J.D..Barletta，R.G.，Bloom，B.R.，andJacobs，Jr，W.R.(1991)AnoveltransposontrapformycobacteriaisolationandcharacterizationofIS1096.J.Bacteriol1737772-7780.Desomer，J.，Crespi.M.，andVanMontagu.M.(1991)Illegitimateintegrationofnon-replicativevectorsinthegenomeofRhodococcusfasciansuponelectro-transformationasaninsertionalmutagenesissystem.MolMicrobiol52115-2124.Donnenberg，M.S.，andKaper，J.B.(1991)ConstructionofanesedeletionmutantofenleropathogenicEscherichiacolibyusingapositive-selectionsuicidevector.InfectImmun594310-4317.Falkow，S.(1988)MolecularKoch′spostulatesappliedtomicrobialpathogenicity.RevInfecDis10S274-S276.Gay，P.，LeCoq，D.，Steinmetz，M.Berkelman，To.，andKadoC.I.(1985)PositiveselectionprocedureforentrapmentofinsertionsequenceelementsinGram-negativebacteria.J.Bacteriol164918-921.Guilhot，C.，Otal，I.，vanRompaey，I.，Martín，C.&Gicquel，B.(1994)J.Bacteriol.176535-539.Guilhot，C.，Gicquel，B.&Martín，C.，(1992)FEMSMicrobiol.Lett.98181-186.Hensel，M.，Shea，J.E.，Gleeson，C.，Jones，M.D.，Dalton，E.&Holden，D.W.(1995)Simultaniousidentificationofbacterialvirulencegenesbynegativeselection.Science.26＿＿.Husson，R.N.，James，B.E.，andYoung，R.A.(1990)GeneandexpressionofforeignDNAinmycobacteria.J.Bacteriol.172519-524.Jacobs，Jr.，W.R.(1992)Advancesinmycobacterialgeneticsnewpromisesforolddiseases.Immunobiology184147-156.Jacobs，Jr.，W.R.，Kalpana，G.V.，Cirillo，J.D.，Pascopella，L.，Snapper，S.B.，Udani，R.A.，Jones，W.Barletta，R.G.，andBloom，B.R.(1991)Geneticsystemsformycobacteria，MethEnzymol204537-555.Jackson，M.，personalcommunication.Kalpana，G.V.，Bloom，B.R.，andJacobs，Jr.W.R.(1991)，Insertionalmutagenesisandillegitimaterecombinationinmycobacteria.ProcNatlAcadSciUSA885433-5437.Kamoun，S.，Tola，E.，Kamdar，H.，andKado，C.I.(1992).RapidgenerationofdirectedandunmarkeddeletionsinXanthomonas.MolMicrobiol6809-816.Kaniga，K.，Delor，I.，andCornells，G.R.(1991)Awide-host-rangesuicidevectorforimprovingreversegeneticsinGram-negativebacteriaInactivationoftheblaAgeneofYersinlaenterocolitca.Gene109137-141.Mahan，M.J.，Slauch，J.M.&Mekalanos，J.J.(1993)Selectionofbacterialvirulencegenesthatarespecificallyinducedinhosttissues.Science259685-688.Marklund，B.I.，Speert，D.P.，andStokes，R.W.(1995)GenereplacementthroughhomologousrecombinationinMycobacteriumintracellulare.J.Bacteriol1776100-6105.McAdam，R.，Guilhot，C.&Gicquel，B.(1994)inTuberculosis，ed.Bloom，B.R.(ASMPress，Washington，DC)，pp.199-216.McAdam，R.，Weisbrod，T.R.，Martin，J.，Scuderi，J.D.，Brown，A.M.，Cirillo，J.D.，Bloom，B.R.，&JacobsJr.，W.R.(1995)Infect.Immunol.631004-1012.Meyer，L.，andDavid，H.L.，(1979)Evaluationdel′activitéuréaseetdel′activitéβ-glucosidasepourl′identificationpratiquedesmycobactéries.Ann.Inst.PasteurMicrobiol.130B323-332.Norman，E.，Dellagostin，O.A.，McFadden，J.，andDale，J.W.(1995)GenereplacementbyhomologousrecombinationinMycobacteriumbovisBCG.MolMicrobiol16755-760.Pelicic，V.，Reyrat，J.M.，andGicquet，B.(1996)ExpressionoftheBacillussubtillisSacBgeneconferssucrosesensitivityonmycobacteria.J.Bacteriol.1781197-1199.Pelicic，V.J.-MReyra，andB.Gicquel.(June11，1996)Generationofunmarkeddirectedmutationsinmycobacteria，usingsucrosecounter-selectablesuicidevectors.Mol.Microbiol.20(5)919-925.Pelicic，V.，Reyrat，J.-M.&Gicquel，B.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