專利名稱：：修飾的膠原誘導(dǎo)血小板凝集抑制劑Pallidipin的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種修飾的抑制膠原誘導(dǎo)血小板凝集的抑制劑(稱為Pallidipin)的制備方法，還涉及這種物質(zhì)即修飾的Pallidipin。膠原是人血小板凝集的已知最強的誘導(dǎo)物。例如，當(dāng)血管壁損傷并接觸膠原時，血小板迅速粘附并活化。(H.R.Baumgartner(1977)，《血栓形成和血停滯》(Thromb.Haemostas)371-16；J.Hawiger(1987)，《人類病理學(xué)》，1811-122)。因而人血小板的膠原誘導(dǎo)的血小板凝集尤其對經(jīng)歷血管相關(guān)過程(例如血管形成術(shù)或膿毒病)的病人、對患心肌梗塞形成的病人，對心肌梗塞形成的治愈病人構(gòu)成危險因素。在一些情況下需要抑制膠原誘導(dǎo)的血小板凝集。已知一些化合物抑制這種凝集。例如，合成寡肽與血小板結(jié)合抑制膠原誘導(dǎo)的血小板凝集，見如Bevers等(1985)，“膠原衍生的八肽抑制膠原和凝血酶聯(lián)合作用引起的血小板凝固作用”，《血栓形成研究》，37365-370；Karniguian等(1983)“膠原衍生的八肽對血小板/膠原相互作用的不同步驟的影響”，《血栓形成研究》，32593-604；Cean等(1981)“具有特異性抑制膠原誘導(dǎo)凝集特性的寡肽，其制備方法和含有它們的藥物組合物”；及EPA0040149。膠原誘導(dǎo)血小板凝集的抑制劑的另一來源是在蛇毒中鑒定的具有未知結(jié)構(gòu)的抑制劑，見Smith等“特異性抑制血小板與膠原粘附的50KD蛇毒蛋白的鑒定”，(1991)FEBS283307-310。第三種抑制劑來自醫(yī)用水蛭的唾液，由Munro等報道“Calin-來自醫(yī)用水蛭唾液的一種血小板粘附抑制劑”，《血凝固和纖維蛋白溶解》，2179-184。歐洲專利申請EP0480651的公開文本(Merck公司，1992年4月15日出版)中描述了一種分子量約16KD具有抑制人血小板的膠原誘導(dǎo)凝集之能力的蛋白，該蛋白來自水蛭HaemaenteriaOfficinalis的唾液腺。LAPP是來自水蛭HaemaenteriaOfficinalis的16KD蛋白，由Connlly等(1992)報道《生物學(xué)化學(xué)雜志》，2676893-6898。還見Moubatin，由Waxman和Connolly報道(1993)《生物學(xué)化學(xué)雜志》，2685445-5449。另一類膠原誘導(dǎo)血小板凝集抑制劑從昆蟲中分離得到，如歐洲專利公開EP0530937中所述。這些蛋白稱為“Pallidipin”。堿性磷酸酶(AP酶)是分泌在周質(zhì)空間的一種大腸桿菌蛋白。AP酶被合成為一種前體蛋白，具有21個氨基酸長的引導(dǎo)序列，該序列在跨細菌內(nèi)膜轉(zhuǎn)移到周質(zhì)空間的過程中被前導(dǎo)肽酶剪去(Y.Kikuchi等(1981)《核酸研究》，95671-5678)。其生物合成受培養(yǎng)基中的磷酸鹽濃度調(diào)節(jié)，在低磷酸鹽濃度下使得AP酶啟動子下游外源基因的產(chǎn)物輸出(C.Monteilhet等(1993)《基因》125223-228)。Pallidipin的天然來源有限。利用生物技術(shù)方法是制備Pallidipin的合理解決辦法。Pallidipin在倉鼠胎腎細胞中的表達(EP0530937)，其產(chǎn)率有待提高以在工業(yè)量的水平上表達Pallidipin。因而需要一種改進的表達系統(tǒng)。需要一種制備重組Pallidipin(其抑制血小板凝集)的改進方法，該方法具有高收率并能以高純度可重現(xiàn)地分離蛋白。這種新方法應(yīng)對生成的Pallidipin蛋白的生物活性無不利影響。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)通過一種重組Pallidipin蛋白(Asp-Pallidipin)的制備方法可以解決上述問題，其中Asp-Pallidipin抑制哺乳動物血小板的膠原誘導(dǎo)凝集，該Asp-Pallidipin包含(i)選自Pallidipin蛋白群的一種蛋白(Pallidipin)，和(ii)天冬氨酸，其中天冬氨酸通過肽鍵與Pallidipin的N-末端連接；從而Asp-Pallidipin具有下列氨基酸序列a)以下序列表中所示序列aa)SEQIDNO1；bb)SEQIDNO2或cc)SEQIDNO3；或b)SEQIDNO1-3中任何序列的等位變體或修飾體、或突變蛋白，該等位變體或修飾體或突變蛋白基本不影響蛋白的活性，或c)進行了翻譯后修飾的SEQIDNO1-3中任一蛋白或b)中所述其變體或突變蛋白，該修飾基本不影響成熟蛋白的活性；該方法包括以下步驟aa)用適當(dāng)載體轉(zhuǎn)染至少一種細菌，該載體包含(i)編碼重組Asp-Pallidipin的DNA或cDNA(ii)適當(dāng)?shù)男盘栯男蛄校撔盘栃蛄斜磺谐髲腜allidipin的位置看天冬氨酸位于氨基酸序列和+1位，和(iii)適當(dāng)?shù)膯幼樱籦b)表達包括Asp-Pallidipin和信號序列的前蛋白；cc)Asp-Pallidipin從細菌胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至周質(zhì)，在轉(zhuǎn)運過程中前蛋白被至少一種蛋白酶裂解，產(chǎn)生Asp-Pallidipin，dd)提取周質(zhì)分離Asp-Pallidipin，和ee)純化Asp-Pallidipin。大腸桿菌是生產(chǎn)外源性(如真核的)蛋白的快速表達系統(tǒng)。大腸桿菌表達真核基因產(chǎn)物過程中常發(fā)生蛋白的正確折疊的問題，這能造成表達產(chǎn)物的活性降低。蛋白轉(zhuǎn)運至大腸桿菌周質(zhì)中比保留在胞質(zhì)中時正確折疊的可能性高得多。蛋白向胞質(zhì)中轉(zhuǎn)運是由附在成熟蛋白上的信號肽序列誘導(dǎo)的；這些信號肽序列與成熟蛋白序列一起被稱為“前蛋白”。前蛋白中信號肽序列和成熟蛋白之間的正確裂解是在大腸桿菌中表達成熟真核蛋白所必需的；信號序列的序列和成熟蛋白的序列都對正確裂解有影響。因而不是所有信號肽序列與所有編碼序列都相容。已知大腸桿菌堿性磷酸酶信號序列對前蛋白的輸出有效。但人們知道一種給定信號肽序列與一種成熟蛋白序列結(jié)合不一定能造成前蛋白的良好加工。令人驚異地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明制備方法的產(chǎn)率比使用倉鼠胎腎細胞的表達系統(tǒng)高15倍。這些結(jié)果示于實施例中。與真核的倉鼠胎腎表達系統(tǒng)相比，本發(fā)明的方法對Asp-Pallidipin的功能和活性沒有不利影響。另一優(yōu)點是前蛋白裂解所需的蛋白酶(如前導(dǎo)肽酶)由大腸桿菌自身產(chǎn)生。與產(chǎn)生并存儲在細菌胞質(zhì)中的表達蛋白的純化相比，使用本發(fā)明方法成熟Asp-Pallidipin的純化要容易的多。滲壓震擾足以釋放積累在周質(zhì)中的Asp-Pallidipin。在一優(yōu)選方案中，編碼信號肽序列的DNA編碼堿性磷酸酶(優(yōu)選腸桿菌AP酶)的信號序列。本發(fā)明的一種方法中，本發(fā)明Asp-Pallidipin的載體衍生自載體pSB94(V.Boidol等(1982)，《分子基因遺傳學(xué)》(Mol.Gen.Genet.)185510-512)。本發(fā)明的另一方面是以上提及的載體，以及適當(dāng)?shù)男盘栯?、適當(dāng)?shù)膯幼雍托枰獣r適當(dāng)?shù)脑鰪娮?。實施例中的文獻對載體有詳細描述，也見歐洲專利公開EP0480651；0462632和0173177。大腸桿菌是優(yōu)選的宿主，其他微生物也適用，如枯草芽胞桿菌。另外，本發(fā)明涉及一種重組蛋白Asp-Pallidipin，它抑制哺乳動物血小板的膠原誘導(dǎo)凝集，該Asp-Pallidipin包含(i)選自Pallidipin蛋白群的一種蛋白(Pallidipin)，和(ii)天冬氨酸，其中天冬氨酸通過肽鍵與Pallidipin的N-末端連接；從而Asp-Pallidipin具有下列氨基酸序列a)以下序列表中所示序列aa)SEQIDNO1；bb)SEQIDNO2或cc)SEQIDNO3；或b)SEQIDNO1-3中任何序列的等位變體或修飾體、或突變蛋白，該等位變體或修飾體或突變蛋白基本不影響蛋白的活性，或c)進行了翻譯后修飾的SEQIDNO1-3中任一蛋白或b)中所述其變體或突變蛋白，該修飾基本不影響成熟蛋白的活性。本發(fā)明還包括一種重組蛋白Asp-Pallidipin，它抑制哺乳動物血小板的膠原誘導(dǎo)凝集，該Asp-Pallidipin包含(i)選自Pallidipin蛋白群的一種蛋白(Pallidipin)，和(ii)天冬氨酸，其中天冬氨酸通過肽鍵與Pallidipin的N-末端連接；從而Asp-Pallidipin具有下列氨基酸序列a)以下序列表中所示序列aa)SEQIDNO1；bb)SEQIDNO2或cc)SEQIDNO3；或b)SEQIDNO1-3中任何序列的等位變體或突變蛋白，該等位變體或突變蛋白基本不影響蛋白的活性，或c)進行了翻譯后修飾的SEQIDNO1-3中任一蛋白或b)中所述其變體或突變蛋白，該修飾基本不影響成熟蛋白的活性；其中該Asp-Pallidipin是由包括以下步驟的方法制得的aa)用適當(dāng)載體轉(zhuǎn)染至少一種細菌，該載體包含(i)編碼重組Asp-Pallidipin的第一DNA或cDNA分子(ii)編碼適當(dāng)?shù)男盘栯男蛄械牡诙﨑NA分子，和(iii)適當(dāng)?shù)膯幼?；從而在表達和轉(zhuǎn)運至周質(zhì)時，包含信號肽和Asp-Pallidipin的前蛋白被裂解，以使天冬氨酸位于成熟Asp-Pallidipin氨基酸序列的+1位，bb)表達包括Asp-Pallidipin和信號序列的前蛋白；cc)Asp-Pallidipin從細菌胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至周質(zhì)，在轉(zhuǎn)運過程中前蛋白被至少一種蛋白酶裂解，產(chǎn)生成熟的Asp-Pallidipin，dd)提取周質(zhì)分離Asp-Pallidipin，和ee)純化Asp-Pallidipin。在一更優(yōu)選的方案中，Asp-Pallidipin是由包括以下步驟的方法制得的在適當(dāng)條件下培養(yǎng)用適當(dāng)載體轉(zhuǎn)染的細菌，其中所述載體包括有效連接的(i)編碼重組Asp-Pallidipin的第一DNA或cDNA，(ii)編碼適當(dāng)信號肽序列的第二DNA分子，和(iii)適當(dāng)?shù)膯幼?；且表達后包括信號肽和Asp-Pallidipin的前蛋白被裂解，使天冬氨酸處于成熟Asp-Pallidipin氨基酸序列的+1位，其中所述條件使包括Asp-Pallidipin和信號肽的前蛋白表達，及Asp-Pallidipin從細菌胞質(zhì)運送到周質(zhì)，在運送過程中前蛋白被至少一種蛋白酶裂解，產(chǎn)生成熟的Asp-Pallidipin，及從周質(zhì)中純化Asp-Pallidipin。優(yōu)選的蛋白中信號肽序列是堿性磷酸酶(AP酶)的，優(yōu)選大腸桿菌AP酶的信號序列。本發(fā)明蛋白的工業(yè)應(yīng)用是該蛋白用于藥物組合物，其含有本發(fā)明的蛋白和藥用稀釋劑或載體。上文提到的等位變異或修飾包括核苷酸或氨基酸序列中的改變、基因型或表型的改變。至少一個核苷酸或一個氨基酸可以被替代、缺失或插入。大部分缺失、插入和替代不會對本發(fā)明蛋白的特征產(chǎn)生大的改變。本發(fā)明的修飾或突變蛋白可用常規(guī)方法制得，并通過突交或修飾蛋白的功能與本發(fā)明蛋白(如SEQIDNO1-3的蛋白)的特征功能或與天然Pallidipin比較進行篩選，以確定所述替代、缺失或插入的確切影響，從而確定變異蛋白是否具有可比性活性，例如生物活性。遺傳密碼具有簡并性；即大部分氨基酸由一個以上的三聯(lián)密碼子編碼。因而，核苷酸序列中的等位變異或修飾可以改變也可以不改變氨基酸序列。所以等位變異主要在DNA水平，也可以次要地存在于氨基酸序列水平上。可用常規(guī)技術(shù)修飾編碼本發(fā)明蛋白的DNA序列以在本發(fā)明的終蛋白中產(chǎn)生變異，但該終蛋白仍與本發(fā)明蛋白(如SEQIDNO1-3的Asp-Pallidipin)或與天然Pallidipin蛋白相比具有基本相同的活性。按實施例中所述方法測定活性。所以增加、替代或去除一個或多個氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10…直到15個氨基酸，而基本不影響本發(fā)明蛋白的活性。當(dāng)希望精細地調(diào)節(jié)本發(fā)明蛋白的氨基酸序列時，一般可以按下表1進行替代。當(dāng)選擇的替代比表1中所示那些保守性較小時可使蛋白功能或免疫特征產(chǎn)生實質(zhì)性改變，即選擇的殘基在對保持(a)替代區(qū)中多肽骨架的結(jié)構(gòu)，如片狀或螺旋形構(gòu)象，(b)分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈體積的影響方面更顯著地區(qū)別。表1蛋白質(zhì)中氨基酸的正常替代原殘基替代示例AlaGly，SerArgLysAsnGln，HisAspGluCysSerGlnAsnGluAspGlyAla，ProHisAsn，GlnIleLeu，ValLeuIle，ValLysArg，Gln，GluMetLeu，Tyr，IlePheMet，Leu，TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp，PheValIle，Leu突變蛋白由兩種比較蛋白間的同源性來定義?！巴葱浴卑▋煞N比較序列的氨基酸相似性和序列中的間斷。氨基酸的相似性例如表1中所示。本發(fā)明的突變蛋白優(yōu)選包含與SEQIDNO1-3之一的蛋白有至少60％、更優(yōu)選至少80％、特別優(yōu)選至少90％、最優(yōu)選至少95％同源性的氨基酸序列。上文提及的“翻譯后變異”意指在翻譯過程中或之后的變異，例如形成二硫橋及氨基酸的化學(xué)修飾。蛋白質(zhì)常形成鏈內(nèi)共價鍵。在折疊蛋白中或在翻譯過程中折疊的蛋白中半胱氨酸-SH之間形成這些二硫鍵。這些鍵穩(wěn)定了蛋白的三維結(jié)構(gòu)。仍在細胞胞液中的蛋白分子中很少形成這種二硫鍵，因為細胞內(nèi)高濃度的-SS-(二硫醚)還原劑谷胱甘肽破壞了大部分這種鍵。一些蛋白質(zhì)離開胞質(zhì)、被分泌或處在細胞表面，它們常常形成另外的鏈內(nèi)共價鍵。另外，氨基酸可以按PCT申請WO91/10684中所述進行改變。氨基酸側(cè)鏈也可能改變。本發(fā)明的蛋白具有至少40％，優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選至少90％的純度。純度定義為本發(fā)明蛋白的量與蛋白總量之比。使用實施例中描述的方法檢測不到本發(fā)明蛋白之外的其他蛋白。使用本發(fā)明的純化蛋白，按照熟知的Koehler-Milstein方法可產(chǎn)生單克隆抗體，該方法特別包括用本發(fā)明的純化蛋白作為免疫原常規(guī)免疫小鼠或兔子，然后從小鼠或兔子的產(chǎn)抗體細胞產(chǎn)生雜交瘤。本發(fā)明的優(yōu)選方案是在大腸桿菌株E15中表達的SEQIDNO1中所述蛋白。Asp-Pallidipin顯示藥理活性并因此可用作藥物。Asp-Pallidipin可用于包含Asp-Pallidipin及與其結(jié)合的藥用稀釋劑或載體的藥物組合物中。另外，本發(fā)明包括含藥理活性的本發(fā)明Asp-Pallidipin和一種藥用鹽或藥用載體的藥物組合物。具體講，Asp-Pallidipin抑制由膠原誘導(dǎo)的血小板凝集，抑制腫瘤細胞(優(yōu)選轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞)與膠原的粘附。Asp-Pallidipin抑制血小板凝集。試驗系統(tǒng)在實施例中描述。Asp-Pallidipin以0.5-50μg蛋白的濃度顯著抑制血小板凝集。按照實施例，最優(yōu)選的Asp-Pallidipin即SEQIDNO1蛋白的IC50為50nmol/L高度純化蛋白。Asp-Pallidipin在5nmol/L到約1,000nmol/L濃度下抑制血小板凝集。體外試驗系統(tǒng)的結(jié)果表明本發(fā)明蛋白可用作藥物或可用于醫(yī)學(xué)治療。該體外系統(tǒng)的試驗結(jié)果可與體內(nèi)系統(tǒng)相關(guān)，因為它是本領(lǐng)域中確立的系統(tǒng)。R.J.Shebuski等(1990)，《血栓形成和血停滯》，64576-581。Asp-Pallidipin可經(jīng)腹膜內(nèi)注射給藥，可每天給藥或每周2-3次。當(dāng)動物每天接受注射達血濃度100nmol/L時，它們的血小板凝集降低。在這些條件下沒有觀察到嚴(yán)重的付作用。以取得約10nmol/L到1,000nmol/L血濃度的日劑量，Asp-Pallidipin在小鼠中造成血小板凝集的抑制。因此，Asp-Pallidipin可用于治療動脈粥樣硬化或血栓形成疾病損傷或用于預(yù)防心肌梗塞形成治療后的再閉塞。Asp-Pallidipin可用作哺乳動物(包括人)的抗動脈粥樣硬化和抗血栓形成藥，例如用于治療如由動脈粥樣硬化斑破裂造成的或由如膿毒癥或移植中表皮紊亂或去除所造成的動脈粥樣硬化/血栓形成損傷，或用于治療不穩(wěn)定性絞痛。它還可用于防止心肌梗塞形成經(jīng)纖維蛋白溶解或血管形成術(shù)(PTCA)治療后的再閉塞。如果用纖維蛋白溶解療法(用鏈激酶、t-PA或其他纖維蛋白溶酶原活化劑)治療心肌梗塞形成，Asp-Pallidipin可用作輔助藥物以防止血管再閉塞。用氣球?qū)Ч?PTCA)治療心肌梗塞形成也損傷血管壁，這可能導(dǎo)致新血栓的形成。這可以通在操作過程中或之后使用Asp-Pallidipin來防止。Asp-Pallidipin可以用于冠狀血管形成術(shù)以及其他血管形成術(shù)中。本發(fā)明提供a)本發(fā)明蛋白在制備治療動脈粥樣硬化或血栓形成疾病或預(yù)防心肌梗塞形成治療后再閉塞的藥物中的應(yīng)用(因而該蛋白可用作已知有患這種病癥危險的病人的預(yù)防性藥物)；b)治療動脈粥樣硬化或血栓形成疾病或防止心肌梗塞形成治療后再閉塞的方法，該方法包括給予需要這種治療的患者制病有效量的本發(fā)明蛋白；c)包含本發(fā)明蛋白和藥用載體或稀釋劑的藥物組合物，用于治療動脈粥樣硬化或血栓形成疾病或用于防止心肌梗塞形成治療后的再閉塞。當(dāng)然對這些適應(yīng)癥的適當(dāng)劑量將根據(jù)如所用的本發(fā)明的化合物、宿主、給藥方法和待治療病狀的嚴(yán)重性而變化。但一般以達到10-1,000nmol/L(優(yōu)選30-300nmol/L)血濃度的日劑量在動物中能取得滿意的結(jié)果。本發(fā)明蛋白可以任何常規(guī)途徑給藥，特別是胃腸或非胃腸途徑，例如以可注射溶液或懸液的形式。優(yōu)選腹膜內(nèi)注射。SEQIDNO1的蛋白是優(yōu)選的化合物。本發(fā)明提供包含本發(fā)明化合物和與其結(jié)合的至少一種藥物載體或稀釋劑的藥物組合物。這種組合物可以常規(guī)方法制備。見《Remington藥物科學(xué)》，第15版，Mack出版公司，賓夕法尼亞Easton(1980)。本發(fā)明蛋白還抑制轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞與膠原的粘附。試驗系統(tǒng)在實施例中描述。本發(fā)明的蛋白在1-100μg蛋白的濃度下顯著抑制轉(zhuǎn)移腫瘤細胞與膠原的粘附。最優(yōu)選的蛋白即SEQIDNO1的蛋白的試驗表明根據(jù)實施例2和5，其IC50值為100nmol/L高度純化蛋白。本發(fā)明蛋白在10-2,000nmol/L的濃度下抑制轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞與膠原的粘附。體外試驗系統(tǒng)的結(jié)果表明本發(fā)明的蛋白可用作藥物或所用于醫(yī)學(xué)治療。可以將該體外系統(tǒng)的試驗結(jié)果轉(zhuǎn)移到體內(nèi)系統(tǒng)，因為它是本領(lǐng)域內(nèi)已確立的系統(tǒng)。Chan等(1990)，《科學(xué)》，21600-1602。可以在原發(fā)腫瘤的手術(shù)治療中或之后給予本發(fā)明的蛋白，以防止剝離的腫瘤細胞(在手術(shù)中所能進入血流)形成轉(zhuǎn)移。這些抗轉(zhuǎn)移效果的說明見Chan等(1990)，《科學(xué)》，21600-1602中描述的“試驗”和“自發(fā)”動物模型。本發(fā)明蛋白可經(jīng)腹膜內(nèi)注射給藥，每天一次或每周2到3次。當(dāng)動物接受每天一次的注射達到200nmol/L血濃度時，通過對轉(zhuǎn)移細胞移居點計數(shù)測得其轉(zhuǎn)移腫瘤細胞的粘附性減小。在這些條件下沒有觀察到嚴(yán)重的付作用。在達到20-2,000nmol/L(優(yōu)選60-600nmol/L)血濃度的日劑量下，本發(fā)明蛋白在小鼠中顯示對移移腫瘤細胞與膠原的粘附性的抑制作用。因而本發(fā)明蛋白可用于治療癌，尤其是有轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的癌，最優(yōu)選具有高度轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的癌。本發(fā)明從而提供a)本發(fā)明蛋白在制備治療有轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞之癌的藥物中的用途(該蛋白因而可用作如手術(shù)去除腫瘤之前給藥的預(yù)防性藥物)；b)具有轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的癌癥的一種治療方法，其包括給予需要這種冶療的患者制病有效量的本發(fā)明蛋白；c)包含本發(fā)明蛋白和藥用載體或稀釋劑的治療有轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞之癌的藥物組合物。當(dāng)然對這些適應(yīng)癥的適當(dāng)劑量將根據(jù)如所用的本發(fā)明的化合物、宿主、給藥方法和待治療病狀的產(chǎn)重性而變化。但一般以達到20-2,000nmol/L(優(yōu)選60-600nmol/L)血濃度的日劑量在動物中能取得滿意的結(jié)果。本發(fā)明蛋白所以任何常規(guī)途徑給藥，特別是胃腸或非胃腸途徑，例如以可注射溶液或懸液的形式。SEQIDNO1的蛋白是優(yōu)選的化合物。本發(fā)明提供包含本發(fā)明化合物和與其結(jié)合的至少一種藥物載體或稀釋劑的藥物組合物。這種組合物可以常規(guī)方法制備。見《Remington藥物科學(xué)》，第15版，Mack出版公司，賓夕法尼亞Easton(1980)。本發(fā)明的另一方面是提供DNA序列、含有這些序列的載體、含有所述載體的細胞、產(chǎn)生蛋白的重組方法和對本發(fā)明蛋白的抗體。還提供供編碼一種抑制人血小板的膠原誘導(dǎo)凝集的蛋白的分離的和/或重組DNA序列(如基因組的或cDNA)。還有，本發(fā)明提供例如具有本發(fā)明所公開序列的重組產(chǎn)生的本發(fā)明蛋白。術(shù)語“分離的”意指本發(fā)明抑制劑或其他物質(zhì)以與伴隨其重組或合成生產(chǎn)而來的其他成分分離的形式存在(純化形式)。一般包括所有程度的這種分離或純化。優(yōu)選的分離或純化程度是使抑制劑可用于藥物目的。這種分離程度(如活性或純度)例如可通過色譜技術(shù)(如實施例中所用的那些)按常規(guī)方法達到。進一步的純化(例如至均一)可用常規(guī)方法進行，例如下列文獻中所述方法《酶學(xué)方法》，182卷，蛋白質(zhì)純化指南，MurrayP.Deutscher編，學(xué)術(shù)出版社，1990；《蛋白純化應(yīng)用-實用方法》，E.L.VHarris和S.Angel編，IRL出版社，1990；《蛋白質(zhì)純化，原理和實踐》，RobertScopes，Springer-Verlag，1982；和《蛋白質(zhì)純化，原理，高分辨方法和應(yīng)用》，J-C.Janson和L.Ryden編，VCH出版社，1989?？捎扇魏我环N常規(guī)方法測定純度，例如SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、分析型HPLC等。純化的抑制劑可用于測定蛋白的氨基酸序列，方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員完全是常規(guī)的。Hewick，R.M.等，(1981)，《生物學(xué)化學(xué)雜志》，256，7990-7997。本發(fā)明抑制劑的氨基酸序列可用于確定適當(dāng)DNA探針的序列，這種探針可用于如在其他種系中發(fā)現(xiàn)新抑制劑。這種探針可以按常規(guī)方法合成，例如用自動DNA合成儀，篩選基因組成cDNA文庫對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也是常規(guī)的(見國際申請WO90/07861，1990年7月26日)。因而本發(fā)明還包括相應(yīng)于(編碼)從天然環(huán)境分離的(如在溶液中或載體中)Asp-Pallidipin及其突變蛋白DNA序列的DNA序列。突變蛋白的制備方法對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是常規(guī)的，測試這種新蛋白效力的篩選方法也是如此，例如本文中描述的方法。適合的突變蛋白應(yīng)具有本文所述抑制劑的部分生物活性，如抑制膠原誘導(dǎo)的血小板凝集，例如至少5％，優(yōu)選至少50％，最優(yōu)選至少90％的生物活性。本發(fā)明還包括一種純化方法，其中包括以下連續(xù)步驟(i)經(jīng)陽離子交換色譜純化；(ii)經(jīng)陰離子交換純化，和(iii)經(jīng)大小排阻純化。相信本領(lǐng)域技術(shù)人員利用以上描述無需進一步努力可以完全實施本發(fā)明。因此下列優(yōu)選的具體實施方案僅僅用于說明而不以任何方式限制本發(fā)明公開的其余部分。在上文和以下實施例中，所有溫度是未矯正的攝氏度；除非另有說明，所有份和百分?jǐn)?shù)以重量計。上文和下文(如有的話)中引用的所有申請、專利和出版物(包括1994年9月2日申請的EP94250224.6)的整個公開內(nèi)容都并入本文作為參考。實施例實施例1表達載體的構(gòu)建為構(gòu)建編碼Asp-Pallidipin的本發(fā)明載體，使用了下列正義和反義引物p35′-GCGATATCGCGACGAAGAATGCGAACTCATG-3′(Nrul)(SEQIDNO4)；和p45′-GCGATAGGATCCAAGCTTATTACTTCATGTTATC-3′(BamHI)(SEQIDNO5)用P3和P4作為引物對和1μg模板DNA進行PCR94℃2分鐘、42℃1分30秒和72℃2分30秒，8個循環(huán)。凝膠純化及用Nrul和BanH1消化后，將片段亞克隆到pSB/pho中。通過Xmal消化，然后用綠豆核酸酶處理鈍化5’凸出部分再用BamH1消化制備該質(zhì)粒。利用二脫氧鏈終止法(F.Sanger等(1977)，《Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA》745463-5467)和有[35S]dATP的測序試劑盒對插入片段進行完全DNA測序，以驗證上述結(jié)構(gòu)。按標(biāo)準(zhǔn)方法(J.Sambrook(1989)，《分子克隆實驗室手冊》，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)，用Pallidipin表達結(jié)構(gòu)或空質(zhì)粒(模擬轉(zhuǎn)化)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E15。實施例2Asp-Pallidipin的表達和提取對于質(zhì)粒pSB/pho(衍生自pSB94；見J.Daum等(1989)，《歐洲生物化學(xué)雜志》，185347-354)，E15過夜培養(yǎng)物(S.J.Hayashi等(1964)，《生物學(xué)化學(xué)雜志》，2393091-3106)在低磷酸鹽培養(yǎng)基中稀釋至8％(v/v)，于37℃生長6小時。(A.Bvecker等(1994)，《蛋白質(zhì)表達和純化》，550-56)。培養(yǎng)后離心收集細菌，重懸于1/10體積的50mmol/LTris-HCl(pH8.0)/100mmol/LNaCl中。將制得的懸液冷凍、融化并離心，從而得到第一上清液部分(SN1)。重懸細菌層，離心前在0.5mol/L蔗糖中室溫平衡10分鐘。上清液(SN2)留作分析，將沉淀重懸于補有1mmol/LPMSF(苯甲磺酰氟)的冰冷水中，在冰上保溫10分鐘。在此滲壓震擾后，離心出細胞，收集上清液(SN3)。含有胞質(zhì)部分(CF)的沉淀重懸在50mmol/LTris-HCl(pH8.0)/100mmol/LNaCl中。實施例3重組Asp-Pallidipin的純化含有大部分重組Asp-Pallidipin的上清液部分(SN1)用醋酸調(diào)至pH4.0，用FPLC系統(tǒng)上樣于陽離子交換柱(MonoS，Pharmacia)。用pH4.0醋酸鈉中0-500mmol/LNaCl的梯度洗滌，用20mmol/LNaPi(pH7.0)得Asp-Pallidipin洗脫液。合并含Asp-Pallidipin的洗脫部分(用SPS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和免疫印跡判斷)，調(diào)至pH8.0，上樣于陰離交換柱(Fractogel-EMD-TMAE650，Merck)。用20mmol/L醋酸鈉(pH8.4)中0-1mol/LNaCl梯度洗脫Asp-Pallidipin。為進行最終純化，合并含Asp-Pallidipin的洗脫部分，在Seed-Vac(Bachofer)中濃縮，用Superose12(Pharmacia)進行大小排阻色譜。實施例4血小板凝集試驗基本按文獻中所述進行該試驗(C.Noeske-Jungblut(1994)，《生物學(xué)化學(xué)雜志》，2695050-5053)。簡單講，將人血液采集在1/6體積的71mmol/L檸檬酸/85mmol/L檸檬酸三鈉/111mmol/L葡萄糖中，135g離心20分鐘得到富含血小板的血漿。Asp-Pallidipin與500μl富血小板血漿于37℃保溫1分鐘，然后加入膠原(2μg/ml)。用Micron集合度計監(jiān)測凝集，確定最大值。IC50值為約50nM。在第一位有或無Asp的化合物間未顯著差別。測定從大腸桿菌周質(zhì)空間純化的Asp-Pallidipin的生物活性和產(chǎn)率。富血小板血漿與Asp-Pallidipin及對照一起保溫，加入膠原誘導(dǎo)凝集，以從唾液中純化的野生型Pallidipin作為陽性對照。還有其他一些結(jié)構(gòu)用作對照，以顯示本發(fā)明Asp-Pallidipin的優(yōu)點。本發(fā)明蛋白和對照表現(xiàn)不同的產(chǎn)率。表2</tables>實施例5在本發(fā)明蛋白存在下腫瘤細胞與膠原的粘附性減小本發(fā)明的蛋白抑制腫瘤細胞與膠原基質(zhì)的粘附。因此，當(dāng)本發(fā)明的蛋白處于患者血液或血漿中時，能夠部分地或完全阻止遷移的腫瘤細胞停居在器官或血管中。MTLn3細胞(大鼠乳腺腫瘤細胞)用51Cr標(biāo)記。一微孔板用膠原(III型)于4℃包被過夜。500μlDMEMF12培養(yǎng)基、20mmol/LHepes、1mmol/L碳酸氫鹽、1％BSA中的2×104標(biāo)記細胞先與0、2、5或10μl本發(fā)明蛋白(“SuperosePool”，0.5mg蛋白/ml)于37℃分別保溫10分鐘。然后該懸液轉(zhuǎn)移到膠原包被的孔中，37℃保溫2小時。然后洗滌各孔，用1mol/LNaOH去除粘附的細胞。計數(shù)測定粘附細胞的放射活性。表3</tables>實施例6抗體的產(chǎn)生將100μg按實施例純化的抑制劑加入到0.5ml福氏完全佐劑中，將此懸液皮下注射給兔子。2周后進行第二次注射，給予約80μg純化抑制劑和0.5ml福氏不完全佐劑。注射后采集12個血清樣品以檢查特異抗體的產(chǎn)生。在Western印跡試驗中分析樣品。將20ng純化抑制劑上樣于12.5％SPS-聚丙烯酰胺凝膠上，按E.Harlowe，D.Lane(1988)在《抗體實試室手冊》(冷泉港實驗室)中指述的標(biāo)準(zhǔn)方法進行電泳、印跡和檢測(試驗血清稀釋度1∶500，與過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG作為第二抗體，用英國Amersham的Amersham國際公司的ECL試驗盒檢測)。替換以上概括地或具體地描述的反應(yīng)物和/或上述實施例中所用的本發(fā)明操作條件，可以相似成功地重復(fù)上述實施例。根據(jù)以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員易于確定本發(fā)明的實質(zhì)特征，而且在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下可以對本發(fā)明進行各種改變和修飾以適應(yīng)各種用途和條件。序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱ScheringAktiengesellschaft(B)街道Muellerstrasse172-178(C)城市柏林(E)國家德國(F)郵編13353(G)電話(030)-468-2085(H)傳真(030)-468-2085(ii)發(fā)明名稱修飾的膠原誘導(dǎo)血小板凝集抑制劑Pallidipin的制備方法(iii)序列數(shù)5(iv)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，#1.3版(EPO)(v)本申請數(shù)據(jù)申請?zhí)朎P94250224.6(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長度172個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬否(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQIDNO1AspGluGluCysGluLeuMetProProGlyAspAsnPheAspLeuGlu151015LysTyrPheSerIleProHisValTyrValThrHisSerArgAsnGly202530ProLysGluGlnValCysArgGluTyrLysThrThrLysAsnSerAsp354045GlyThrThrThrThrThrLeuValThrSerAspTyrLysThrGlyGly505560LysProTyrHisSerGluLeuLysCysThrAsnThrProLysSerGly65707580GlyLysGlyGlnPheSerValGluCysGluValProAsnGlyAsnGly859095GlyLysLysLysIleHisValGluThrSerValIleAlaThrAspTyr100105110LysAsnTyrAlaLeuLeuGlnSerCysThrLysThrGluSerGlyIle115120125AlaAspAspValLeuLeuLeuGlnThrLysLysGluGlyValAspPro130135140GlyValThrSerValLeuLysSerValAsnTrpSerLeuAspAspTrp145150155160PheSerArgSerLysValAsnCysAspAsnMetLys165170(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)長度171氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬否(xi)序列描述SEQIDNO2AspGluGluCysGluLeuMetProProGlyAspAsnPheAspLeuGlu151015LysTyrPheSerIleProHisValTyrValThrHisSerArgAsnGly202530ProLysGluGlnValCysArgGluTyrLysThrThrLysAsnSerAsp354045GlyThrThrThrThrLeuValThrSerAspTyrLysThrGlyGlyLys505560ProTyrHisSerGluLeuLysCysThrAsnThrProLysSerGlyVal65707580LysGlyGlnPheSerValGluCysGluValProAsnGlyAsnGlyGly859095LysLysLysIleHisValGluThrSerValIleAlaThrAspTyrLys100105110AsnTyrAlaLeuLeuGlnSerCysThrLysThrGluSerGlyIleAla115120125AspAspValLeuLeuLeuGlnThrLysLysGluGlyValAspProGly130135140ValThrSerValLeuLysSerValAsnTrpSerLeuAspAspTrpPhe145150155160SerArgSerLysValAsnCysAspAsnMetLys165170(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)長度172氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬否(xi)序列描述SEQIDNO3AspGluGluCysGluLeuMetProProGlyAspAsnPheAspLeuGlu151015LysTyrPheSerIleProHisValTyrValThrHisSerArgAsnGly202530ProLysGluGlnValCysArgGluTyrLysThrThrLysAsnSerAsp354045GlyThrThrThrThrThrLeuValThrSerAspTyrLysThrGlyGly505560LysProTyrHisSerGluLeuLysCysThrAsnThrGlnLysSerGly65707580GlyLysGlyGlnPheSerValGluCysGluValProAsnGlyAsnGly859095GlyLysLysLysIleHisValGluThrSerValIleAlaThrAspTyr100105110LysAsnTyrAlaLeuLeuGlnSerCysThrLysThrGluSerGlyIle115120125AlaAspAspValLeuLeuLeuGlnThrLysLysGluGlyValAspPro130135140GlyValThrSerValLeuLysSerValAsnTrpSerLeuAspAspTrp145150155160PheSerArgSerLysValAsnCysAspAsnMetLys165170(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)長度31堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝“正義引物”(iii)假擬否(xi)序列描述SEQIDNO4GCGATATCGCGACGAAGAATGCGAACTCATG(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)長度34堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝“反義引物”(iii)假擬否(iv)反義是(xi)序列描述SEQIDNO5GCGATAGGATCCAAGCTTATTACTTCATGTTATC權(quán)利要求1.一種重組Pallidipin蛋白(Asp-Pallidipin)的制備方法，其中該Asp-Pallidipin抑制哺乳動物血小板的膠原誘導(dǎo)凝集，該Asp-Pallidipin包含(i)選自Pallidipin蛋白群的一種蛋白(Pallidipin)，和(ii)天冬氨酸，其中天冬氨酸通過肽鍵與Pallidipin的N-末端連接；從而Asp-Pallidipin具有下列氨基酸序列a)以下序列表中所示序列aa)SEQIDNO1；bb)SEQIDNO2或cc)SEQIDNO3；或b)SEQIDNO1-3中任何序列的等位變體或突變蛋白，該等位變體或突變蛋白基本不影響蛋白的活性，或c)進行了翻譯后修飾的SEQIDNO1-3中任一蛋白或b)中所述其變體或突變蛋白，該修飾基本不影響成熟蛋白的活性；該方法包括以下步驟aa)用適當(dāng)載體轉(zhuǎn)染至少一種細菌，該載體包含有效連接的(i)編碼重組Asp-Pallidipin的第一DNA或cDNA分子，(ii)編碼適當(dāng)?shù)男盘栯男蛄械牡诙﨑NA分子，和(iii)適當(dāng)?shù)膯幼?；且表達后包括信號肽和Asp-Pallidipin的前蛋白被裂解，使天冬氨酸處于成熟Asp-Pallidipin氨基酸序列的+1位，bb)表達包括Asp-Pallidipin和信號肽序列的前蛋白；cc)Asp-Pallidipin從細菌胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至周質(zhì)，在轉(zhuǎn)運過程中前蛋白被至少一種蛋白酶裂解，產(chǎn)生成熟的Asp-Pallidipin，dd)提取周質(zhì)分離Asp-Pallidipin，和ee)純化Asp-Pallidipin。2.一種組重Pallidipin蛋白(Asp-Pallidipin)的制備方法，其中該Asp-Pallidipin抑制哺乳動物血小板的膠原誘導(dǎo)凝集，該Asp-Pallidipin包含(i)選自Pallidipin蛋白群的一種蛋白(Pallidipin)，和(ii)天冬氨酸，其中天冬氨酸通過肽鍵與Pallidipin的N-末端連接；從而Asp-Pallidipin具有下列氨基酸序列a)以下序列表中所示序列aa)SEQIDNO1；bb)SEQIDNO2或cc)SEQIDNO3；或b)SEQIDNO1-3中任何序列的等位變體或突變蛋白，該等位變體或突變蛋白基本不影響蛋白的活性，或c)進行了翻譯后修飾的SEQIDNO1-3中任一蛋白或b)中所述其變體或突變蛋白，該修飾基本不影響成熟蛋白的活性；該方法包括在適當(dāng)條件下培養(yǎng)用適當(dāng)載體轉(zhuǎn)染的細菌，其中所述載體包括有效連接的(i)編碼重組Asp-Pallidipin的第一DNA或cDNA分子，(ii)編碼適當(dāng)信號肽序列的第二DNA分子，和(iii)適當(dāng)?shù)膯幼?；且表達后包括信號肽和Asp-Pallidipin的前蛋白被裂解，使天冬氨酸處于成熟Asp-Pallidipin氨基酸序列的+1位，其中所述條件使(A)包括Asp-Pallidipin和信號肽的前蛋白表達，及(B)Asp-Pallidipin從細菌胞質(zhì)運送到周質(zhì)，在運送過程中前蛋白被至少一種蛋白酶裂解，產(chǎn)生成熟的Asp-Pallidipin，及從周質(zhì)中純化Asp-Pallidipin。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中編碼信號序列的DNA編碼堿性磷酸酶(AP酶)的信號序列。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一的方法，其中細菌是大腸桿菌。5.一種重組蛋白Asp-Pallidipin，它抑制哺乳動物血小板的膠原誘導(dǎo)凝集，該Asp-Pallidipin包含(i)選自Pallidipin蛋白群的一種蛋白(Pallidipin)，和(ii)天冬氨酸，其中天冬氨酸通過肽鍵與Pallidipin的N-末端連接；從而Asp-Pallidipin具有下列氨基酸序列a)以下序列表中所示序列aa)SEQIDNO1；bb)SEQIDNO2或(c)SEQIDNO3；或b)SEQIDNO1-3中任何序列的等位變體或突變蛋白，該等位變體或突變蛋白基本不影響蛋白的活性，或c)進行了翻譯后修飾的SEQIDNO1-3中任一蛋白或b)中所述其變體或突變蛋白，該修飾基本不影響熟蛋白的活性。6.一種重組蛋白Asp-Pallidipin，它抑制哺乳動物血小板的膠原誘導(dǎo)凝集，該Asp-Pallidipin包含(i)選自Pallidipin蛋白群的一種蛋白(Pallidipin)，和(ii)天冬氨酸，其中天冬氨酸通過肽鍵與Pallidipin的N-末端連接；從而Asp-Pallidipin具有下列氨基酸序列a)以下序列表中所示序列aa)SEQIDNO1；bb)SEQIDNO2或cc)SEQIDNO3；或b)SEQIDNO1-3中任何序列的等位變體或突變蛋白，該等位變體或突變蛋白基本不影響蛋白的活性，或c)進行了翻譯后修飾的SEQIDNO1-3中任一蛋白或b)中所述其變體或突變蛋白，該修飾基本不影響成熟蛋白的活性；其中該Asp-Pallidipin是通過包括以下步驟的方法制得的aa)用適當(dāng)載體轉(zhuǎn)染至少一種細菌，該載體包含有效連接的(i)編碼重組Asp-Pallidipin的第一DNA或cDNA分子；(ii)編碼適當(dāng)?shù)男盘栯男蛄械牡诙﨑NA分子，和(iii)適當(dāng)?shù)膯幼樱磺冶磉_后包括信號肽和Asp-Pallidipin的前蛋白質(zhì)被裂解，使天冬氨酸處于成熟Asp-Pallidipin氨基酸序列的+1位，bb)表達包括Asp-Pallidipin和信號序列的前蛋白；cc)Asp-Pallidipin從細菌胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至周質(zhì)，在轉(zhuǎn)運過程中前蛋白被至少一種蛋白酶裂解，產(chǎn)生成熟的Asp-Pallidipin，dd)提取周質(zhì)分離Asp-Pallidipin，和ee)純化Asp-Pallidipin。7.一種重組蛋白Asp-Pallidipin，其中該Asp-Pallidipin抑制哺乳動物血小板的膠原誘導(dǎo)凝集，該Asp-Pallidipin包含(i)選自Pallidipin蛋白群的一種蛋白(Pallidipin)，和(ii)天冬氨酸，其中天冬氨酸通過肽鍵與Pallidipin的N-末端連接；從而Asp-Pallidipin具有下列氨基酸序列a)以下序列表中所示序列aa)SEQIDNO1；bb)SEQIDNO2或cc)SEQIDNO3；或b)SEQIDNO1-3中任何序列的等位變體或突變蛋白，該等位變體或突變蛋白基本不影響蛋白的活性，或c)進行了翻譯后修飾的SEQIDNO1-3中任一蛋白或b)中所述其變體或突變蛋白，該修飾基本不影響成熟蛋白的活性；其中該Asp-Pallidipin由包括以下步驟的方法制得在適當(dāng)條件下培養(yǎng)用適當(dāng)載體轉(zhuǎn)染的細菌，其中所述載體包括有效連接的(i)編碼重組Asp-Pallidipin的第一DNA或cDNA分子，(ii)編碼適當(dāng)信號肽序列的第二DNA分子，和(iii)適當(dāng)?shù)膯幼?；且表達后包括信號肽和Asp-Pallidipin的前蛋白被裂解，使天冬氨酸處于成熟Asp-Pallidipin氨基酸序列的+1位，其中所述條件使(A)包括Asp-Pallidipin和信號肽的前蛋白表達，及(B)Asp-Pallidipin從細菌胞質(zhì)運送到周質(zhì)，在運送過程中前蛋白被至少一種蛋白酶裂解，產(chǎn)生成熟的Asp-Pallidipin，及從周質(zhì)中純化Asp-Pallidipin。8.權(quán)利要求6或7的Asp-Pallidipin，其中編碼信號肽序列的DNA編碼堿性磷酸酶(AP酶)的信號序列。9.權(quán)利要求5-8任一項的Asp-Pallidipin作為藥物。10.含有權(quán)利要求5-8任一項的Asp-Pallidipin及藥用稀釋劑或載體的藥物組合物。11.權(quán)利要求5-8任一項的Asp-Pallidipin在制備治療動脈粥樣硬化或血栓形成疾病或預(yù)防心肌梗塞形成治療后再閉塞的藥物中的用途。12.按照權(quán)利要求1-4任一項制得的Asp-Pallidipin在制備治療動脈粥樣硬化或血栓形成疾病或預(yù)防心肌梗塞形成治療后再閉塞的藥物中的用途。13.權(quán)利要求1-4任一項制得的Asp-Pallidipin在制備治療帶轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的癌的藥物中的用途。14.權(quán)利要求1-4和6-8任一項的純化方法，其中純化包括下列連續(xù)步驟(i)通過陽離子交換色譜純化；(ii)通過陰離子交換純化；和(iii)通過大小排阻純化。15.包含有效連接的以下元件的重組載體(i)編碼重組Asp-Pallidipin的第一DNA或cDNA分子，(ii)編碼適當(dāng)信號肽序列的第二DNA分子，和(iii)適當(dāng)?shù)膯幼?；且表達后包括信號肽和Asp-Pallidipin的前蛋白被裂解，使天冬氨酸處于成熟Asp-Pallidipin氨基酸序列的+1位。16.權(quán)利要求15的重組載體，其中DNA或cDNA分子編碼一種具有選自下組之氨基酸序列的Asp-Pallidipina)以下序列表中所示序列aa)SEQIDNO1；bb)SEQIDNO2或cc)SEQIDNO3；或b)SEQIDNO1-3中任何序列的等位變體或突變蛋白，該等位變體或突變蛋白基本不影響蛋白的活性。17.用權(quán)利要求15或16的載體轉(zhuǎn)化的細菌宿主。18.根據(jù)權(quán)利要求17的細菌，它是一種大腸桿菌。全文摘要本發(fā)明提供一種稱為Asp-Pallidipin的重組蛋白的制備方法。Asp-Pallidipin抑制哺乳動物血小板由膠原誘導(dǎo)的凝集。該Asp-Pallidipin包括(i)選自Pallidipin蛋白群的一種蛋白(Pallidipin)，和(ii)天冬氨酸，其中天冬氨酸通過肽鍵與Pallidipin的N-末端相連。該方法包括aa)用適當(dāng)載體轉(zhuǎn)染至少一種細菌，該載體包含i)編碼重組Asp-Pallidipin的DNA或cDNA，ii)適當(dāng)?shù)男盘栯男蛄?，該信號序列被切除后從Pallidipin的位置看天冬氨酸位于氨基酸序列和+1位，和iii)適當(dāng)?shù)膯幼?；bb)表達包括Asp-Pallidipin和信號序列的前蛋白；cc)Asp-Pallidipin從細菌胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至周質(zhì)，在轉(zhuǎn)運過程中前蛋白被至少一種蛋白酶裂解，產(chǎn)生Asp-Pallidipin，dd)提取周質(zhì)分離Asp-Pallidipin，和ee)純化Asp-Pallidipin。這種蛋白用作抑制由膠原誘導(dǎo)的人血小板凝集或抑制有轉(zhuǎn)移腫性瘤細胞之癌的藥物。文檔編號C12N1/21GK1159828SQ95195002公開日1997年9月17日申請日期1995年9月11日優(yōu)先權(quán)日1994年9月12日發(fā)明者C·諾斯克朱恩格布魯特,A·貝克,B·哈恩德勒申請人:舍林股份公司