專(zhuān)利名稱：核酸序列專(zhuān)一性結(jié)合寡聚體及其在反義方法中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有核酸結(jié)合特性的寡聚體，該寡聚體是完全或部分地以1，5-失水己糖醇核苷類(lèi)似物為單體單元構(gòu)成。本發(fā)明還涉及將這種寡聚體用于反義技術(shù)中的用途，以及制備這種寡聚體的方法。
反義技術(shù)基于這樣的原理DNA或RNA分子編碼有義鏈的功能可以被一個(gè)互補(bǔ)的反義鏈封阻。反義技術(shù)可用于各種用途，如診斷、治療、DNA修飾和分離等。在這些技術(shù)中，除了反義鏈自身的穩(wěn)定性很重要以外，由所述有義鏈和反義鏈所形成的雙鏈體或三鏈體的穩(wěn)定性以及反義鏈與有義鏈的結(jié)合力也很重要。同樣，所述寡聚體、雙鏈體或三鏈體對(duì)降解酶，如核酸酶的敏感性也是一個(gè)與其有效性相關(guān)的因素。
寡核苷酸是單體為核苷酸的寡聚體。核苷酸是核苷的磷酸酯，核苷由一個(gè)嘌呤或嘧啶堿和一個(gè)糖組成。每個(gè)核苷酸的主鏈由交替的糖基和磷酸基組成。
核苷酸的穩(wěn)定性和結(jié)合力舉例來(lái)說(shuō)可受堿基修飾的影響。對(duì)此進(jìn)行的研究(1-5)表明，這種修飾僅能導(dǎo)致出現(xiàn)穩(wěn)定性較差的雙鏈體。改變主鏈或是將新的結(jié)構(gòu)插入主鏈確實(shí)能提高核酸酶穩(wěn)定性，但是，僅能對(duì)其與互補(bǔ)鏈的結(jié)合力產(chǎn)生不利影響。對(duì)糖進(jìn)行修飾只能有限地提高其對(duì)靶分子的親和力(6-8)。
本發(fā)明的目的在于提供新的寡聚體，與已知寡聚體相比，這種寡聚體具有較高的穩(wěn)定性和結(jié)合力。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，完全或部分地由1，5-脫水-2，3-雙脫氧-D-阿糖基-己糖醇核苷類(lèi)似物組成的寡聚體(其中，己糖醇通過(guò)其2-位與嘧啶或嘌呤堿的雜環(huán)連接)，能夠同天然寡核苷酸結(jié)合。至少部分地構(gòu)成寡聚體的單體由式I表示
其中，B是一個(gè)雜環(huán)，它由嘧啶或嘌呤堿衍生而來(lái)。所述單體通過(guò)磷酸二酯鍵相互連接在一起，這種寡聚體的結(jié)構(gòu)如式II所示
其中，B是一個(gè)由嘧啶或嘌呤堿衍生而來(lái)的雜環(huán)，l是0-15的一個(gè)整數(shù)，k和m各自為1～15的一個(gè)整數(shù)，但是，如果k＞1，則m可以為0，而如果m＞1，則k可以為0；而且，其中X表示氧或硫。本發(fā)明包括式II化合物的所有可能的鹽。式I的單體是歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)No.92201803.1的主題。式II的寡聚體是一種新的化合物。它具有與由天然2’-脫氧核苷組成的寡核苷酸類(lèi)似的一些特性，但其單體的糖被增大了，因?yàn)樵诃h(huán)的氧化物和與堿基連接的碳原子之間插入了亞甲基。
根據(jù)本發(fā)明，業(yè)已發(fā)現(xiàn)式II的寡聚體及其鹽表現(xiàn)出結(jié)合式III所示天然寡核苷酸的序列專(zhuān)一性
其中，k是一個(gè)整數(shù)，而B(niǎo)的定義與在式I和II中的相同。因此，發(fā)現(xiàn)一類(lèi)新的hybridons或序列專(zhuān)一性結(jié)合聚合體。
至少部分地由吡喃糖核苷組成的本發(fā)明寡聚體具有較高結(jié)合力的事實(shí)是十分驚人的。在過(guò)去幾年中，由Eschenmoser等組成的科研小組一直致力于研究由單體吡喃糖核苷酸組成的寡核苷酸。Eschenmoser研究了呋喃糖作為核酸的糖結(jié)構(gòu)單元的自然選擇(9)。然而，他并未指出為實(shí)現(xiàn)與天然呋喃糖-DNA的良好結(jié)合需要合適的反義分子。
不過(guò)，本發(fā)明人證實(shí)，類(lèi)吡喃糖寡核苷酸能夠同天然呋喃糖-DNA形成穩(wěn)定的雙鏈體(10，11)。理論上講，吡喃糖寡核苷酸具有優(yōu)于呋喃糖寡聚體的自由能，因?yàn)槠湓陔p鏈體形成中熵變較少。
然而，本發(fā)明人先前所研究的類(lèi)吡喃糖寡核苷酸不能夠或不能充分地結(jié)合天然呋喃糖-DNA互補(bǔ)鏈。所述類(lèi)吡喃糖寡核苷酸分別由2，3-雙脫氧-β-D-紅-吡喃己糖核苷(式V)、2，4-雙脫氧-β-D-紅-吡喃己糖核苷(式VI)和/或3，4-雙脫氧-β-D-紅-吡喃己糖核苷(式VII)組成。
更為驚人的是，發(fā)現(xiàn)包含吡喃糖作為糖結(jié)構(gòu)單元的式II寡聚體具有序列專(zhuān)一性結(jié)合能力。將呋喃糖化合物的呋喃環(huán)放大成吡喃環(huán)，并不會(huì)產(chǎn)生能夠同天然寡核苷酸結(jié)合的寡聚體。因此，不能期望把呋喃戊糖環(huán)放大成1，5-失水己糖醇環(huán)。
因此，本發(fā)明的化合物是核苷類(lèi)似物的寡聚體，其中，1，5-脫水-2，3-雙脫氧-D-己糖醇是按照阿糖基-構(gòu)型通過(guò)2-位同一個(gè)嘧啶或嘌呤堿的雜環(huán)連接。
由上述核苷類(lèi)似物以磷酸二酯或硫代磷酸二酯形式相互連接組成所述寡聚體。該寡聚體可用式II表示，其中，k、l、m、B和X具有以上定義。該寡聚體可以僅由式I的己糖醇核苷類(lèi)似物組成(其中，式II里的l等于0)，或間隔插入天然2’-脫氧核苷，或?qū)⑵溥B接在該分子的末端(其中，式II里的l等于或大于1)。所述己糖醇具有(D)-構(gòu)型，而其取代基的立體化學(xué)符合阿糖基構(gòu)型。
當(dāng)基團(tuán)B是由嘧啶堿衍生而來(lái)時(shí)，它可以是胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。當(dāng)B是由嘌呤堿衍生而來(lái)時(shí)，它可以是腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黃嘌呤或黃嘌呤環(huán)，或是其中之一的脫氮雜衍生物。
可以用不同方法制備本發(fā)明的單體單元即核苷類(lèi)似物，制備方法之一披露于歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)NO.92.201803.1中。所述合成方法在Verheggen等的文章中(12)有類(lèi)似地披露。由單體結(jié)合成寡聚體是按照典型方法進(jìn)行的，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺化學(xué)方法進(jìn)行(參見(jiàn)文獻(xiàn)13)，或是通過(guò)H-磷酸化學(xué)方法進(jìn)行(參見(jiàn)文獻(xiàn)14)。所有方法都是按照常見(jiàn)的標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸合成方法在自動(dòng)化DNA合成儀上進(jìn)行。進(jìn)行這種合成的標(biāo)準(zhǔn)條件參見(jiàn)Molecular Biology(15)。
優(yōu)選方法為亞磷酰胺法，該方法以己糖醇核苷類(lèi)似物的亞磷酰胺作為原始結(jié)構(gòu)單元，沿“6’-方向”組合。所述亞磷酰胺如式VIII所示，其中B★是適于寡核苷酸合成的受保護(hù)堿基(例如，胸腺嘧啶、N4-苯甲?；奏?、N6-苯甲酰基腺嘌呤和N2-異丁酰鳥(niǎo)嘌呤，分別由式IX、X、XI和XII表示)。
式VIII產(chǎn)物可按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備。對(duì)胞嘧啶、腺嘌呤或鳥(niǎo)嘌呤堿基的保護(hù)是通過(guò)對(duì)式I化合物的羥基部分的瞬時(shí)保護(hù)而實(shí)現(xiàn)的(16)。不過(guò)，理想的是，對(duì)堿基的保護(hù)是通過(guò)將4，6-亞芐基保護(hù)的核苷類(lèi)似物1a-d的酰化而實(shí)現(xiàn)，該類(lèi)似物是合成上述式I單體的中間體。
在對(duì)環(huán)外氨基官能度?；?，用80％乙酸除去亞芐基部分，得到3a-d。為了獲得化合物3c，可用DBU除去對(duì)硝基-苯乙基。
可以用一個(gè)二甲氧基三苯甲游基保護(hù)1，5-失水己糖醇類(lèi)似物3a-d的伯羥基官能團(tuán)，以得到4a-d?？赏ㄟ^(guò)2-氰乙基N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺，將其轉(zhuǎn)化成適于摻入寡核苷酸鏈的亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元5a-d。含有1，5-失水己糖醇類(lèi)似物的支持體可以通過(guò)對(duì)化合物4a-d的琥珀酰化來(lái)制備，得到6a-d，可利用碳化二亞胺將其連接到長(zhǎng)鏈烷氨基可控孔度玻璃(CCAA-CPG)或適合的氨基官能化聚苯乙烯(例如，Tentage-RAPPPolymere)的氨基官能團(tuán)上，得到7a-d(支持體的官能化參見(jiàn)文獻(xiàn)17)。
完成組合之后，將所獲得的寡核苷酸從支持體上裂解下來(lái)，并通過(guò)在55℃下用氨處理16小時(shí)脫保護(hù)。所得上述式II寡聚體的純化可以通過(guò)幾種方法實(shí)現(xiàn)(18)。優(yōu)選方法是在pH值為12的堿性條件下進(jìn)行陰離子交換FPLC，以破壞所有可能的二級(jí)結(jié)構(gòu)(10)?？赏ㄟ^(guò)簡(jiǎn)單的凝膠過(guò)濾技術(shù)脫鹽，隨后進(jìn)行冷凍干燥。所有可用的鹽均可用常規(guī)方法制備。
基苯基)乙基)鳥(niǎo)嘌呤-9-基dB*＝N4-苯甲酰胞嘧啶-1-基dB＝胞嘧啶-1-基CPG＝可控孔度玻璃(固體支持體)(i)80％HOAc；(ii)二甲氧基三苯甲游基氯，吡啶；(iii)N，N，-二異丙基乙胺，2-氰-N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺，CH2Cl2；(iv)DMAP，琥珀酸酐，吡啶；(v)預(yù)活化LCAA-CPG，DMAP，Et3N，1-(3-二乙基氨丙基)-3-乙基碳化二亞胺，HCl，吡啶。
如上所述，所述寡聚體具有結(jié)合天然寡核苷酸的序列專(zhuān)一性。它與互補(bǔ)的天然寡脫氧核苷酸的結(jié)合能力大于未修飾過(guò)的序列的結(jié)合能力，它具有較高的生化穩(wěn)定性。這樣，可將其用于反義方法，包括診斷、雜交、核酸提取、位點(diǎn)專(zhuān)一性DNA修飾和治療，所有反義方法目前都是針對(duì)天然寡脫氧核苷酸的。
實(shí)施例在以下實(shí)施例中將對(duì)本發(fā)明的化合物及其化學(xué)合成的原料的制備作進(jìn)一步說(shuō)明，不過(guò)，這些實(shí)施例不是限定本發(fā)明的。采用了以下縮寫(xiě)形式FABMS＝快速原子轟擊質(zhì)譜Thgly＝硫甘油NBA＝硝基芐醇Verheggen等(12)披露了1，5-脫水-2，3-雙脫氧-2-取代-D-阿糖基-己糖醇核甘類(lèi)似物及其4，6-O-亞芐基保護(hù)的衍生物的合成方法。例1堿基保護(hù)的核苷類(lèi)似物1.1.1，5-脫水-2-(N6-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-2，3-雙脫氧-D-阿糖基己糖醇(3b)在0℃下，把0.9ml(7.8mmol)的苯甲酰氯加入由2.3g(6.51mmol) 1，5-脫水-4，6-O-亞芐基-2-(腺嘌呤-9-基)-2，3-雙脫氧-D-阿糖基己糖醇溶解在20ml無(wú)水吡啶中所得到的溶液里。在室溫下攪拌4小時(shí)，然后將混合物在冰浴上冷卻，并加入2ml水。在加入1.5ml濃縮NH3溶液(33％g/v)并在室溫下再攪拌45分鐘之后，蒸發(fā)所得混合物。通過(guò)柱層析(CH2Cl2-MeOH，98∶2)純化殘余物，得到1.92g(4.19mmol，產(chǎn)率64％)的1，5-脫水-4，6-O-亞芐基-2-(N6-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-2，3-雙脫氧-D-阿糖基己糖醇。
在60℃溫度下用100ml 80％乙酸進(jìn)一步處理上述產(chǎn)物5小時(shí)，以除去亞芐基部分。蒸發(fā)、與甲苯一起共蒸發(fā)和通過(guò)柱層析(CH2Cl2-MeOH，95∶5～90∶10)純化，得到1.10g(2.98mmol，產(chǎn)率71％)本實(shí)施例的標(biāo)題化合物。UV(MeOH)λmax282nm(∈＝20200)FABMS(Thgly，NaOAc)m/e392(M+Na)+.240(B+2H)+1H NMR(DMSO-d6δ1.94(m，1H，H-3′ax)，2.32(m，1H.H-3′eq)，3.21(m，1H，H-5′)，3.42-3.76(m，3H，H-4′，H-6′，H-6″)，3.90(dd，2J＝13Hz，1H，H-1′ax)，4.27(dd，2J＝12.2Hz，1H，H-1′eq)，4.67(t，J＝5.7Hz，1H，6′＝OH)，4.88-5.00(m，2H，H-2′，4′-OH)，7.47-7.68(m，3H，芳族H)，8.00-8.07(m，2H芳族H)8.60(s，1H)，8.73(s，1H)(H-2，H-8)ppm.13C NMR(DMSO-d6)δ35.8(C-3′)，50.7(C-2′)，60.5，60.7(C-4′，C-6′)，67.9(C-1′)，83.1(C-5′)，125.1(C-5)，128.5(Co，Cm)，132.5(Cp)，133.6(Cx)，143.5(C-8)，150.3(c-4)，151.4(C-2)，152.4(C-6)ppm.1.2.1，5-脫水-2，3-雙脫氧-2-(N2-異丁酰鳥(niǎo)嘌呤-9-基-D-阿糖基己糖醇(3c))用1，5-脫水-4，6-O-亞芐基3-脫氧-D-葡糖醇(glucitol)(1，18g，5mmol)對(duì)N2-異丁酰-O6-[2-(對(duì)硝基苯)乙基]鳥(niǎo)嘌呤(1.85g，7.5mmol)進(jìn)行烷基化，在無(wú)水吡啶中，用1.5ml(10mmol)DBU、花16小時(shí)時(shí)間除去對(duì)硝基苯乙基，并通過(guò)急驟柱層析(CH2Cl2-MeOH，99∶1～97∶3)純化，得到1.35g粗制1，5-脫水-4，6-O-亞芐基-2，3-雙脫氧-2-(N2-異丁酰-鳥(niǎo)嘌呤-9-基)-D-阿糖基己糖醇。用100ml80％HOAc對(duì)亞芐基部分進(jìn)行水解，經(jīng)柱層析(CH2Cl2-MeOH，90∶10)后得到所需化合物3c(610mg，1.74mmol，總產(chǎn)率34％)。UV(MeOH)λmax273nmFABMS(Thgly，NaOAc)m/e352(M+H)+1H NMRδ1.11(d，J＝6.7Hz，6H，CH3)，1.93(m，1H，H-3′ax)，2.11-2.38(m，1H.H-3′eq)，2.80(q，1H，CHMe-2)，3.25(m，1H，H-5′)，3.42-3.78(m，3H，H-4′，H-6′，H-6″)，3.89(dd，2J＝13Hz，1H，H-1′)，4.21(dd，2J＝13Hz，1H，H-1″)，4.6913C NMRδ19.4(CH3)，34.5(CHMe2)，35.8，(C-3′)，50.5(C-2′)，60.5，60.7(C-4′，C-6′)，67.9(C-1′)，83.1(C-5′)，116.7(C-5)，141.7(C-8)，152.0(C-4)，153.0(C-2)，159.8(C-6)，175.2(C＝O)ppm.例2核苷類(lèi)似物的二甲氧基三苯甲基化2.1.1，5-脫水-6-O-二甲氧基三苯甲游基-2-(胸腺嘧啶-1-基)-2，3-雙脫氧-D-阿糖基己糖醇(4a)將1，5-脫水-2-(胸腺嘧啶-2-基)-2，3-雙脫氧-D-阿糖基-己糖醇(3a)(330mg，1.29mmol)溶于20ml無(wú)水吡啶中，并加入480mg(1.42mmol)二甲氧基三苯甲游基氯。在室溫下將混合物攪拌過(guò)夜，用100ml CH2Cl2稀釋?zhuān)⒂?00ml飽和NaHCO3溶液洗滌2遍。干燥有機(jī)層，蒸發(fā)，并與甲苯-起共蒸發(fā)。通過(guò)柱層析(采用含有1％三乙胺的由CHCl3配制的0～3％MeOH梯度液)純化得到的殘余物，得到373mg(0.67mmol，52％)泡沫狀標(biāo)題化合物。FABMS(Thgly，NaOAc)m/e581(M+Na)+.127(B+2H)+1H NMR(CDCl3)δ1.60-2.50(m，2H，H-3′，H-3″)，1.91(s，3H，CH3)，3.12-3.62(m，2H，H-5′，H-4′)，3.77(s，6H，2xOCH3)，3.65-4.17(m，4H，H-6′，H-6″，H-1′，H-1″)，4.53(s，1H，H-2′)，4.88(d，1H，J＝5.1，Hz 4′-OH)，6.81(d，J＝8.7，4H，芳族H)，7.09-7.53(m，9H，芳族H)，8.09(s，1H，H-6)，9.10(brs，1H，NH)ppm13C NMR(CDCl3)δ12.5(CH3)，35.5(C-3′)，50.7(C-2′)，54.9(OCH3)，62.4，63.1(C-4′，C-6′)，68.2(C-1′)，81.1(C-5′)，86.0(Ph3C)110.0(C-5)，138.4(C-6)，151.0(C-2)，163.8(C-4)，112.9，126.6，127.5，127.8，129.7，135.6，144.6，158.3(芳族C)ppm.2.2.1，5-脫水-6-O-二甲氧基三苯甲游基-2-(N6-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-2，3-雙脫氧-D-阿糖基己糖醇(4b)將370mg(1mmol)核苷3b和400mg(1.2mmol)二甲氧基三苯甲游基氯溶于25ml無(wú)水吡啶中，在室溫下攪拌16小時(shí)。用100mlCH2Cl2稀釋所得混合物，并用100ml飽和NaHCO3溶液洗滌2遍。將有機(jī)層干燥、蒸發(fā)、并與甲苯一起共蒸發(fā)。通過(guò)柱層析(用CH2Cl2配制的0～3％MeOH，含有0.2％吡啶)得到400mg(0.6mmol，產(chǎn)率63％)泡沫狀化合物4b。FABMS(Thgly，NaOAc)m/c694(m+Na)+，240(B+2H)+。2.3.1，5-脫水-6-O-二甲氧基三苯甲游基-2-(N2-異丁酰鳥(niǎo)嘌呤-9-基)-2，3-雙脫氧-D-阿糖基己糖醇(4c)將580mg(1.65mmol)核苷3c和670mg(2.0mmol)二甲氧基三苯甲游基氯溶于25ml無(wú)水吡啶中，在室溫下攪拌16小時(shí)。用100mlCH2Cl2稀釋所得混合物，并用100ml飽和NaHCO3溶液洗滌2遍。將有機(jī)層干燥、蒸發(fā)、并與甲苯一起共蒸發(fā)。通過(guò)柱層析(使用含有0.2％吡啶的由CH2Cl2配制的0～3％MeOH梯度液)純化殘余物，得到770mg(1.18mmol，產(chǎn)率71％)泡沫狀化合物4c。FABMS(NBA)m/e654(m+H)+。2.4.酰亞胺(amidite)結(jié)構(gòu)單元(5a-c)的制備把6，-O-保護(hù)核苷(0.5mmol)、3當(dāng)量無(wú)水N，N-二異丙基-乙胺和1.5當(dāng)量2-氰乙基-N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺溶于2.5ml無(wú)水CH2Cl2中得到的混合物在室溫下攪拌3小時(shí)。加入0.5ml EtOH并再攪拌25分鐘后，用5％NaHCO3溶液(15ml)和飽和NaCl溶液洗滌該混合物，干燥并蒸發(fā)。用Et3N進(jìn)行急驟柱層析得到白色泡沫狀酰亞胺，將其溶于少量無(wú)水CH2Cl2中，并滴加至100ml冷凍(-50℃)正己烷中。分離沉淀物，用正己烷洗滌，干燥，并將其用于DNA合成。
下表中列出了不同酰亞胺的洗脫溶劑和沉淀以后的產(chǎn)率
例36-O-保護(hù)的核苷類(lèi)似物的琥珀酰化3.1.1，5-脫水-6-O-二甲氧基三苯甲游基-4-O-琥珀酰基-2-(胸腺嘧啶-1-基)-2，3-雙脫氧-D-阿糖基己糖醇(6a)將由80mg(0.14mmol)4a、9mg(0.07mmol)DMAP和43mg(0.14mmol)琥珀酐溶于5ml無(wú)水吡啶中所組成的混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。在反應(yīng)尚未結(jié)束之前，再加入43mg(0.43mmol)，并把混合物再攪拌24小時(shí)。蒸發(fā)該溶液，并與甲苯一起共蒸發(fā)。將殘余物溶于CH2Cl2中，用飽和NaCl溶液和水洗滌有機(jī)層，干燥并蒸發(fā)，得到78mg(0.12mmol，產(chǎn)率86％)白色泡沫狀6a。3.2.1，5-脫水-6-O-二甲氧基三苯甲游基-4-O-琥珀?；?2-(N6-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-2，3-雙脫氧-D
-阿糖基己糖醇(6b)將上述合成6a的同一方法用于6b的合成。以260mg(0.39mmol)4b為原料，獲得256mg(0.33mmol，產(chǎn)率85％)泡沫狀標(biāo)題化合物。例4寡核苷酸的生產(chǎn)4.1.固體支持體的制備將由80μmol琥珀酸酯(6a，b)、400mg預(yù)活化LCAA-CPG(17)、5mg(40mmol)DAMP、35μl Et3N和153mg(800μmol) 1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳化二亞胺·HCl溶于4ml無(wú)水吡啶中所組成的混合物超聲處理5分鐘，然后在室溫下振蕩16小時(shí)。振蕩之后，將CPG固體支持體濾出，并連續(xù)用吡啶、甲醇和CH2Cl2洗滌，隨后在真空下干燥。用溶于THF中的1.5ml 1-甲基咪唑(Applied Biosystems)和1.5ml乙酐-盧剔啶-THF 1∶1∶8(Applied Biosystems)封閉支持體表面的未反應(yīng)部位。在室溫下振蕩4小時(shí)，然后濾出固體支持體，用CH2Cl2洗滌，并在真空下干燥。二甲氧基三苯甲游基比色分析表明，7a的載荷為18.5μmol/g，7b的載荷為21.5μmol/g。4.2.DNA合成在一臺(tái)ABI 381A DNA合成儀(Applied Biosystems)上用亞磷酰胺法(去掉末端二甲氧基三苯甲游基)進(jìn)行寡核苷酸合成。通過(guò)濃縮氨處理(55℃，16小時(shí))對(duì)所得到的序列進(jìn)行脫保護(hù)，并將其從固體支持體上裂解下來(lái)。在NAP-10柱(SephadexG25-DNA級(jí)，Pharmacia)上純化，用緩沖液A(見(jiàn)下文)洗脫，然后再在mono-QHR10/10陰離子交換柱(Pharmacia)上純化，使用以下梯度系統(tǒng)(A＝10mMNaOH，pH12.0，0.1MNaCl；B＝10mM NaOH，pH12.0，0.9M NaCl；梯度的使用取決于寡聚體；流速為2ml/分)。低壓液體層析系統(tǒng)由一臺(tái)Merck-Hitachi L6200 A Intelligent Pump、一個(gè)Mono QHR10/10柱(Pharmacia)、一個(gè)Uvicord SJI2138UV檢測(cè)儀(Pharmacia-LKB)和一臺(tái)記錄儀組成。在NAP-10柱上對(duì)含有產(chǎn)品的級(jí)分進(jìn)行脫鹽，并進(jìn)行冷凍干燥。例5解鏈溫度將寡聚體溶于以下緩沖液中0.1M NaCl，0.02M磷酸鉀pH＝7.5，0.1mM EDTA。通過(guò)在80℃測(cè)260nm的光吸收確定其濃度，假設(shè)在變性狀態(tài)下1，5-失水己糖醇核苷類(lèi)似物具有與天然核苷相同的消光系數(shù)。腺嘌呤單體 ∈＝15000胸腺嘧啶單體∈＝8500鳥(niǎo)嘌呤單體 ∈＝12500胞嘧啶單體 ∈＝7500在所有實(shí)驗(yàn)中，每條鏈的濃度都大約為4μM。用一臺(tái)Uvikon 940分光光度計(jì)測(cè)定解鏈曲線。通過(guò)讓水在樣品槽支座中循環(huán)穩(wěn)定樣品槽的溫度，并由被直接浸入樣品槽里的熱敏電阻測(cè)定溶液的溫度。用一臺(tái)IBM/PC AT兼容機(jī)進(jìn)行自動(dòng)化溫度控制和數(shù)據(jù)采集。以0.2℃/分的速度加熱和冷卻樣品，看不出加熱解鏈曲線和冷卻解鏈曲線之間的差別，取光吸收對(duì)溫度曲線的一次導(dǎo)數(shù)評(píng)價(jià)解鏈曲線。在表1～4中給出了所合成的寡核苷酸的例子及其解鏈溫度。表1由單失水己糖醇核苷(A★，T★)摻入A13/T13雙鏈體所組成的寡核苷酸的解鏈溫度(在0.1M的NaCl濃度下測(cè)得)。
(1)在284nm處測(cè)定單鏈寡A★和寡T★均呈有序結(jié)構(gòu)，但是與在高鹽濃度下的結(jié)果相反(結(jié)果未示出)，poly T★未表現(xiàn)出類(lèi)似的形成同源雙鏈體的傾向。以下結(jié)果或多或少證明了這-點(diǎn)對(duì)寡A★和寡T★來(lái)說(shuō)，UV吸收值隨溫度升高線性上升。寡T★與寡脫氧腺苷酸的等摩爾混合物的解鏈溫度為45℃，在284nm處測(cè)得的減色性為49％。業(yè)已知道，改變鹽濃度，會(huì)使DNA發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，這里的情況的確如此。在低鹽濃度下，寡T★寡脫氧腺苷酸結(jié)合較理想，而在高鹽濃度下，形成寡T★同源雙鏈體較為理想。然而，該復(fù)合體在260nm處的熱行為表明，寡T★寡脫氧-腺苷酸結(jié)合不是典型的螺旋-卷曲轉(zhuǎn)變。在260nm處減色性首先降低，在46℃時(shí)最低(解鏈溫度在484nm處測(cè)得)，隨后增加。以類(lèi)似方法測(cè)定了含有腺嘌呤(A★)和鳥(niǎo)嘌呤(G★)核苷類(lèi)似物的完全修飾的混合序列(兩個(gè)六聚體和一個(gè)十二聚體)。表3完全修飾的六聚體的解鏈溫度
測(cè)定條件1M NaCl，20mM KH2PO4pH 7.5，EDTA 0.1mM與互補(bǔ)序列形成雙鏈體5’-TCTCCT(20)用于16和17，5’-TCTCTC(21)用于18和19。
盡管對(duì)上述某些序列來(lái)說(shuō)，解鏈溫度是測(cè)的六聚體，但這些寡核苷酸的熱變性是在1M NaCl(含有20mM K2HPO4pH7.5和0.1mM EDTA)中研究的。最重要的現(xiàn)象是，類(lèi)吡喃糖寡核苷酸與其天然對(duì)應(yīng)體(counterpart)之間明顯組成了雙鏈體。而且，這種修飾過(guò)的雙鏈體比絕對(duì)由沃森-克里克堿基對(duì)組成的雙鏈體更穩(wěn)定。
不過(guò)，形成鮮明對(duì)照的是，序列16(Tm＝31.2℃)和17(Tm＝14.7℃)與其反平行互補(bǔ)寡核苷酸的解鏈溫度之間有較大差別。而修飾過(guò)的含3G★和3A★的寡聚體僅在其序列順序方面有差別，序列16的解鏈溫度為序列18的兩倍。這種序列依賴效應(yīng)在對(duì)照寡核苷酸17和19上僅得到有限的體現(xiàn)。
表4完全修飾的含A★和G★的十二聚體的解鏈溫度
在0.1M NaCl條件下測(cè)定
(24)5′-TCT CCT CTC CCT觀察所述十二聚體可以看出，與其受控序列23相比，完全修飾的寡核苷酸具有較高的穩(wěn)定性，這兩種序列與其互補(bǔ)的反平行互補(bǔ)序列24相比，解鏈溫度提高了16℃。
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權(quán)利要求
1.寡聚體，完全或部分由通式I所示的1，5-失水己糖醇核苷類(lèi)似物組成
其中，B是由嘧啶或嘌呤堿衍生而來(lái)的雜環(huán)。
2.如權(quán)利要求1的寡聚體，其特征在于其如通式II所示
其中，B是由嘧啶或嘌呤堿衍生而來(lái)的雜環(huán)，而k、l和m各自為一個(gè)0～15的整數(shù)，假設(shè)k和m至少為1；但是，如果k＞1，則m可以為0；如果m＞1，則k可以為0；以及X表示氧或硫，及其鹽。
3.如權(quán)利要求1或2的寡聚體，基特征在于所述雜環(huán)選自胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘌呤，或其脫氮雜衍生物。
4.如權(quán)利要求1或2的寡聚體，其特征在于所述雜環(huán)選自腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤，或其脫氮雜衍生物。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的寡聚體，其中所述式I化合物為(D)-構(gòu)型，而所述取代基位于阿糖基結(jié)構(gòu)中。
6.將權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的寡聚體用于反義技術(shù)中的用途。
7.如權(quán)利要求6的寡聚體用途，其特征在于，所述反義技術(shù)包括診斷、雜交、核酸提取、定點(diǎn)DNA修飾和治療。
8.制備式II寡聚體的方法，包括將合適數(shù)量的式I單體連接在一起。
9.如通式VIII所示的亞磷酰胺用于制備權(quán)利要求1的寡聚體的用途，
其中，B★是受保護(hù)堿基。
全文摘要
本發(fā)明涉及寡聚體，它完全或部分地由通式(I)所示的1，5-失水己糖醇核苷類(lèi)似物組成，式(I)中的B是一個(gè)雜環(huán)，它由嘧啶或嘌呤衍生而來(lái)，如胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶、或這些嘧啶的脫氮雜衍生物，或腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤、或這些嘌呤的脫氮雜衍生物。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1158618SQ95195211
公開(kāi)日1997年9月3日 申請(qǐng)日期1995年8月14日 優(yōu)先權(quán)日1994年8月17日
發(fā)明者P·A·M·赫德維恩, A·A·E·范阿爾斯喬特 申請(qǐng)人:雷加Vzw基金會(huì)