本發(fā)明涉及一種以鱘魚肉及軟骨為原料深加工產(chǎn)品，尤其是一種鱘魚復(fù)合粉、鱘魚骨酒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鱘魚（Sturgeon）具有豐富的營養(yǎng)成分，是一種對人體極為有益的水產(chǎn)品。據(jù)《本草拾遺》記載：“鱘魚，肉味甘，平，無毒。主治補虛益氣，令人肥健。煮汁飲，治血淋。鼻肉主治補虛下氣。子主治食之肥美，殺腹內(nèi)小蟲”。《中國藥用動物原色圖鑒》寫道：肉滋補強壯，益氣補虛，補血。用治脾虛泄瀉、營養(yǎng)不良、氣虛筋骨無力、病后體弱、貧血、營養(yǎng)不良、血淋刺痛、前列腺炎、淋巴結(jié)腫大。目前有報道鱘魚肉可以通過酶解手段制成益于人體吸收的鱘魚肽，同時鱘魚肽也具有一些特殊的生物活性，如抑制血管緊張素轉(zhuǎn)移酶（ACE）活性。硫酸軟骨素是存在于動物軟骨組織中的一類酸性黏多糖，具有抗炎，抗血栓，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)等作用，鱘魚軟骨富含硫酸軟骨素。迄今為止，還沒有關(guān)于以鱘魚肉和鱘魚軟骨為原料，經(jīng)復(fù)合酶酶解成易被人體吸收且具有清除自由基作用的鱘魚復(fù)合粉以及以鱘魚復(fù)合粉制備成對肝臟無損害且具有保護(hù)肝臟作用的鱘魚骨酒的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種鱘魚復(fù)合粉、鱘魚骨酒及應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種鱘魚復(fù)合粉，其特征是按如下步驟制備：

a. 將宰殺后的鱘魚洗凈，取鱘魚肉及鱘魚軟骨冷凍干燥至水分小于1%，將凍干的鱘魚肉及鱘魚軟骨粉碎成500~5000目的鱘魚超微粉；

b. 將鱘魚超微粉球磨成50~200 nm的鱘魚納米粉；

c. 向鱘魚納米粉中加入pH 7~8的0.01~0.1M磷酸緩沖液及復(fù)合酶，酶解12~48 h；所述鱘魚納米粉與磷酸緩沖液的質(zhì)量比為1：1~10，所述復(fù)合酶添加量為10~25活力單位：1克鱘魚納米粉，所述復(fù)合酶為將枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶按活力單位比為3：3：4比例混合；

d. 離心取上清，采用截留分子量為10000 Da以下的超濾膜分離器分離，收集透過超濾膜的液體，將所收集的液體通過HPD系列大孔吸附樹脂及活性炭后噴霧干燥，制得鱘魚復(fù)合粉。

上述鱘魚復(fù)合粉的相對分子量分布為4367.71、4346.85、4470.98；將所述的鱘魚復(fù)合粉經(jīng)水溶解并經(jīng)質(zhì)量濃度80%乙醇沉淀后凍干，所得部分經(jīng)紅外光譜檢測，具有3297.65、3079.74、2938.96、1625.68、1540.83、1454.05、1396.20、1243.85、1072.22及927.585cm^-1特征；所述鱘魚復(fù)合粉中硫酸軟骨素為總質(zhì)量的21.15%，每100g中含氨基酸如下：天冬氨酸與天冬酰胺8.13g、蘇氨酸3.49g、絲氨酸3.99g、谷氨酸與谷氨酰胺12.7g、甘氨酸10.8g、丙氨酸6.25g、纈氨酸3.56g、甲硫氨酸2.21g、異亮氨酸3.21g、亮氨酸5.57g、酪氨酸2.15g、苯丙氨酸3.69g、賴氨酸7.03g、組氨酸2.01g、精氨酸6.20g及脯氨酸5.82g。

一種用上述鱘魚復(fù)合粉制備的鱘魚骨酒，其特征是將所述鱘魚復(fù)合粉按質(zhì)量百分比0.1~10%加入到基酒中調(diào)兌，過濾至澄清止，所述基酒為白酒、葡萄酒、黃酒或啤酒。

所述的鱘魚復(fù)合粉在制備清除自由基產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明是以鱘魚肉及軟骨為原料，通過復(fù)合酶進(jìn)行酶解、超濾膜分離器分離、大孔吸附樹脂（HPD系列）及活性炭后噴霧干燥后得到鱘魚復(fù)合粉，該鱘魚復(fù)合粉即能夠有效清除自由基、提高機體免疫力，在食品、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域中有廣闊的應(yīng)用前景。將鱘魚復(fù)合粉與基酒勾兌成鱘魚骨酒，不但具有鱘魚特有的鮮味，且含有鱘魚蛋白質(zhì)與硫酸軟骨素，營養(yǎng)更加豐富，不損害肝臟且具有保護(hù)肝臟的作用，可長期服用，有助于對人體關(guān)節(jié)補充硫酸軟骨素。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例鱘魚復(fù)合粉的一級質(zhì)譜圖。

圖2是本發(fā)明實施例鱘魚復(fù)合粉的紅外光譜圖。

圖3是本發(fā)明實施例鱘魚復(fù)合粉清除羥基自由基的能力示意圖。

圖4是本發(fā)明實施例鱘魚復(fù)合粉清除DPPH自由基的能力示意圖。

圖5是本發(fā)明實施例大鯢活性肽清除ABTS自由基的能力示意圖。

圖6是本發(fā)明實施例小鼠肝損傷實驗的肝組織切片圖。

具體實施方式

實施例1：

一種鱘魚復(fù)合粉，按如下步驟制備：

a. 將宰殺后的鱘魚洗凈，取鱘魚肉及鱘魚軟骨冷凍干燥至水分小于1%，將凍干的鱘魚肉及鱘魚軟骨粉碎成2500目的鱘魚超微粉；

b. 將鱘魚超微粉球磨成100 nm的鱘魚納米粉；

c. 向鱘魚納米粉中加入pH 7~8的0.05M磷酸緩沖液及復(fù)合酶，酶解30 h；所述鱘魚納米粉與磷酸緩沖液的質(zhì)量比為1：5，所述復(fù)合酶添加量為15活力單位：1克鱘魚納米粉，所述復(fù)合酶為將枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶按活力單位比為3：3：4比例混合；

d. 離心取上清，采用截留分子量為10000 Da以下的超濾膜分離器分離，收集透過超濾膜的液體，將所收集的液體通過HPD系列大孔吸附樹脂及活性炭后噴霧干燥，制得鱘魚復(fù)合粉。

所得到的鱘魚復(fù)合粉的一級質(zhì)譜圖如圖1所示：相對分子量分布為4367.71、4346.85、4470.98。

將所得到的鱘魚復(fù)合粉經(jīng)水溶解并經(jīng)質(zhì)量濃度80%乙醇沉淀后凍干，所得部分經(jīng)紅外光譜檢測，紅外光譜圖如圖2所示，結(jié)果表明具有3297.65、3079.74、2938.96、1625.68、1540.83、1454.05、1396.20、1243.85、1072.22及927.585cm^-1特征。

將所得到的鱘魚復(fù)合粉經(jīng)高效液相色譜儀檢測：硫酸軟骨素為總質(zhì)量的21.15%，每100g鱘魚復(fù)合粉中含氨基酸如下：天冬氨酸與天冬酰胺8.13g、蘇氨酸3.49g、絲氨酸3.99g、谷氨酸與谷氨酰胺12.7g、甘氨酸10.8g、丙氨酸6.25g、纈氨酸3.56g、甲硫氨酸2.21g、異亮氨酸3.21g、亮氨酸5.57g、酪氨酸2.15g、苯丙氨酸3.69g、賴氨酸7.03g、組氨酸2.01g、精氨酸6.20g及脯氨酸5.82g。

實施例2：

a. 將宰殺后的鱘魚洗凈，取鱘魚肉及鱘魚軟骨冷凍干燥至水分小于1%，將凍干的鱘魚肉及鱘魚軟骨粉碎成1000目的鱘魚超微粉；

b. 將鱘魚超微粉球磨成70nm的鱘魚納米粉；

c. 向鱘魚納米粉中加入pH 7~8的 0.1M磷酸緩沖液及復(fù)合酶，酶解12h；所述鱘魚納米粉與磷酸緩沖液的質(zhì)量比為1：1，所述復(fù)合酶添加量為25活力單位：1克鱘魚納米粉，所述復(fù)合酶為將枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶按活力單位比為3：3：4比例混合；

d. 離心取上清，采用截留分子量為10000 Da以下的超濾膜分離器分離，收集透過超濾膜的液體，將所收集的液體通過HPD系列大孔吸附樹脂及活性炭后噴霧干燥，制得鱘魚復(fù)合粉。

實施例3：

a. 將宰殺后的鱘魚洗凈，取鱘魚肉及鱘魚軟骨冷凍干燥至水分小于1%，將凍干的鱘魚肉及鱘魚軟骨粉碎成4000目的鱘魚超微粉；

b. 將鱘魚超微粉球磨成200 nm的鱘魚納米粉；

c. 向鱘魚納米粉中加入pH 7~8的0.02M磷酸緩沖液及復(fù)合酶，酶解48 h；所述鱘魚納米粉與磷酸緩沖液的質(zhì)量比為1：10，所述復(fù)合酶添加量為10活力單位：1克鱘魚納米粉，所述復(fù)合酶為將枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶按活力單位比為3：3：4比例混合；

d. 離心取上清，采用截留分子量為10000 Da以下的超濾膜分離器分離，收集透過超濾膜的液體，將所收集的液體通過HPD系列大孔吸附樹脂及活性炭后噴霧干燥，制得鱘魚復(fù)合粉。

實施例4：

將實施例1所得到的鱘魚復(fù)合粉按質(zhì)量百分比0.1%加入到基酒中調(diào)兌，過濾至澄清止，所述基酒為市售白酒，酒精度60%體積比。

實驗：

一．本發(fā)明實施例鱘魚復(fù)合粉清除自由基能力

1．本發(fā)明實施例鱘魚復(fù)合粉清除羥基自由基能力

將本發(fā)明實施例1所得鱘魚復(fù)合粉用去離子水配成不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml）的溶液，分別取2ml不同濃度樣品溶液于試管中，分別加入9 mmol/L的FeSO₄ 1 mL，9 mmol/L的水楊酸-乙醇1 mL，加入8.8 mmol/L的雙氧水1 mL啟動反應(yīng)，37℃下反應(yīng)30 min，以蒸餾水為參比，在510 nm下測吸光度?？紤]到樣品本身的吸光值，取9 mmol/L的FeSO₄ 1 mL，9 mmol/L的水楊酸-乙醇1 mL以及不同濃度的多糖溶液2 mL作為本底吸收。

?OH清除率（%）=Ao-(Ax-Axo)/Ao×100%

式中：Ao空白對照吸光度；Ax 加入多糖溶液吸光度：Axo不加H2O2的多糖溶液吸光度

結(jié)果如圖3所示：鱘魚復(fù)合粉清除羥基自由基的能力隨著鱘魚復(fù)合粉濃度的增加而增加。

2. 本發(fā)明實施例鱘魚復(fù)合粉清除DPPH 自由基能力

將本發(fā)明實施例1所得鱘魚復(fù)合粉用去離子水配成不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml）的溶液，分別取2ml不同濃度樣品溶液于試管中，加入2ml所配置的DPPH溶液（0.004g DPPH粉末加到50mL容量瓶，用95%乙醇定容，4℃下避光保存），混合均勻，室溫避光30min。在10000rpm離心10min，取上清于517nm下測定吸光度Aj，同時測2ml不同樣品溶液加2ml的95%乙醇的吸光度Ai，2mlDPPH加2mL蒸餾水的吸光度A0。

DPPH自由基清除率（%）=[A0-(Aj-Ai)]/A0×100%

式中：A0空白對照的吸光值；Aj樣液的吸光值；Ai 本身的吸光值

結(jié)果如圖4所示：鱘魚復(fù)合粉清除DPPH自由基的能力隨著鱘魚復(fù)合粉濃度的增加而增加。

3．本發(fā)明實施例鱘魚復(fù)合粉清除ABTS的能力

將本發(fā)明實施例1所得鱘魚復(fù)合粉用去離子水配成不同濃度（20、60、100、140、180μg/ml ）的溶液，用蒸餾水配置 ABTS使?jié)舛葹?.4mmol/L，然后與2.6 mmol/L的K2S2O8均勻混合，黑暗室溫放置12 h。用95%乙醇溶液稀釋，使其能在波長為734 nm處的吸光度值為0.70±0.02A，即得到ABTS自由基儲備液。在試管中加入0.9ml不同濃度（20、60、100、140、180μg/ml）的本發(fā)明鱘魚復(fù)合粉溶液和2ml的ABTS自由基儲備液，在室溫條件下放置6min，隨后在轉(zhuǎn)速 10000rpm下離心10min，取上清液在波長734nm處進(jìn)行測定。

ABTS自由基清除率（%）=[A₀-(Ai-Aj)]/A0×100%

式中：A₀空白對照的吸光值； A_i 樣液的吸光值；Aj本身的吸光值

結(jié)果如圖5所示：鱘魚復(fù)合粉清除ABTS自由基的能力隨著鱘魚復(fù)合粉濃度的增加而增加。

從實驗1、2、3可以看出，本發(fā)明的鱘魚復(fù)合粉具有清除自由基的作用，可在制備清除自由基產(chǎn)品中的應(yīng)用。

二、本發(fā)明鱘魚復(fù)合粉制備的鱘魚骨酒保護(hù)二乙基亞硝胺（DEN）導(dǎo)致的小鼠肝損傷的作用

清潔級昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，于12 h黑暗，12 h光亮的塑料飼養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，室溫20±2℃，濕度40% ~ 60%，自由采食和飲水。48只小鼠隨機分為6組：對照組、鱘魚骨酒（本發(fā)明實施例4）組、乙醇組、鱘魚骨酒+DEN組、乙醇+DEN組以DEN組。將本發(fā)明鱘魚骨酒、乙醇組每天定時等體積灌胃1次，以5ml/（kg?bw）分別灌胃鱘魚骨酒、乙醇，連續(xù)灌胃30d；

而鱘魚骨酒+DEN組、乙醇+DEN組，除按上述方法分別灌胃鱘魚骨酒、乙醇外，還需同時灌胃DEN50mg/kg；DEN組單獨灌胃DEN50mg/kg。最后一次灌服藥品后1 h，摘眼球取血。將采集的全血于37℃恒溫30 min，然后于4℃冰箱中1h，在3000rpm下離心3 min，分離血清，檢測ALT、AST以及MDA指標(biāo)，結(jié)果如表1。表1表明鱘魚骨酒組的ALT、AST以及MDA指標(biāo)與對照組的指標(biāo)沒有顯著差異。鱘魚骨酒+DEN組的ALT、AST以及MDA指標(biāo)顯著好于乙醇+DEN組以及DEN組，這表明鱘魚骨酒對肝臟無損害，可降低DEN對肝臟的損傷，具有保護(hù)肝臟的作用。

表1

對各實驗組進(jìn)行肝組織切片檢查（圖6））。圖6中A、B、C、D、E、F分別為對照組、鱘魚骨酒組、乙醇組、鱘魚骨酒+DEN組、乙醇+DEN組以DEN組。從圖6中可以看出來，對照組與鱘魚骨酒組小鼠肝細(xì)胞索狀排列規(guī)則，肝細(xì)胞胞漿均勻，核仁清晰（圖6A、B）。乙醇組、乙醇+DEN組以及DEN組肝細(xì)胞紊亂，有氣球樣變細(xì)胞，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象（圖6C、E、F）。鱘骨酒+DEN組（圖6D）的肝細(xì)胞細(xì)胞形狀基本規(guī)則，有少量炎癥細(xì)胞浸潤。此結(jié)果表明，鱘魚骨酒對肝臟無損害，可降低DEN對肝臟的損傷，具有保護(hù)肝臟的作用。