一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及其應(yīng)用。本發(fā)明利用基因同源重組、基因插入失活的方法敲除產(chǎn)1,3-丙二醇的野生型菌株中的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因，從而得到甲酸代謝途徑被阻斷的基因工程菌。用本發(fā)明的工程菌進(jìn)行1,3-丙二醇的發(fā)酵生產(chǎn)，副產(chǎn)物甲酸合成大幅度降低，使得甲酸對(duì)細(xì)胞的毒害作用降低，1,3-丙二醇濃度、生產(chǎn)強(qiáng)度與底物轉(zhuǎn)化率提高。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明的工程菌按常規(guī)方法發(fā)酵32小時(shí)，甲酸合成量降低90％以上，1,3-丙二醇濃度可達(dá)72g/L以上。本發(fā)明將促進(jìn)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-丙二醇技術(shù)進(jìn)步，具有應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及 其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】：
[0002] 1，3-丙二醇（PDO)是一種重要的化工原料，有多種重要用途。它可用來(lái)合成雜環(huán)、 藥物中間體、聚酯、潤(rùn)滑劑、染料、油墨、防凍劑等，其主要用途是合成聚酯-聚對(duì)苯二甲酸 丙二醇脂（PTT)。PTT是繼50年代聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET)、70年代聚對(duì)苯二甲酸丁 二醇酯（PBT)之后實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)模的新的可成纖聚酯高分子材料，是一種極有發(fā)展前途的新 型聚酯材料。1998年P(guān)TT被美國(guó)評(píng)為六大石化新產(chǎn)品之一。PTT與PET、PBT相比除具有聚 酯的耐化學(xué)性外，還具有其它一些更優(yōu)良的特性。如尼龍的彈性恢復(fù)性；在全范圍無(wú)需添加 特殊化學(xué)藥品即能呈現(xiàn)良好的連續(xù)印染特性；抗紫外、臭氧和氮氧化合物的著色性；抗內(nèi) 應(yīng)力；低水吸附、低靜電以及良好的可生物降解性；可循環(huán)利用性等。由于PTT的具有以上 優(yōu)良特性，它在地毯工業(yè)、服裝材料、工程熱塑料以及其它眾多領(lǐng)域有著很廣泛的應(yīng)用。
[0003] Dupont和Shell兩家跨國(guó)公司曾采用化學(xué)合成路線，以環(huán)氧乙烷或丙烯為原料生 產(chǎn)roo?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)roo的缺點(diǎn)是副產(chǎn)物多，選擇性和產(chǎn)率較低，操作條件需要高溫高 壓，設(shè)備投資巨大，原料不可再生；同時(shí)由于產(chǎn)量有限，長(zhǎng)期以來(lái)roo售價(jià)偏高。目前ι，3-丙 二醇的生產(chǎn)方法主要是微生物發(fā)酵法。與化學(xué)合成法相比，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-丙二醇 具有顯著的優(yōu)點(diǎn)：1、利用成本較低的可再生資源（如甘油、玉米、淀粉）為原料；2、生產(chǎn)條 件溫和，操作簡(jiǎn)便，不需貴重金屬催化劑；3、選擇性好，副產(chǎn)物較少，易于分離純化；4、環(huán)境 污染小。微生物發(fā)酵法是以生物技術(shù)為特征的"綠色工業(yè)"向傳統(tǒng)石油化工提出的強(qiáng)有力 的挑戰(zhàn)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，因而越來(lái)越受到重視。
[0004] 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-丙二醇是利用微生物歧化甘油產(chǎn)生。至今所有被發(fā)現(xiàn)的 1,3-丙二醇生產(chǎn)菌種均為細(xì)菌，其中克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)、弗氏梓檬酸桿 菌（Citrobacter freudii)和丁酸梭菌（Clostridium butyricum)具有較高的 1，3_ 丙二 醇轉(zhuǎn)化率和1，3-丙二醇生產(chǎn)強(qiáng)度，具有較高的開(kāi)發(fā)前景，從而得到了較多關(guān)注。
[0005] 目前被用來(lái)生產(chǎn)1，3_丙二醇的克雷伯氏菌主要分離自土壤環(huán)境中?？死撞暇?只能利用甘油產(chǎn)生1，3-丙二醇。在發(fā)酵產(chǎn)生1，3-丙二醇的過(guò)程中，甘油發(fā)生岐化反應(yīng)。還 原途徑包括兩步反應(yīng)：第一步，由依賴于輔酶B 12的甘油脫水酶催化甘油脫水生成3-羥基丙 醛；第二步，由1，3-丙二醇氧化還原酶催化3-羥基丙醛還原生成1，3-丙二醇，此過(guò)程消耗 1摩爾還原力。還原途徑則消耗氧化途徑中多余的還原力，生成1，3_丙二醇。氧化途徑中 的產(chǎn)物與糖類發(fā)酵產(chǎn)物一致，并產(chǎn)生供細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的ATP，在氧化產(chǎn)物形成的同時(shí)釋放 還原力NADH。氧化途徑中甘油先被氧化生成丙酮酸；丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解 為乙酰CoA和甲酸，甲酸容易分解為0) 2和H 2。乙酰CoA在經(jīng)乙酰磷酸形成乙酸的過(guò)程中 生成過(guò)量的ATP，而在經(jīng)乙醛形成乙醇的反應(yīng)中要消耗2摩爾還原力；丙酮酸也可能轉(zhuǎn)化為 2, 3-丁二醇，乳酸和琥珀酸，生成乳酸的過(guò)程要消耗1摩爾還原力，而生成琥珀酸的過(guò)程要 消耗2摩爾還原力。
[0006] 克雷伯氏菌發(fā)酵甘油產(chǎn)生1，3-丙二醇，從代謝途徑分析可知，甘油被轉(zhuǎn)化為主產(chǎn) 物1，3-丙二醇的同時(shí)，產(chǎn)生多種副產(chǎn)物：甲酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、2, 3-丁二醇和乙醇等。 副產(chǎn)物有機(jī)酸往往對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用。有文獻(xiàn)報(bào)道甲酸、乙酸、乳酸等對(duì)微生物菌體生長(zhǎng) 及利用底物存在抑制作用。甲酸抑制作用大于乙酸，lg/L甲酸即明顯抑制底物利用及菌體 生長(zhǎng)，2g/L乙酸開(kāi)始對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生較明顯影響，而乳酸的抑制濃度較高。甲酸可能對(duì)克雷伯氏 菌發(fā)酵甘油產(chǎn)生1，3-丙二醇產(chǎn)生抑制作用。副產(chǎn)物有機(jī)酸的生成不但抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，還會(huì) 造成底物甘油的浪費(fèi)。例如，乳酸的產(chǎn)生導(dǎo)致1，3-丙二醇產(chǎn)量降低。研宄報(bào)道敲除乳酸代 謝途徑關(guān)鍵編碼基因乳酸脫氫酶基因，可以使乳酸合成大幅度減少，1，3-丙二醇生產(chǎn)能力 得到增強(qiáng)。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)1，3-丙二醇的工程菌一敲除甲酸代謝途徑基因的 工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的敲除甲酸代謝途徑基因的工程菌，是通過(guò)以下方法構(gòu)建的，將產(chǎn)1，3_丙 二醇的野生型菌株的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因敲除后獲得的工程菌。
[0009] 所述的1，3-丙二醇的野生型菌株優(yōu)選為克雷伯氏菌屬（Klebsiella)的細(xì)菌，進(jìn) 一步優(yōu)選為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae) 〇
[0010] 所述的將克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因敲除，優(yōu)選通過(guò)以下方法敲 除：
[0011] a、PCR擴(kuò)增克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列，將其與自殺載 體相連，然后再導(dǎo)入雜交供體菌株中；
[0012] b、將步驟a獲得的攜帶有丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列與自殺載體的 供體菌與克雷伯氏菌進(jìn)行雙親本雜交，利用同源重組、基因插入失活，經(jīng)篩選后獲得丙酮酸 甲酸裂解酶flpB基因被失活的敲除乙酸代謝途徑基因的克雷伯氏菌。
[0013] 所述的步驟a的PCR擴(kuò)增克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶f I pB基因的部分 序列是丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的哪一部分序列并不重要，只要是該基因的部分同 源序列即可。當(dāng)所述的產(chǎn)1，3_丙二醇的野生型菌株為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)時(shí)，所述的步驟a的PCR擴(kuò)增克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基 因的部分序列優(yōu)選為是以肺炎克雷伯氏菌的基因組DNA為模板，以上游引物pflB-F: taggtacctgaaagacaaattcgcccag 與下游弓丨物 pflB-R :gagagctccatgcgatccattacttcgt 組 成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的序列。
[0014] 所述的自殺載體可為自殺載體pGPCm，可從試劑公司購(gòu)買(mǎi)。
[0015] 所述的將攜帶有丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因部分同源序列的自殺載體導(dǎo)入雜交 供體菌株中，可以通過(guò)熱激法、電轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)化法等常規(guī)方法轉(zhuǎn)化雜交供體菌。
[0016] 所述的雜交供體菌可以為大腸桿菌SMlO ( λ Pir)。通過(guò)雙親本雜交，使丙酮酸甲酸 裂解酶flpB基因的部分序列與產(chǎn)1，3-丙二醇的目的菌株發(fā)生同源重組，從而使產(chǎn)1，3-丙 二醇的野生型菌株中的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因插入失活，從而獲得敲除甲酸代謝途 徑基因的工程菌。
[0017] 本發(fā)明還提供了敲除甲酸代謝途徑基因的工程菌在生產(chǎn)1，3-丙二醇中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明利用同源重組、基因插入失活的方法使產(chǎn)1，3-丙二醇的野生型菌株中的 丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因沉默，從而得到甲酸代謝途徑被阻斷的基因工程菌。用本發(fā)明 的工程菌進(jìn)行1，3-丙二醇的發(fā)酵生產(chǎn)，甲酸生產(chǎn)大幅度降低，使得副產(chǎn)物甲酸對(duì)細(xì)胞的毒 害作用大大減少，1，3-丙二醇生產(chǎn)濃度、速率提高，另外，由于減少甲酸的代謝分流作用，提 高了底物轉(zhuǎn)化率。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明的工程菌按常規(guī)方法發(fā)酵32小時(shí)，1，3-丙二醇濃度 可達(dá)72g/L以上，甲酸合成減少90%以上。本發(fā)明在微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-丙二醇具有實(shí) 用價(jià)值，可促進(jìn)微生物發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇水平提高。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】：
[0019] 圖1是回收并純化PCR擴(kuò)增的PflB基因目的片段圖
[0020] 圖2是載體pGPCm的物理圖譜

【具體實(shí)施方式】：
[0021] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0022] 實(shí)施例1 :甲酸代謝途徑關(guān)鍵基因一丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被失活的肺炎克 雷伯氏菌突變株的構(gòu)建。
[0023] (1)、克隆丙酮酸甲酸裂解酶基因 pflB部分序列
[0024] 設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增部分丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因序列的引物，引物序列 如下：上游引物 pflB-F :taggtacctgaaagacaaattcgcccag 與下游引物 pflB-R : gagagctccatgcgatccattacttcgt。以野生型肺炎克雷伯氏菌（保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保 藏中心，保藏編號(hào)為：CCTCC M 2011075)基因組DNA為模板，在引物pflB-F和pflB-R的引 導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增丙酮酸甲酸裂解酶pflB的部分序列，PCR擴(kuò)增條件為：先95°C 3min ;然后 94°C lmin，50°C lmin，72°C lmin，共 32 個(gè)循環(huán)；最后 72°C lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，將 PCR 擴(kuò)增 產(chǎn)物進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化約850bp的目的基因片段（圖1)，將其克隆入 載體PMD18-T (TaKaRa公司）中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dh5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn) 化子，提質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證，用限制性內(nèi)切酶kpnl和sacl進(jìn)行酶切鑒定，獲得插入序列正確的 重組質(zhì)粒，命名為pT-pflB質(zhì)粒。
[0025] (2)、構(gòu)建丙酮酸甲酸裂解酶基因 pflB自殺載體pGP-pfIB
[0026] 用限制性內(nèi)切酶kpnl和sacl酶切pT-pflB質(zhì)粒，回收并純化長(zhǎng)度約為850bp的 PflB基因 DNA片段，再將其與經(jīng)kpnl和sacl酶切的載體pGPCm(其物理圖譜如圖2所示） 用DNA連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌SMlO ( λ pir)感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化 子，培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，kpnl和sacl酶切驗(yàn)證，得到含有丙酮酸甲酸裂解酶基因 pflB的部分 序列的重組自殺載體pGP-pflB，即將丙酮酸甲酸裂解酶基因 pflB的部分同源序列與自殺 載體pGPCm相連。
[0027] (3)、構(gòu)建丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被敲除的肺炎克雷伯氏菌突變株
[0028] 將步驟⑵的攜帶有載體pGP-pflB的大腸桿菌SMlO ( λ pir)(供體菌）和野生型 肺炎克雷伯氏菌（CCTCC M 2011075)(受體菌）進(jìn)行雙親本雜交，具體方法為：在含有氯霉 素的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)混合后的供體菌和受體菌；供體菌和受體菌按數(shù)量比3:1比 例混合后，涂布于氯霉素抗性LB平板上，37°C培養(yǎng)12小時(shí)；用挑選培養(yǎng)基上的氯霉素抗性 菌落克隆，梯度稀釋后再次涂布于氯霉素抗性平板上，37°C培養(yǎng)進(jìn)行篩選，得到具有氯霉素 (Cm)抗性的重組菌株，即為甲酸代謝途徑關(guān)鍵基因一丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被插入 失活的肺炎克雷伯氏菌突變株（敲除丙酮酸甲酸裂解酶fIpB基因的肺炎克雷伯氏菌突變 株）。
[0029] 實(shí)施例2 :丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被插入失活的肺炎克雷伯氏菌突變株的活 性檢測(cè)。
[0030] 對(duì)實(shí)施例1的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被插入失活的肺炎克雷伯氏菌突變株 進(jìn)行丙酮酸甲酸裂解酶的活性檢測(cè)，以野生型肺炎克雷伯氏菌為對(duì)照，具體方法包括以下 步驟：
[0031] (1)將丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被失活的肺炎克雷伯氏菌突變株接種于IOOmL 培養(yǎng)基（每升水中含有甘油20g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，pH 7.0，120°C滅菌 20min)中，在37°C下振蕩培養(yǎng)6-12小時(shí)，每2小時(shí)取樣離心收集菌體；
[0032] (2)用IOOmL磷酸緩沖液（0. 1M，pH7. 5)懸浮洗滌菌體2次；
[0033] (3)用2. 5mL磷酸緩沖液（0· 1M，ρΗ7· 5)懸浮菌體；
[0034] (4)超聲波低溫4°C破碎菌體；
[0035] (5)3000g低溫離心30min，取上清測(cè)定酶活，測(cè)定方法為用紫外分光光度計(jì)測(cè)定 反應(yīng)體系在OD 34tlmi處Imin內(nèi)的變化值，即Λ A 34(lnm/min。反應(yīng)體系為：含20mM的丙酮酸鈉， 0. 08mMCoA，I mM NAD，2mM DTT，6mM DL 蘋(píng)果酸鈉，I. 4U/mL 檸檬酸合成酶，13. 8u/mL 蘋(píng)果酸 脫氫酶，在pH為7. 5,終濃度為0. 03M磷酸鉀緩沖溶液中進(jìn)行反應(yīng)。加入IOuL粗酶液激活 酶促反應(yīng)。測(cè)定IOmin內(nèi)NADH在340nm處吸光度的變化。酶活力單位定義為：在溫度為 30°C，pH為7. 5條件下，每分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化Iu mol丙酮酸所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位。
[0036] 結(jié)果顯示，實(shí)施例1構(gòu)建的敲除丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的肺炎克雷伯氏菌突 變株的丙酮酸甲酸裂解酶活性為野生型菌株的1. 5% -3. 6%，表明實(shí)施例1構(gòu)建的敲除丙 酮酸甲酸裂解酶flpB基因的肺炎克雷伯氏菌突變株的丙酮酸甲酸裂解酶失活。
[0037] 實(shí)施例3 :利用敲除丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的肺炎克雷伯氏菌突變株發(fā)酵生 產(chǎn)1，3_丙二醇
[0038] (1)培養(yǎng)基
[0039] LB培養(yǎng)基（g · Γ1):酵母粉5,蛋白胨10, NaCl 10,瓊脂10,調(diào)節(jié)至pH 7.0,用于 克雷伯氏菌菌種的短期保藏及活化。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基組成見(jiàn)表1 :
[0040] 表1 :培養(yǎng)基組成
[0041]

【權(quán)利要求】
1. 一種敲除甲酸代謝途徑基因的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，是將克雷伯氏菌屬 (Klebsiella)的細(xì)菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因敲除后獲得的工程菌。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的克雷伯氏菌屬的細(xì)菌為肺炎 克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的將克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸 裂解酶flpB基因敲除，具體通過(guò)以下方法敲除： a、 PCR引物擴(kuò)增克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列，將其與自殺載 體相連，然后再導(dǎo)入雜交供體菌株中； b、 將步驟a獲得的攜帶有丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列與自殺載體的供體 菌與克雷伯氏菌進(jìn)行雙親本雜交，利用同源重組、基因插入失活，經(jīng)篩選后獲得丙酮酸甲酸 裂解酶flpB基因被失活的敲除甲酸代謝途徑基因的克雷伯氏菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，當(dāng)所述的克雷伯氏菌屬的細(xì) 菌為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)時(shí)，所述的步驟a的PCR擴(kuò)增克雷 伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列是以肺炎克雷伯氏菌的基因組DNA 為模板，以上游引物 pflB-F :taggtacctgaaagacaaattcgcccag 與下游引物 pflB-R : gagagctccatgcgatccattacttcgt組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的自殺載體為自殺載體 pGPCm，所述的雜交供體菌為大腸桿菌SM10 ( A pir)。
6. -種按照權(quán)利要求1、2、3或4所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的敲除甲酸代謝途徑基因的 工程菌。
7. 權(quán)利要求6所述的敲除甲酸代謝途徑基因的工程菌在生產(chǎn)1，3_丙二醇中的應(yīng)用。
8. -種按照權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的敲除甲酸代謝途徑基因的工程菌。
9. 權(quán)利要求8所述的敲除甲酸代謝途徑基因的工程菌在生產(chǎn)1，3_丙二醇中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/22GK104498523SQ201410834675
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月26日
【發(fā)明者】周勝, 秦啟偉, 黃友華, 俞也頻, 尼松偉 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所