專利名稱：：新的產(chǎn)生同質(zhì)琥珀酸的工程微生物以及使用這此微生物制備同質(zhì)琥珀酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種產(chǎn)同質(zhì)琥珀酸的瘤胃細(xì)菌突變體以及使用這些瘤胃細(xì)菌突變體制備同質(zhì)琥珀酸的方法，具體涉及選自在厭氧條件下產(chǎn)生高濃度琥珀酸同時(shí)很少產(chǎn)生或者不產(chǎn)生其他有機(jī)酸的瘤胃細(xì)菌突變體，所述瘤胃細(xì)菌突變體通過(guò)使編碼乳酸脫氫酶的基因、編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(phosphotransacetylase，的基因和編碼乙酸激酶(acA4)的基因斷裂但不使編碼丙酮酸甲酸裂解酶(//7)的基因斷裂而得到，還涉及使用這些瘤胃細(xì)菌突變體制備琥珀酸的方法。
背景技術(shù)：
：琥珀酸(HOOCCH2CH2COOH)，一種包括4個(gè)碳原子的二羧酸，是一種具有高度實(shí)用性的有機(jī)酸，其被廣泛用于藥物前體、食品、化妝品以及其他工業(yè)的化學(xué)產(chǎn)品(Zeikus等人，j/p/.Af/croWo/.5z'ofec/z"o/.,51:545,1999;Song等人，M,c油Wrec/mo/.,39:352,2006)。特別是，隨著最近石油價(jià)格暴漲，預(yù)期對(duì)于將琥珀酸作為生物降解大分子的主要來(lái)源的需要急劇增加(Willke等人，^//.MfcroWo/.5/Wec/mo/.，66:131,2004)。琥珀酸可通過(guò)化學(xué)合成法和發(fā)酵法生產(chǎn)。但是，用于工業(yè)應(yīng)用的大部分琥珀酸目前由中國(guó)石化公司、日本石化公司和大的石化公司諸如BASF,DuPont,BP石化等使用來(lái)自石油的n-丁烷和乙炔作為原料通過(guò)化學(xué)合成法生產(chǎn)，僅僅少量用于專門用途諸如藥物等的琥珀酸是通過(guò)常規(guī)微生物發(fā)酵法來(lái)生產(chǎn)的。上面提到的化學(xué)合成法的問(wèn)題是在琥珀酸生產(chǎn)過(guò)程中排出了大量產(chǎn)生的有害廢物、廢水和廢氣(例如co等)。特別是，極可能資源耗盡的礦物燃料被用作基本材料，因此迫切需要開發(fā)一種使用替代燃料諸如可再生資源代替礦物燃料來(lái)制備琥珀酸的方法。為了克服由制備琥珀酸的化學(xué)合成過(guò)程引起的這些問(wèn)題，許多研究者己經(jīng)就通過(guò)使用各種可再生資源進(jìn)行微生物發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸方面進(jìn)行了深入廣泛的研究。已經(jīng)被用于琥珀酸生產(chǎn)的微生物有很多，但它們一般可被歸類為重組大腸桿菌(&c/zeWc/H》.Co//)和瘤胃細(xì)菌(放線桿菌，厭氧螺菌，類桿菌，Mannheimia，琥珀酸單胞菌，琥珀酸弧菌等)(Song等人，五w2^meM"/croZ>//Tec/mo/"39:352,2006)。在關(guān)于使用重組Eco//生產(chǎn)琥珀酸的研究中，試圖通過(guò)制備突變AFP111(ATCCNo.202021)增加琥珀酸的產(chǎn)量，所述突變AFP111由芝加哥大學(xué)研宄組通過(guò)其中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因(ptsG)受到調(diào)控同時(shí)在E.coli中生產(chǎn)乳酸和蟻酸中涉及的基因(ldh和pfl)被剔除而得到(美國(guó)專利US5,770，435)。本發(fā)明的發(fā)明人在重組五.co//NZN111菌株中擴(kuò)增了在琥珀酸產(chǎn)生中涉及的蘋果酸酶G/cJ)基因，從該菌株中剔除了ldh和pfl基因以抑制在NZNlll菌株的發(fā)酵過(guò)程中積累的丙酮酸，從而增加了琥珀酸的產(chǎn)量(Hong等人，5z'o^c/mo/.所oe"g.,74:89,2001)。而且，佐治亞大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)的研究人員己經(jīng)通過(guò)在AFPlll菌株中表達(dá)丙酮酸氧化酶(pyc)基因構(gòu)建了AFPlll/pTrc99A-;;;c菌株，然后使用該菌株生產(chǎn)琥珀酸(Vemuri等人，《/.M/cro編.5/o&c/mo/"28:325,2001)。近來(lái)，為了誘導(dǎo)琥珀酸在厭氧條件下產(chǎn)生，RiceUniversity領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)的研究人員報(bào)道了他們已經(jīng)通過(guò)對(duì)糖酵解途徑，TCA循環(huán)和乙醛酸途徑中涉及的基因構(gòu)建了重組E.coli菌株(Lin等人，￡"g.，7:116,2005;LinWa/"5/她c/mo/.90:775，2005)。已知作為瘤胃細(xì)菌的放線桿菌菌株、厭氧螺菌菌株和M朋"/^/m/"菌菌株是非常好的琥珀酸產(chǎn)生菌，于是對(duì)這些菌株進(jìn)行了積極的研究。美國(guó)MichiganBiotechnologyInstitute(MBI)領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)的研究人員發(fā)現(xiàn)了琥珀酸放線桿菌(爿c"wo6acz7/wwcc/"oge"es)130Z菌株(ATCCNo.55618)，使用傳統(tǒng)的化學(xué)誘變方法發(fā)展了用于生產(chǎn)琥珀酸的方法和構(gòu)建的各種琥珀酸放線桿菌突變菌株，以便在發(fā)展用于生產(chǎn)并純化琥珀酸的工藝中使用(美國(guó)專利US5,521,075;美國(guó)專利US5,168,055;美國(guó)專利US5，143，843)。但是，迄今為止發(fā)展的使用微生物發(fā)酵的琥珀酸生產(chǎn)工藝具有不到2g/L/h的非常低的產(chǎn)量，尤其是其招致了極大的成本來(lái)分離并純化琥珀酸，因?yàn)樵诎l(fā)酵過(guò)程中琥珀酸與在某些程度上作為副產(chǎn)品的大量各種有機(jī)酸和乙醇一起產(chǎn)生。雖然上述結(jié)果顯示在一些重組菌株中作為副產(chǎn)品的乳酸、蟻酸、醋酸和乙醇的影響減小，但沒(méi)有顯示它們完全被消除。另外，在其他重組的突變菌株中，存在的一些情況是它們的生長(zhǎng)速率變得很低，總琥珀酸產(chǎn)量并沒(méi)有增加。因此，迫切需要開發(fā)新的琥珀酸產(chǎn)生菌株，其具有高琥珀酸產(chǎn)量并防止副產(chǎn)品的產(chǎn)生(Hong等人,5涵c/mo/.22:871,2000)。為了開發(fā)新的琥珀酸產(chǎn)生菌來(lái)滿足上述需要，必須進(jìn)行具有非常高的琥珀酸產(chǎn)量的菌株的分離，完成其基因組序列，理解其新陳代謝特性并建立對(duì)于構(gòu)建重組菌株所需的遺傳操作技術(shù)。到目前為止，在具有高琥珀酸產(chǎn)量的細(xì)菌的情況下，完成了MTOCc/"/c^ra^ce"sMBEL55E菌株的全基因組序列，但是那些瘤胃細(xì)菌諸如放線桿菌，厭氧螺菌等仍未見報(bào)道。雖然已經(jīng)報(bào)道了試圖通過(guò)在五.co//中擴(kuò)增Awcc/"oge"w和Awcc/"/c^o^ce似的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pckA)基因的嘗試(Kim等人，J///.￡>rwyow.Af/croZn'o/.,70:1238,2004;丄az'vew/e^s等人，五"vzVo".M/croWo/.，63:2273,1997)，但沒(méi)有嘗試基于基因組序列開發(fā)重組琥珀酸產(chǎn)生菌。本發(fā)明的發(fā)明人己經(jīng)報(bào)道了他們分離了來(lái)自韓國(guó)本土黃牛的高效產(chǎn)生琥珀酸的M;ywcc/m'"》a"o^ce似MBEL55E(KCTC0769BP)，完成了基因組序列并描述了菌株的新陳代謝特性(Hong等人A^z^5/o^/mo/.,22:1275，2004)。而且，本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)使作為瘤胃細(xì)菌的一種的A/.wcc/m'"jwoafwce"sMBEL55E中編碼乳酸脫氫酶(W/l4)的基因和編碼丙酮酸甲酸裂解酶te/)的基因斷裂以抑制乳酸和蚊酸的產(chǎn)生構(gòu)建了細(xì)菌突變體Mswcc/"/":^o^ce"sLPK(KCTC10558BP)。除此之外，本發(fā)明通過(guò)在突變菌株Mwcc/m'c^w/McmsLPK中使編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(Wfl)的基因和編碼乙酸激酶(flcLi)的基因斷裂以便抑制醋酸的產(chǎn)生構(gòu)建了突變Mracc/m'"^o^ce似LPK7(KCTC1062BP)，以在厭氧條件下培養(yǎng)細(xì)菌突變體(WO05/052135Al;Lee等人，五"v/ra".M/croWo/.72:1939,2006)，從而增加琥珀酸。但是，在所述突變菌株的情況下，雖然副產(chǎn)品蟻酸和醋酸的產(chǎn)生在一定程度上受到抑制，但在發(fā)酵過(guò)程中大量的丙酮酸作為副產(chǎn)品積累，與野生菌相比其中絕大多數(shù)細(xì)菌的生長(zhǎng)速率低致不能達(dá)到很高的琥珀酸產(chǎn)量。同時(shí)，據(jù)報(bào)道丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)基因參與丙酮酸到乙酰輔酶A(乙酰-CoA)的轉(zhuǎn)化，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和丙酮酸的重新分布(Wolfe，AZ/cro6/a/.Afo/.丑z'o/.iev.，69:12,2005)。因此，本發(fā)明的發(fā)明人付出了極大的努力，通過(guò)將微生物生長(zhǎng)率的降低最小化并完全抑制各種副產(chǎn)品包括丙酮酸的形成，構(gòu)建了能夠高產(chǎn)量產(chǎn)生同質(zhì)琥珀酸的突變微生物，并發(fā)展了其發(fā)酵方法，結(jié)果，他們通過(guò)在作為瘤胃細(xì)菌的一種的A/:wcc/"/c&ro^/ce";jMBEL55E中使編碼乳酸脫氫酶(W/2j)的基因、編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(pto)的基因和編碼乙酸激酶(acLi)的基因斷裂但不使編碼丙酮酸甲酸裂解酶0^/7)的基因斷裂而構(gòu)建了細(xì)菌突變體M.swcc/m'";^o^ce/wPALK(KCTC10973BP)，然后在厭氧條件下使用葡萄糖和甘油作為碳源發(fā)酵突變菌株，并確認(rèn)突變菌株可高產(chǎn)量產(chǎn)生幾乎同質(zhì)的琥珀酸，從而完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供突變微生物，其具有高生長(zhǎng)率和琥珀酸產(chǎn)率并在厭氧發(fā)酵階段過(guò)程中僅僅以高產(chǎn)量產(chǎn)生琥珀酸同時(shí)產(chǎn)生很少其他有機(jī)酸或者不產(chǎn)生其他有機(jī)酸。本發(fā)明的另一目的在于提供通過(guò)使用葡萄糖和甘油作為碳源在厭氧條件下培養(yǎng)突變微生物產(chǎn)生同質(zhì)琥珀酸而不積累其他副產(chǎn)品的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了產(chǎn)生琥珀酸微生物中缺乏乳酸脫氫酶(ldhA)基因、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(;to)基因和乙酸激酶("c^A)基因而同時(shí)僅保持蟻酸裂解酶(pfl)基因的瘤胃細(xì)菌突變體，其具有在厭氧條件下僅僅高濃度產(chǎn)生琥珀酸同時(shí)很少產(chǎn)生或者不產(chǎn)生有機(jī)酸的特性。而且，本發(fā)明提供了在wcc/"/c^n^Mce"s中缺乏乳酸脫氫酶(ldhA)基因、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(;to)基因和乙酸激酶(acA:A)基因而同時(shí)保持蟻酸裂解酶(pfl)基因的瘤胃細(xì)菌突變體Afo""/ze/m/aswcc/"/";pro^ce似PALK(KCTC10973BP)，其具有在厭氧條件下僅僅高濃度產(chǎn)生琥珀酸同時(shí)很少產(chǎn)生或者不產(chǎn)生有機(jī)酸的特性。另外，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)瘤胃細(xì)菌突變體的方法，所述方法包括下列步驟(a)使用同源重組法再琥珀酸產(chǎn)生瘤胃細(xì)菌的基因組中通過(guò)使乳酸脫氫酶(ldhA)基因斷裂得到缺乏編碼乳酸脫氫酶(ldhA)基因的瘤胃細(xì)菌突變體；和(b)通過(guò)同源重組從缺乏編碼乳酸脫氫酶(/^4)基因的瘤胃細(xì)菌突變體的基因組中使編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(;to)的基因和編碼乙酸激酶(acLi)的基因斷裂得到缺乏編碼乳酸脫氫酶(W/l4)基因、編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(^")的基因和編碼乙酸激酶("c^i)的基因的瘤胃細(xì)菌突變體。此外，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)琥珀酸的方法，所述方法包括下列步8驟在厭氧條件下培養(yǎng)瘤胃細(xì)菌突變體；并且從培養(yǎng)液中回收琥珀酸。通過(guò)下列詳細(xì)描述和所附的權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征和實(shí)施例將更加明顯。圖1是顯示根據(jù)本發(fā)明的在突變微生物中的琥珀酸產(chǎn)生途徑的示意圖。圖2顯示了通過(guò)同源重組構(gòu)建用于斷裂W/l4(pMLKO-sacB)的置換載體的過(guò)程。圖3顯示了通過(guò)同源重組使Ma朋/2e/w/a^Mc"7n'ci^oi/wcewsMBEL55E中的ldhA基因斷裂構(gòu)建細(xì)菌突變體(Mwcc/m'c^ro^cewLK)的過(guò)程。圖4顯示了通過(guò)同源重組構(gòu)建用于斷裂W"和acL4(pPTA-sacB)的置換載體的過(guò)程。圖5顯示了通過(guò)同源重組使;ywcc/m'c^ra^ce似PALK中的W/^4和；to-^L4基因斷裂構(gòu)建細(xì)菌突變體的過(guò)程。圖G使顯不M/"/";pro￡/wce"sPALK中的pto-acL4的斷裂的電泳照片，其中M代表lkb的標(biāo)記物，第l-6道代表使用引物PAUl和SP1的PCR片段(l.lkb);A-F道代表使用引物SP2和PAD2的PCR片段(1.5kb)。圖7顯示了本發(fā)明的M.swcc/m'c/^0(iMce似PALK在C02飽和的厭氧條件下的培養(yǎng)特性。具體實(shí)施例方式在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生琥珀酸微生物中缺乏乳酸脫氫酶(ldhA)基因、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(;to)基因和乙酸激酶(fl^A)基因斷裂而同時(shí)僅保持蟻酸裂解酶(pfl)基因的瘤胃細(xì)菌突變體，其具有在厭氧條件下僅僅高濃度產(chǎn)生琥珀酸同時(shí)很少產(chǎn)生或者不產(chǎn)生有機(jī)酸的特性。在本發(fā)明中，產(chǎn)琥珀酸的微生物指的是與乙醇或者其他有機(jī)酸相比能夠產(chǎn)生超大量琥珀酸的微生物，其可通過(guò)發(fā)酵被用于琥珀酸生產(chǎn)的工業(yè)用途。典型的產(chǎn)琥珀酸微生物包括瘤胃細(xì)菌。通過(guò)部分遺傳信息(16srRNA)，酶分析，作為瘤胃細(xì)菌屬琥珀酸放線桿菌、厭氧螺菌和到目前為止已知的各種琥珀酸產(chǎn)生瘤胃細(xì)菌的發(fā)酵結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在瘤胃細(xì)菌中用于通過(guò)碳源進(jìn)行琥珀酸生產(chǎn)的主要生物合成途徑與作為瘤胃細(xì)菌屬的一種的Afo""/ze/附/asp中用于琥珀酸產(chǎn)生的合成途徑幾乎相同(表1;VanderWerf等人，爿rc/zM/cro6/o/.,167:332,1997;Laivenieks等人，乂///.M/mWo/"63:2273,1997;Samuelov等人，￡,>ow.Mc油.o/"65:2260,1999;Kim等人，￡謂.戰(zhàn)緣疏o/"70:1238，2004))。尤其是在琥珀酸生產(chǎn)中涉及的所有的瘤胃細(xì)菌在琥珀酸生產(chǎn)時(shí)使用C02固定酶將磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸、C3化合物轉(zhuǎn)化成草酰乙酸鹽和蘋果酸鹽、C4化合物，從而產(chǎn)生琥珀酸。另外，瘤胃細(xì)菌在厭氧條件下產(chǎn)生醋酸、蟻酸和乳酸作為發(fā)酵副產(chǎn)品，從而建議所有的瘤胃細(xì)菌包括Ma""/e/m/asp具有相同的琥珀酸生物合成途徑。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</table在本發(fā)明中，能夠高濃度產(chǎn)生琥珀酸同時(shí)很少或者不產(chǎn)生其他有機(jī)酸的具有高生長(zhǎng)速率的產(chǎn)琥珀酸突變微生物通過(guò)操作產(chǎn)琥珀酸微生物的瘤胃細(xì)菌基因組構(gòu)建。換言之，乳酸脫氫酶(ldhA)基因、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(;m)基因和乙酸激酶("cAA)基因在Mracc/"/c^rafl^ce"sMBEL55E(KCTC0769BP)的基因組DNA中被斷裂，從而構(gòu)建了細(xì)菌突變體Mwcc/"/ci^o^ce"sPALK(KCTC10973BP)，其顯示了高生長(zhǎng)率并產(chǎn)生高濃度琥珀酸同時(shí)產(chǎn)生很少或者不產(chǎn)生其他有機(jī)酸。在本發(fā)明中，為了每個(gè)基因的斷裂，采用了通過(guò)同源重組置換基因使其失活的方法，但任何方法都可無(wú)限制地被使用，只要其為其中相應(yīng)基因可被修飾或者剔除使不產(chǎn)生由相應(yīng)基因編碼的酶的基因操作方法。在本發(fā)明中，瘤胃細(xì)菌選自由M"""/^m&屬、放線桿菌屬和厭氧螺菌屬所組成的組。在本發(fā)明中，突變微生物優(yōu)選僅僅產(chǎn)生琥珀酸同時(shí)形成很少或者不形成其他有機(jī)酸副產(chǎn)品的同質(zhì)發(fā)酵菌株，所產(chǎn)生的其他有機(jī)酸的量?jī)?yōu)選少于產(chǎn)生的琥珀酸量的lwt%，其他有機(jī)酸優(yōu)選為任何一種或多種有機(jī)酸，其選自由乳酸、醋酸、蟻酸和丙酮酸所組成的組。在另一方面，本發(fā)明涉及在Mwcc/"/c^ro^ce似中缺乏乳酸脫氫酶(W/^)基因、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(;to)基因和乙酸激酶OdtA)基因同時(shí)保持丙酮酸甲酸裂解酶fe/7)基因的瘤胃細(xì)菌突變體Mracc/m'c^ro^cewPALK(KCTC10973BP)，其具有在厭氧條件下高濃度產(chǎn)生琥珀酸同時(shí)很少產(chǎn)生或者不產(chǎn)生有機(jī)酸的特性。通過(guò)使用在Mfl""/ze/m/fl屬的基因組中使編碼乳酸脫氫酶(W/l4)基因，丙酮酸甲酸裂解酶fe/)基因，磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(pto)基因和乙酸激酶(adA)基因斷裂構(gòu)建的Mwcc/"/";^o^ce似LPK7(KCTC10626BP)以便將根據(jù)本發(fā)明的Afow"/^/m/aswcc/m'ci^ro<iwceraPALK(KCTC10973BP)的琥珀酸產(chǎn)率和生長(zhǎng)率與傳統(tǒng)細(xì)菌突變體進(jìn)行比較。這里，細(xì)菌突變體M.swcc/m'c^^^wce似LPK7(KCTC10626BP)具有在根據(jù)本發(fā)明的Mswcc/m'c^n^wcewPALK(KCTC10973BP)中編碼丙酮酸甲酸裂解酶(p;7)的基因另外的斷裂(WO2005/052135;Lee等人，五m^o".M/c油'o/.72:1939,2006)。根據(jù)本發(fā)明的Ms"cc/"/"jwo^ce朋PALK(KCTC10973BP)具有高琥珀酸產(chǎn)率并產(chǎn)生很少或者不產(chǎn)生副產(chǎn)品諸如乳酸、醋酸、蟻酸和丙酮酸，從而與用于琥珀酸生產(chǎn)的野生型MTOCc/"/c&rai/wce";yMBEL55E(KCTC0769BP)和以前構(gòu)建的細(xì)菌突變體Mwcc/"/c^Y^wce朋LPK7(KCTC10626BP)相比顯示了優(yōu)異的性能，與以前構(gòu)建的細(xì)菌突變體Mracc/"/")^ocfwce似LPK7(KCTC10626BP)相比通過(guò)防止丙酮酸積累，由12于其高生長(zhǎng)率、高琥珀酸產(chǎn)率和同質(zhì)琥珀酸產(chǎn)生從而可產(chǎn)生高濃度琥珀酸。在還一方面，本發(fā)明涉及用于構(gòu)建瘤胃細(xì)菌突變體的方法，所述方法包括下列步驟(a)使用同源重組法在產(chǎn)琥珀酸瘤胃細(xì)菌的基因組中通過(guò)使乳酸脫氫酶(ldhA)基因斷裂得到缺乏編碼乳酸脫氫酶(ldhA)基因的瘤胃細(xì)菌突變體；和(b)通過(guò)同源重組從缺乏編碼乳酸脫氫酶(W/l4)基因的瘤胃細(xì)菌突變體的基因組中使編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(pto)的基因和編碼乙酸激酶("d々的基因斷裂得到缺乏編碼乳酸脫氫酶(W/l4)基因、編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(;to)的基因和編碼乙酸激酶(flcLi)的基因的瘤胃細(xì)菌突變體。在本發(fā)明中，同源重組步驟(a)優(yōu)選使用含有斷裂的ldhA的基因交換載體進(jìn)行，同源重組步驟(b)優(yōu)選使用含有斷裂的pta-ackA的基因交換載體進(jìn)行。在本發(fā)明中，含有斷裂的ldhA的基因交換載體優(yōu)選pMLKO-sacB，含有斷裂的pta-ackA的基因交換載體優(yōu)選pMPKO-sacB。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)琥珀酸的方法，所述方法包括下列步驟在厭氧條件下培養(yǎng)上述突變微生物；并且從培養(yǎng)液中回收琥珀酸。在本發(fā)明中，對(duì)于培養(yǎng)而言，葡萄糖和甘油優(yōu)選被用作碳源，作為副產(chǎn)品的其他有機(jī)酸的量?jī)?yōu)選小于所產(chǎn)生的琥珀酸的量的lwt%。在又一方面，本發(fā)明涉及制備琥珀酸的方法，所述方法包括下列步驟在厭氧條件下培養(yǎng)瘤胃細(xì)菌突變體；并且從培養(yǎng)液中回收琥珀酸。根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)琥珀酸突變微生物的培養(yǎng)和琥珀酸的回收過(guò)程可通過(guò)常規(guī)發(fā)酵過(guò)程中已知的培養(yǎng)方法和分離并純化琥珀酸的方法來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明中，對(duì)于培養(yǎng)而言，葡萄糖和甘油優(yōu)選被用作碳源，作為副產(chǎn)品的其他有機(jī)酸的量?jī)?yōu)選小于所產(chǎn)生的琥珀酸的量的lwt%。13實(shí)施例此后將通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。但是，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見的是，這些實(shí)施例僅僅用于解釋的目的而提供，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例或者不由這些實(shí)施例限制。特別是，下面的例子僅僅示出了作為產(chǎn)琥珀酸微生物的Afo""/^m^印.作為宿主菌以便根據(jù)本發(fā)明剔除基因。但是，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見的是，即便是使用其他種類的產(chǎn)琥珀酸微生物，也可獲得產(chǎn)生同質(zhì)琥珀酸的突變微生物。實(shí)施例1:W^4斷裂載體(pMLKO-sacB)的構(gòu)建為了通過(guò)同源重組使產(chǎn)琥珀酸微生物的基因組中的乳酸脫氫酶基因(ldhA)斷裂，按照下列方式構(gòu)建了基因交換載體。首先，以M^cc/"/c&^^wce似MBEL55E(KCTC0769BP)作為模板使用在下面的序列號(hào)1和序列號(hào)2中闡明的引物進(jìn)行PCR，然后將得到的含有l(wèi)dhA-同源區(qū)1(Ll)的PCR片段用&cI和PWl酶切并引入到pUC18載體中(NewEnglandBiolabs,Inc.,USA),從而構(gòu)建pUC18-Ll。序列號(hào)1:5，-CAGTGAAGGAGCTCCGTAACGCATCCGCCG序列號(hào)2:5，-CTTTATCGAATCTGCAGGCGGTTTCCAAAA另外，Ms"cc/m'c/^o^ce似MBEL55E(KCTC0769BP)的基因組DNA作為模板使用在下面的序列號(hào)3和序列號(hào)4中闡明的引物進(jìn)行PCR，然后將得到的含有l(wèi)dhA-同源區(qū)2(L2)的PCR片段用尸M和酶切并引入到pUC18載體中，從而構(gòu)建pUC18-Ll-L2。序列號(hào)3:5，-GTACTGTAAACTGCAGCTTTCATAGTTAGC序列號(hào)4:5，-GCCGAAAGTCAAGCTTGCCGTCGTTTAGTG為了將抗-卡那霉素基因作為選擇標(biāo)記插入到pUC18-Ll-L2中，并用尸M酶切pUC4K載體(Pharmacia,Germany),將得到的抗-卡那霉素基因與用尸M酶切的pUC18-Ll-L2融合，從而構(gòu)建pUC18-Ll-KmR-L2。將在序列號(hào)5中闡明的接頭插入到用Sacl酶切的pUC18-Ll-KmR-L2中，從而形成新的X6"I酶切位點(diǎn)。序列號(hào)5:5'-TCTAGAAGCT為了將^cB基因插入到其中己經(jīng)被插入X6al酶切位點(diǎn)的pUC18-Ll-KmR-L2中，以pKmobsacB(Schafer等人，145:69，1994)作為模板使用在序列號(hào)6和7中闡明的引物進(jìn)行PCR。然后得到的含有^cB的PCR片段用Z6"I酶切，并插入到其中已經(jīng)插入了上述力al酶切位點(diǎn)的pUC18-Ll-KmR-L2的新JT6al限制酶位點(diǎn)中，從而構(gòu)建用于斷裂W/^基因的交換載體pMLKO-sacB(圖2)。序列號(hào)6:5'-GCTCTAGACCTTCTATCGCCTTCTTGACG序列號(hào)7:5'-GCTCTAGAGGCTACAAAATCACGGGCGTC實(shí)施例2:M匿"'/i/c/jP/Wwce附LK菌株的構(gòu)建通過(guò)使用在實(shí)施例1中構(gòu)建的pMLKO-sacB作為斷裂ldhA基因的交換載體斷裂Mwcc/"/";^o^ce朋MBEL55E(KCTC0769BP)基因組中的ldhA基因構(gòu)建突變菌株(圖3)。換言之，將Mwcc/m'c,聲o^ce似MBEL55E(KCTC0769BP)接種于(platedon)含有10g/L葡萄糖的LB-葡萄糖平板培養(yǎng)基中，并37'C培養(yǎng)36小時(shí)。形成的菌落接種到(inoculated)10mlLB-葡萄糖液體培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)12小時(shí)。將已經(jīng)充分生長(zhǎng)的1%的培養(yǎng)液接種到100mlLB-葡萄糖液體培養(yǎng)基中并在搖床中以200rpm、在37'C下培養(yǎng)。當(dāng)在4-5小時(shí)之后培養(yǎng)液的OD6o。達(dá)到大約0.3-0.4時(shí)，將其在4'C下以4500rpm離心20分鐘以收集細(xì)胞。然后，將細(xì)胞在4°C下懸浮于200ml10%甘油溶液中。將懸液在4°C下以5500rpm離心20分鐘，并收集細(xì)胞。以上面描述的過(guò)程相同的方式在一半的上述甘油溶液中懸浮并收集兩次之后，以l:1的體積比將細(xì)胞懸浮在甘油中，得到濃縮的細(xì)胞。將由此得到的濃縮細(xì)胞與在實(shí)施例1中構(gòu)建的pMLKO-sacB基因交換載體混合，然后通過(guò)在1.8kV、25pF和200歐姆條件下電穿孔將pMLKO-sacB引入到培養(yǎng)的Mracc/m'")^oc/Mce"sMBEL55E(KCTC0769BP)中。將1mlLB-葡萄糖液體培養(yǎng)基加入到引入了pMLKO-sacB的菌株中，在37°C下以200rpm在搖床中預(yù)培養(yǎng)一小時(shí)。將培養(yǎng)液接種于含有抗生素卡那霉素(終濃度為25嗎/ml)的LB-葡萄糖固體培養(yǎng)基中并在37°C培養(yǎng)48小時(shí)或更長(zhǎng)。為了選擇其中僅僅發(fā)生雙交換的菌落，將形成的菌落在含有卡那霉素(25嗎/ml)和100g/L蔗糖的LB-蔗糖固體培養(yǎng)基上劃線。24小時(shí)之后，形成的菌落在相同的培養(yǎng)基上再次劃線。將在培養(yǎng)基上形成的菌落(突變體)在含有抗生素的LB-葡萄糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從培養(yǎng)的菌株中通過(guò)Rochelle等人描述的方法(Rochelle等人，F(xiàn)五MSM/cro6/o/.丄e仏，100:59,1992)分離基因組DNA。使用分離的突變體基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR，并且將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳以確認(rèn)基因組DNA中的ldhA基因斷裂。為了確認(rèn)ldhA基因的斷裂，按照下列方式進(jìn)行兩次PCR。第一，突變體基因組DNA作為模板使用在序列號(hào)8和序列號(hào)9中闡明的引物進(jìn)行PCR。序列號(hào)8:5'-GACGTTTCCCGTTGAATATGGC(KM1)序列號(hào)9:5'-CATTGAGGCGTATTATCAGGAAAC(LU1)然后，突變體基因組作為模板使用在序列號(hào)10和序列號(hào)11中闡明的引物進(jìn)行PCR。序列號(hào)10:5'陽(yáng)GCAGTTTCATTTGATGCTCGATG(KM2)序列號(hào)11:5，-CCTCTTACGATGACGCATCTTTCC(LD2)將兩次PCRs中得到的PCR片段進(jìn)行凝膠電泳，通過(guò)它們的大小確認(rèn)ldhA基因的斷裂。具有斷裂的ldhA基因的基因組DNA的PCR片段通過(guò)下列事實(shí)確認(rèn)使用序列號(hào)8(KM1)和序列號(hào)9(LU1)引物的PCR得到的產(chǎn)物具有1.5kb的大小，同時(shí)使用序列號(hào)10(KM2)和序列號(hào):11(LU2)引物的PCR得到的產(chǎn)物具有1.7kb的大小。每種引物的位置在圖3中顯示。突變菌株Mwcc/"/c0roflfwcewLK根據(jù)上述方法通過(guò)將Mj"c"'"/cz^w^ce"jMBEL55E的基因組中的W/^基因斷裂而構(gòu)建。實(shí)施例3:用于斷裂nta和ackA的基因交換載體(pPTA-sacB)的構(gòu)建為了通過(guò)同源重組斷裂Af.swcc/"/c;rofi^ce似LK菌株的基因組中的pta和ackA基因，按照下列方式構(gòu)建基因交換載體。將含有^c5基因作為模板的pKmobsacB使用在序列號(hào)12和序列號(hào)13中闡明的引物進(jìn)行PCR。得到的產(chǎn)物用尸M和5amHI酶切并插入到pUC19(StratageneCloningSystems.USA)中，從而構(gòu)建pUC19-sacB(FIG.4)。序列號(hào)12:5'-AGCGGATCCCCTTCTATCGCCTTCTTGACG序列號(hào)13:5'-GTCCTGCAGGGCTACAAAATCACGGGCGTC同時(shí)，以M.wcc/m'c/^ofi^ce"sLK的基因組DNA作為模板使用在序列號(hào)14和序列號(hào)15中闡明的引物進(jìn)行PCR，將得到的含有同源區(qū)1的PCR片段用Z6al和SamHI酶切。另外，M.^cc7'w'c^n^ce似LK的基因組DNA作為模板使用在序列號(hào)16和序列號(hào)17中闡明的引物進(jìn)行PCR，將得到的含有；to-acL4同源區(qū)2的PCR片段用和Sacl酶切。然后，將這些片段插入到pUC19的&wHI和Sad位點(diǎn)，從而構(gòu)建pUC19-PTA12。序歹U號(hào)14:5'-GCTCTAGATATCCGCAGTATCACTTTCTGCGC序列號(hào)15:5'-TCCGCAGTCGGATCCGGGTTAACCGCACAG序列號(hào)16:5'-GGGGAGCTCGCTAACTTAGCTTCTAAAGGCCATGTTTCC序列號(hào)17:5'-GCTCTAGATATCCGGGTCAATATCGCCGCAAC為了將作為選擇標(biāo)記的抗-壯觀霉素基因(GenBankX02588;Sp及)插入到pUC19-PTA12中，將含有抗-壯觀霉素基因(GenBankX02588)作為模板的質(zhì)粒pIC156(Steinmetz等人，142:79,1994)使用在序列號(hào)18和序列號(hào)19中闡明的引物進(jìn)行PCR，并且將得到的含有Sp及基因的PCR片段用五coRV酶切并引入到pUC19-PTA12中，從而構(gòu)建具有抗-壯觀霉素基因的pUC19-PTAlS2。將構(gòu)建的pUC19-PTAlS2用Sacl和5"mHI酶切并引入到上述構(gòu)建的pUC19-SacB中，從而構(gòu)建交換載體(pPTA-sacB)用于斷裂pto和(圖4)。序歹傳18:5'陽(yáng)GAATTCGAGCTCGCCCGGGGATCGATCCTC序列號(hào)19:5，-CCCGGGCCGACAGGCTTTGAAGCATGCAAATGTCAC實(shí)施例4:s"c"7ifWz;rtff/"cg附PALK菌株的構(gòu)建通過(guò)使用在實(shí)施例3中構(gòu)建的用于斷裂磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(內(nèi)a)基因和醋酸激酶(ac￡4)基因的交換載體pPTA-sacB斷裂Mwcc/"/";pro^ce";yLK基因組中的/7to和acyL4基因(圖4)。換言之，將在實(shí)施例2中構(gòu)建的Mwcc/m'";^o^cemLK接種于含有10g/L葡萄糖的LB-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中并在37。C下培養(yǎng)36小時(shí)。形成的菌落接種到10mlLB-葡萄糖液體培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)12小時(shí)。將已經(jīng)充分生長(zhǎng)的1%的培養(yǎng)液接種到100mlLB-葡萄糖液體培養(yǎng)基中并在搖床中以200rpm在37"C下培養(yǎng)。以與實(shí)施例2中描述的相同方式從得到的培養(yǎng)液中收集濃縮的細(xì)胞。將收集的濃縮細(xì)胞與在實(shí)施例3中構(gòu)建的基因交換載體pPTA-sacB混合，然后通過(guò)在2.5kV、50pF和200歐姆條件下電穿孔將pPTA-sacB引入到Mswcc/"/c/^o血ceraLK中。將800mlLB-葡萄糖液體培養(yǎng)基加入到引入了pPTA-sacB的菌株中，并在最高37°C下培養(yǎng)一個(gè)半小時(shí)。為了誘導(dǎo)雙交換，將培養(yǎng)液接種到含有抗生素壯觀霉素(終濃度為50pg/ml)的TSB-蔗糖固體培養(yǎng)基(含有100g/L蔗糖的TrypticSoyBroth(Becton,DickinsonandCompany)固體培養(yǎng)基)中，并在37°C下培養(yǎng)48小時(shí)或者更長(zhǎng)。為了選擇其中僅僅發(fā)生雙交換的菌落，將形成的菌落分別在含有50(ig/ml壯觀霉素的TSB蔗糖培養(yǎng)基和含有50pg/ml氨芐青霉素的TSB瓊脂培養(yǎng)基上劃線，并在37。C下培養(yǎng)12小時(shí)。然后，選擇在含有50ng/ml壯觀霉素的TSB蔗糖培養(yǎng)基上形成但不在含有50pg/ml氨芐青霉素的TSB培養(yǎng)基上形成的菌落并再次在含有50pg/ml壯觀霉素的TSB蔗糖培養(yǎng)基上劃線。使用含有壯觀霉素的培養(yǎng)基和氨芐青霉素的培養(yǎng)基再次篩選在這里形成的菌落，然后最終選擇顯示所要求的結(jié)果的菌落。分離的突變體基因組DNA作為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物電泳以確認(rèn)/M-ac^4基因的斷裂。為了確認(rèn)冉"-flcL4的斷裂，以下列方式進(jìn)行兩次PCR。首選，以突變體基因組DNA作為模板使用在下面的序列號(hào)20和序列號(hào)21中闡明的引物進(jìn)行PCR，然后將突變體基因組DNA作為模板使用在在下面的序列號(hào)22和序列號(hào)23中闡明的引物進(jìn)行PCR。序列號(hào)20:5，-CCTGCAGGCATGCAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTC(SP1)序列號(hào)21:5'-GCTGCCAAACAACCGAAAATACCGCAATAAACGGC(PAU1)序列號(hào)22:5，-GCATGTAACTTTACTGGATATAGCTAGAAAAGGCATCGGGGAG(SP2)序列號(hào)23:5，-GCAACGCGAGGGTCAATACCGAAGGATTTCGCCG(PAD2)將在兩種PCRs中得到的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，通過(guò)它們的大小確認(rèn)Wa-"c￡4的斷裂(圖6)。j^fl-flc;b4的斷裂通過(guò)下列事實(shí)確認(rèn)使用序列號(hào)20和序列號(hào)21(SP1引物和PAU1引物)得到的產(chǎn)物具有l(wèi).lkb的大小，同時(shí)使用序列號(hào)22和序列號(hào)23(SP2引物和PAD2引物)得到的產(chǎn)物的具有1.5kb的大小。每種引物的位置在圖5中顯示。通過(guò)如上述方法從7kf.wcc/m'";^oc/Mce朋LK的基因組中斷裂;to-flcL4構(gòu)建的突變菌株，即通過(guò)從M.jwcc/m'c/pro^ce似的基因組中斷裂W/l4,W"和acW得到的突變菌株被命名為"M.swcc/m'c/^o^cewPALK"并在2006年7月26日以保藏號(hào)"KCTC10973BP"保藏于作為國(guó)際保藏單位的韓國(guó)典型菌種保藏中心(KCTC;52,Eoeun-dong，Yuseong-gu，Daejeon-si，R印ublicofKorea),韓國(guó)生命科學(xué)與生物技術(shù)研究所。實(shí)施例5:使用AT.SMCci'/i/c/prtfd"cgA^PALK生產(chǎn)同質(zhì)琥珀酸將在實(shí)施例4中構(gòu)建的Mwcc/"/">7n^wce";yPALK(KCTC10973BP)接種于含有5g/L葡萄糖的10ml合成培養(yǎng)基中，并在厭氧條件下39°C培養(yǎng)8小時(shí)，然后再次將它們轉(zhuǎn)移到含5g/L葡萄糖的250ml合成培養(yǎng)基并在39。C下培養(yǎng)。此時(shí)將50ng/ml壯觀霉素加入到培養(yǎng)基中作為抗生素。將250mlMswc"'m'c/pro^ce";yPALK培養(yǎng)液接種到含有2.25L合成培養(yǎng)基(lg/LNaCl，2g/L(NH4)2HP04,0.02g/LCaCl2'2H20，0.2g/LMgCl2'6H20，8.709g/LK2HP04,0.5g/L半胱氨酸，0.5g/L甲硫氨酸，0.5g/L甘氨酸，0.5g/L天冬酰胺，0.5g/L天冬氨酸，0.5g/L脯氨酸(praline),0.5g/L絲氨酸，0.005g/L煙酸，0.005g/L泛酸鈣，0.005g/L維生素B6HC1，0.005g/L維生素Bl，0.005g/L維生素C，和0.005g/L生物素)的生物反應(yīng)器中，并在39。C下在第一葡萄糖濃度18.2g/L(100mM)，第—甘油濃度9.2g/L(100mM)條件下進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)使用氨水將培養(yǎng)物的pH調(diào)節(jié)到6.5，并將50ng/ml壯觀霉素加入到培養(yǎng)基中作為抗生素。為了高濃度生產(chǎn)琥珀酸，當(dāng)葡萄糖被完全耗盡時(shí)，通過(guò)加入濃縮的葡萄糖溶液將培養(yǎng)液的葡萄糖濃度調(diào)節(jié)到大約18.2g/L(100mM)。將M.wcc/"/";^o^ce似MBEL55E(KCTC0769BP)和產(chǎn)琥珀酸突變菌株Mwcc/"/c^wo^ce"sLPK7(KCTC10626BP)發(fā)酵，以上面描述的相同方式生產(chǎn)琥珀酸。培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度使用分光光度計(jì)測(cè)定，然后使用現(xiàn)有測(cè)定的分光光度計(jì)的光吸收和用于細(xì)胞干重的驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算。在發(fā)酵過(guò)程中，從生物反應(yīng)器中有規(guī)律地收集樣品。收集的樣品以13000rpm離心10分鐘，然后通過(guò)使用高效液相色譜將上清液用于分析有機(jī)酸、葡萄糖和甘油的濃度。結(jié)果，當(dāng)本發(fā)明的Mracc/"/":pro^ce附PALK(KCTC10973BP)與M認(rèn)c/"/c—MBEL55E(KCTC0769BP)禾口MjMcc/"/"j^oc/wce似LPK7(KCTC10626BP)相比時(shí)，比M.swcc/m'"》rodwce似MBEL55E(KCTC0769BP)禾口Mracc/w'c^oc^ce;wLPK7(KCTC10626BP)顯示了更高的琥珀酸產(chǎn)率同時(shí)更少產(chǎn)生或者不產(chǎn)生其他有機(jī)酸副產(chǎn)品(如圖7和表2中所示)。雖然檢測(cè)到了0.45g/L的醋酸和0.24g/L的丙酮酸,對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見的是這些量對(duì)于細(xì)菌生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)是產(chǎn)生的很少量的有機(jī)酸量，并且可以被忽略，因?yàn)榕c產(chǎn)生的琥珀酸相比它們產(chǎn)生的量不到其lwt%。表2Mwcc/"/"^o^ce似PALK(KCTC10973BP)的琥珀酸產(chǎn)率菌株MBEL55E(KCTC0769BP)LPK7(KCTC10626BP)PALK(KCTC10973BP)琥珀酸的終濃度(g/L)10.4913.4045.79葡萄糖消耗(g/L)22.5019.9853.00琥珀酸產(chǎn)率(琥珀酸g/葡萄糖g)0.470.670.86<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>工業(yè)實(shí)用性如同上面詳細(xì)描述的那樣，本發(fā)明提供了具有高生長(zhǎng)率的產(chǎn)琥珀酸的突變微生物，其在厭氧條件下培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生高濃度的琥珀酸同時(shí)很少產(chǎn)生或者不產(chǎn)生其他有機(jī)酸，并提供了使用突變微生物生產(chǎn)琥珀酸的方法。與現(xiàn)有的產(chǎn)琥珀酸菌株相比，本發(fā)明的突變微生物具有高生長(zhǎng)率和琥珀酸產(chǎn)率同時(shí)很少產(chǎn)生或者不產(chǎn)生有機(jī)酸的能力。因此，本發(fā)明的突變微生物對(duì)于生產(chǎn)琥珀酸的工業(yè)應(yīng)用來(lái)說(shuō)是有用的。雖然己經(jīng)參照特定特征對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見的是該描述僅僅用于優(yōu)選實(shí)施方式，而不是限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實(shí)際范圍將由所附的權(quán)利要求書及其等同物限定。序列表隨附電子版序列表。權(quán)利要求1、一種產(chǎn)生琥珀酸微生物中缺乏乳酸脫氫酶基因、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因和乙酸激酶基因而同時(shí)在產(chǎn)生琥珀酸微生物中僅供養(yǎng)蟻酸裂解酶基因的瘤胃細(xì)菌突變體，其具有在厭氧條件下僅僅高濃度產(chǎn)生琥珀酸同時(shí)很少產(chǎn)生或者不產(chǎn)生有機(jī)酸的特性。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的瘤胃細(xì)菌突變體，其特征在于，瘤胃細(xì)菌選自由Afo""/^'m/fl菌屬、放線桿菌屬和厭氧螺桿菌屬所組成的組。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的瘤胃細(xì)菌突變體，其特征在于，瘤胃細(xì)菌突變體為同質(zhì)發(fā)酵菌株，其僅僅產(chǎn)生琥珀酸同時(shí)很少或者不產(chǎn)生其他有機(jī)酸副產(chǎn)品。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的瘤胃細(xì)菌突變體，其特征在于，作為副產(chǎn)品產(chǎn)生的其他有機(jī)酸的量低于產(chǎn)生的琥珀酸的量的lwt%。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的瘤胃細(xì)菌突變體，其特征在于，有機(jī)酸是選自下組的一種或多種有機(jī)酸，上述組由乳酸、醋酸、蟻酸和丙酮酸所組成。6、一種在Mwcc/"/ci^o^ce似中缺乏乳酸脫氫酶基因、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因和乙酸激酶基因同時(shí)在M^cc/"/c^woJwce附中供養(yǎng)蟻酸裂解酶基因的瘤胃細(xì)菌突變體AfawwAeiw/aswcc/m'ci^odMce似PALK，其具有在厭氧條件下僅僅高濃度產(chǎn)生琥珀酸同時(shí)很少產(chǎn)生或者不產(chǎn)生有機(jī)酸的特性。7、一種生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的瘤胃細(xì)菌突變體的方法，所述方法包括下列步驟(a)使用同源重組法在琥珀酸產(chǎn)生瘤胃細(xì)菌基因組中通過(guò)使乳酸脫氫酶基因斷裂得到缺乏編碼乳酸脫氫酶基因的瘤胃細(xì)菌突變體；和(b)通過(guò)同源重組從缺乏編碼乳酸脫氫酶基因的瘤胃細(xì)菌突變體的基因組中使編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的基因和編碼乙酸激酶的基因斷裂得到缺乏編碼乳酸脫氫酶基因、編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的基因和編碼乙酸激酶的基因的瘤胃細(xì)菌突變體。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)瘤胃細(xì)菌突變體的方法，其特征在于，同源重組步驟(a)優(yōu)選使用含有斷裂的ldhA的基因交換載體進(jìn)行。9、根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)瘤胃細(xì)菌突變體的方法，其特征在于，同源重組步驟(b)優(yōu)選使用含有斷裂的pta-ackA的基因交換載體進(jìn)行。10、根據(jù)權(quán)利要求8所述的生產(chǎn)瘤胃細(xì)菌突變體的方法，其特征在于，含有斷裂的ldhA的基因交換載體為pMLKO-sacB。11、根據(jù)權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)瘤胃細(xì)菌突變體的方法，其特征在于，含有斷裂的pta-ackA的基因交換載體為pMPKO-sacB。12、一種生產(chǎn)琥珀酸的方法，所述方法包括下列步驟在厭氧條件下培養(yǎng)權(quán)利要求1-5中任意一個(gè)權(quán)利要求所述的瘤胃細(xì)菌突變體；并且從培養(yǎng)液中回收琥珀酸。13、根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，葡萄糖和甘油優(yōu)選被用作碳源用于培養(yǎng)。14、根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，作為副產(chǎn)品的其他有機(jī)酸的量小于所產(chǎn)生的琥珀酸的量的lwt%。15、一種制備琥珀酸的方法，所述方法包括下列步驟在厭氧條件下培養(yǎng)瘤胃細(xì)菌突變體Maw7/ze/m/aSMCc/m'c&rofi^cewsPALK;并且從培養(yǎng)液中回收琥珀酸。16、根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，葡萄糖和甘油優(yōu)選被用作碳源用于培養(yǎng)。17、根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，作為副產(chǎn)品的其他有機(jī)酸的量小于所產(chǎn)生的琥珀酸的量的lwt%。全文摘要本發(fā)明涉及一種產(chǎn)同質(zhì)琥珀酸的瘤胃細(xì)菌突變體以及使用這些瘤胃細(xì)菌突變體制備同質(zhì)琥珀酸的方法，具體涉及在厭氧條件下產(chǎn)生高濃度琥珀酸同時(shí)很少產(chǎn)生或者不產(chǎn)生其他有機(jī)酸的瘤胃細(xì)菌突變體，所述瘤胃細(xì)菌突變體通過(guò)使編碼乳酸脫氫酶(ldhA)的基因、編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(pta)的基因和編碼乙酸激酶(ackA)的基因斷裂而不使編碼丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)的基因斷裂而得到，還涉及使用這些瘤胃細(xì)菌突變體制備琥珀酸的方法。與現(xiàn)有的產(chǎn)琥珀酸菌株相比，本發(fā)明的瘤胃細(xì)菌突變體具有高生長(zhǎng)率和琥珀酸產(chǎn)率同時(shí)很少產(chǎn)生或者不產(chǎn)生有機(jī)酸的能力。因此，本發(fā)明的瘤胃細(xì)菌突變體對(duì)于生產(chǎn)琥珀酸的工業(yè)應(yīng)用來(lái)說(shuō)是有用的。文檔編號(hào)C12N1/21GK101636488SQ200780036066公開日2010年1月27日申請(qǐng)日期2007年7月25日優(yōu)先權(quán)日2006年7月28日發(fā)明者宋孝學(xué),李相燁,林成元申請(qǐng)人:韓國(guó)科學(xué)技術(shù)院