專利名稱：使用木糖利用發(fā)酵單胞菌屬的木糖醇合成突變體的乙醇生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域。更具體而言，發(fā)現(xiàn)使用木糖利用發(fā)酵單胞 菌屬(Zymomonas)菌株的乙醇生產(chǎn)由于木糖醇極大減少的生產(chǎn)而得到改善，所述菌株具有 葡萄糖_果糖氧化還原酶基因的遺傳修飾，所述木糖醇是在發(fā)酵期間合成的木糖代謝的有 害副產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
經(jīng)由微生物的乙醇生產(chǎn)提供了關(guān)于礦物燃料的代用能源且因此是本研究的重要 領(lǐng)域。運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)是在葡萄糖、果糖和蔗糖上生長的細(xì)菌產(chǎn)乙醇 生物(ethanologen)，經(jīng)由Entner-Douderoff途徑將這些糖代謝成CO2和乙醇。盡管野生 型菌株不能使用木糖作為碳源，但已人工改造了能夠在這種糖上生長的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的 重組菌株(US 5514583，US 5712133, WO 95/28476，F(xiàn)eldmann 等人(1992) Appl Microbiol Biotechnol 38 354-361，Zhang 等人(1995) Science 267 :240_243)。木糖是在水解的木素 纖維素材料中的主要戊糖，并且因此可以提供大量可用的、低成本碳底物用于在發(fā)酵中使 用。運(yùn)動發(fā)酵單胞菌已人工改造用于表達(dá)木糖代謝所需的4種酶1)木糖異構(gòu)酶，其催化 木糖至木酮糖的轉(zhuǎn)化；2)木酮糖激酶，其使木酮糖磷酸化以形成木酮糖5-磷酸；3)轉(zhuǎn)酮醇 酶；和 4)轉(zhuǎn)醛醇酶(US 5514583，US 6566107 ；Zhang 等人(1995) Science 267 :240_243)。 通過這4種酶和細(xì)胞的正常代謝機(jī)器的組合作用，將3個木糖分子轉(zhuǎn)化成2個葡萄糖6-磷 酸分子和1個甘油醛3-磷酸分子，其隨后在該途徑的葡萄糖側(cè)轉(zhuǎn)化成乙醇和C02(參見圖 1)。盡管在人工改造運(yùn)動發(fā)酵單胞菌菌株用于木糖代謝中已取得成功，但該菌株不 如在葡萄糖上一樣好地在木糖上生長且生產(chǎn)乙醇。引起在木糖上差的生長的一個因素是 作為木糖代謝的副產(chǎn)物的木糖醇生產(chǎn)(Feldmarm等人同上；Kim等人(2000) Applied and EnvironmentalMicrobiology 66:186-193)。木糖醇通過木酮糖激酶進(jìn)行磷酸化以生產(chǎn)木 糖醇5-磷酸，其在細(xì)胞中積聚且抑制細(xì)菌生長。木糖醇合成還減少乙醇的產(chǎn)量，因?yàn)檫\(yùn)動 發(fā)酵單胞菌的木糖利用重組菌株不能將木糖醇轉(zhuǎn)化成乙醇。此外，木糖醇是木糖異構(gòu)酶的 有力抑制劑(Smith等人(1991)BiOChem J. 277 :255_261)，其催化人工改造的木糖代謝途 徑中的木糖利用的第一個步驟。關(guān)于顯示木糖醇合成和作用的圖解參見圖2。負(fù)責(zé)體內(nèi)木糖醇合成的生理學(xué)途徑和酶仍未被確定。然而，已證實(shí)當(dāng)來自野 生型運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的無細(xì)胞提取物補(bǔ)充有NADPH時，它們能夠使木糖還原成木糖醇(Feldmann等人，同上)，并且這個反應(yīng)由NADPH依賴性醛糖還原酶催化。還已顯示無NADPH 補(bǔ)充的，運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的無細(xì)胞提取物能夠?qū)⑸倭磕咎寝D(zhuǎn)化成木糖醇，并且當(dāng)也向反應(yīng) 混合物中添加純化的木糖異構(gòu)酶時，在這些條件下的木糖醇生產(chǎn)增加3-4倍(Danielson， 2001，University of Colorado Masters Thesis)。因?yàn)槟咎钱悩?gòu)酶能夠?qū)⒛咎寝D(zhuǎn)化成木 酮糖，所以后一實(shí)驗(yàn)的明確暗示是運(yùn)動發(fā)酵單胞菌酶葡萄糖-果糖氧化還原酶(GFOR)可 以使用木糖作為電子供體和木酮糖作為電子受體以產(chǎn)生木糖醇，如在下文將更詳細(xì)地討論 的。因此，基于體外實(shí)驗(yàn)在運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中存在關(guān)于木糖醇生產(chǎn)的至少2種途徑，但它們 在生理?xiàng)l件下有助于木糖醇形成的程度有待確定。對于高水平的乙醇生產(chǎn)，運(yùn)動發(fā)酵單胞菌在高濃度的可發(fā)酵的碳源中生長，這可 以導(dǎo)致滲透壓休克。當(dāng)野生型菌株被轉(zhuǎn)移至包含> 200g/L葡萄糖或果糖或> 360g/L蔗 糖的液體培養(yǎng)基時，滲透壓休克自身表現(xiàn)為在生長開始前的長滯后期(Loos等人(1994)J Bacteriol 176 =7688-7693)。此外，當(dāng)野生型菌株被轉(zhuǎn)移至高濃度的這些糖時，向生長培養(yǎng) 基添加山梨糖醇縮短滯后期(Wiegert等人(1996) Arch Microbiol 166 :32-41，Loos等人 同上)。還已顯示，當(dāng)野生型運(yùn)動發(fā)酵單胞菌在葡萄糖和果糖的濃縮混合物(Loos等人同 上)中或者蔗糖的濃縮溶液(Wiegert等人同上，Loos等人同上)中生長時，周質(zhì)酶葡萄 糖-果糖氧化還原酶(GFOR)在滲透平衡中起重要作用。簡言之，如圖解I中所示，GFOR與 其緊密結(jié)合的輔因子在經(jīng)典乒乓Bi (Ping Pong Bi)機(jī)制中催化葡萄糖至葡糖酸內(nèi)酯的氧 化和果糖至山梨糖醇的后續(xù)還原。在周質(zhì)間隙中產(chǎn)生的山梨糖醇被逆著濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì) 胞內(nèi)，在其中它積聚至高水平，因?yàn)樗槐贿M(jìn)一步代謝。細(xì)胞內(nèi)高濃度的山梨糖醇消除了跨 越質(zhì)膜的滲透壓力差且恢復(fù)滲透平衡。不能產(chǎn)生山梨糖醇的野生型運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的自發(fā)突變體顯示，當(dāng)它在低濃度的 蔗糖上生長時(< 150g/L)，生產(chǎn)比野生細(xì)胞更高水平的乙醇，但這種菌株不能在高濃度的 蔗糖上生長(Kirk 和 Doelle (199 Biotechnol. Letters 15:985-990)。這種突變體隨后 顯示缺乏葡萄糖-果糖氧化還原酶(GFOR)的表達(dá)，這解釋了它不能將任何蔗糖衍生的果糖 轉(zhuǎn)化成不希望有的副產(chǎn)物山梨糖醇(Wiegert等人同上)。還已顯示山梨糖醇缺陷突變體在 高濃度的蔗糖中的生長可以通過向生長培養(yǎng)基添加山梨糖醇得到恢復(fù)(Wiegert等人，同 上)。因此當(dāng)運(yùn)動發(fā)酵單胞菌在葡萄糖和果糖的濃縮混合物中或者高濃度的蔗糖中生長時， GFOR通過合成山梨糖醇在滲透平衡中起關(guān)鍵作用，所述蔗糖通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化酶水解成 葡萄糖和果糖。
葡萄糖 + GFOR-NADP+ -^==It 葡糖酸內(nèi)酯 + GFOR-NADPH GFOR-NADPH + 果糖 ^~ 山梨糖醇 + GF0R-NADP+
I圖解ICN1600850(A)公開了具有滅活的GFOR基因的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的非木糖利用突變 株，以及使用這種菌株的乙醇生產(chǎn)。當(dāng)葡萄糖、果糖或蔗糖是碳源時，使用這種菌株的山梨 糖醇生產(chǎn)的缺乏導(dǎo)致更高水平的乙醇。
減少或消除運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的人工改造的木糖利用菌株中葡萄糖_果糖氧化還 原酶活性的作用未知，所述菌株在木糖和葡萄糖的混合物上生長(在不存在任何添加的蔗 糖或果糖的情況下)。待解決的問題是使用在包含木糖的培養(yǎng)基上生長的木糖利用運(yùn)動發(fā)酵單胞菌菌 株如何在發(fā)酵中生產(chǎn)增加量的乙醇。申請人已通過下述解決了該問題，確定關(guān)于在體內(nèi)木 糖醇生產(chǎn)的本質(zhì)途徑且通過基因失活消除負(fù)責(zé)其形成的酶活性，從而生成了可以用于改善 的乙醇生產(chǎn)的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌菌株。發(fā)明概述本發(fā)明涉及使用發(fā)酵單胞菌屬菌株用于乙醇生產(chǎn)的方法，當(dāng)在木糖的存在下生長 時，所述菌株具有減少的木糖醇生產(chǎn)和增加的乙醇生產(chǎn)。申請人已發(fā)現(xiàn)在木糖代謝運(yùn)動發(fā) 酵單胞菌中的木糖醇生產(chǎn)主要由葡萄糖-果糖氧化還原酶(GFOR)介導(dǎo)。構(gòu)建不表達(dá)GFOR 的遺傳修飾菌株(GF0R敲除突變體)，且發(fā)現(xiàn)其當(dāng)在包含木糖的糖混合物上生長時生產(chǎn)減 少量的木糖醇。當(dāng)在山梨糖醇的存在下在高糖混合物中生長時，GFOR敲除突變體還比表達(dá) GFOR的親本菌株消耗更多的木糖且生產(chǎn)更高濃度的乙醇。此外，乙醇產(chǎn)量(消耗的每克糖 生產(chǎn)的乙醇量)對于GFOR敲除菌株明顯更高。因此，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)乙醇的方法，其包括，a)提供能夠利用木糖以生產(chǎn)乙醇的重組發(fā)酵單胞菌屬菌株，所述菌株包含減少葡 萄糖_果糖氧化還原酶活性的至少一種遺傳修飾，和b)在包含木糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(a)的菌株，由此將木糖轉(zhuǎn)變成乙醇。上述方法提供了相對于不含至少一種遺傳修飾的重組發(fā)酵單胞菌屬菌株，木糖至 乙醇改善的轉(zhuǎn)化，所述遺傳修飾減少葡萄糖_果糖氧化還原酶活性。相對于不含至少一種遺傳修飾的重組發(fā)酵單胞菌屬菌株，該方法具體改善木糖轉(zhuǎn) 化成乙醇的參數(shù)比率、滴度或產(chǎn)量中的一種或多種，所述遺傳修飾減少葡萄糖-果糖氧化 還原酶活性。在本發(fā)明的一個方面，與不含至少一種遺傳修飾的發(fā)酵單胞菌屬菌株相比較，本 文描述的方法在上文(a)的菌株生產(chǎn)減少量的木糖醇或無木糖醇方面改善，所述遺傳修飾 減少葡萄糖_果糖氧化還原酶活性。附圖簡述、生物保藏和序列描述根據(jù)形成本申請的部分的下列詳細(xì)描述、圖和伴隨的序列描述，可以更充分地理 解本發(fā)明。

圖1顯示已用于人工改造運(yùn)動發(fā)酵單胞菌用于木糖利用的4種酶(有方框的)和 使用木糖用于乙醇生產(chǎn)的生物化學(xué)途徑的圖解。圖2顯示人工改造的木糖途徑的前2個步驟(有方框的)、木糖醇合成、木糖醇 5_磷酸形成(有毒的死端式中間物)和經(jīng)由木糖醇抑制木糖異構(gòu)酶的圖解。圖3顯示關(guān)于轉(zhuǎn)酮醇酶(A)、轉(zhuǎn)醛醇酶(B)、木糖異構(gòu)酶(C)和木酮糖激酶 (xyulokinase) (D)的酶測定的策略。圖 4 顯示 pMODPgaptaltktCm 的質(zhì)粒圖。
圖 5 顯示 pMODPgapxyIABCm 的質(zhì)粒圖。 圖6顯示在用PgapxylAB轉(zhuǎn)化的T2C、T3C、T4C和T5C系中木糖異構(gòu)酶(XI)和木酮糖激酶(XK)活性的圖表。圖7顯示在用I^gapxylAB轉(zhuǎn)化的T2C、T3C、T4C和T5C系中轉(zhuǎn)醛醇酶 (transaldolse) (TAL)和轉(zhuǎn)酮醇酶(TKT)活性的圖表。圖8顯示所選擇的適應(yīng)的木糖利用菌株菌落的理論乙醇產(chǎn)量％和木糖利用％的 圖表。圖9顯示在含5%葡萄糖的RM(RMG)中生長50代前和后適應(yīng)的木糖利用菌株在含 5%木糖的RM(豐富培養(yǎng)基)(RMX5% )上在70小時時的生長圖表。圖10顯示與對照8b相比較，關(guān)于所選擇的菌株ZW658在冊+10%葡萄糖 (RMG10% ) (A,B)和RM+8%木糖(RMX8% ) (C，D)中的生長、葡萄糖或木糖利用、以及乙醇和 木糖醇生產(chǎn)的圖表。圖11顯示與對照8b相比較，關(guān)于所選擇的菌株ZW658在不含乙酸鹽(A，B)或含 0.6%乙酸鹽(C，D)的RM+10%葡萄糖和8%木糖中的生長、葡萄糖和木糖利用、以及乙醇和 木糖醇生產(chǎn)的圖表。圖12顯示在用于GFOR基因的插入失活的自殺構(gòu)建體的構(gòu)建期間制備的質(zhì)粒的圖 和最終產(chǎn)物GF0RSp-9ffff。圖13顯示用于構(gòu)建木糖異構(gòu)酶表達(dá)質(zhì)粒pZB188/Kan-XylA制備的質(zhì)粒的圖，和用 于這種構(gòu)建體的大腸桿菌(E.coli)木糖異構(gòu)酶表達(dá)盒(有方框的)的圖解。圖14顯示在木糖異構(gòu)酶表達(dá)的存在和不存在下，通過含和不含GFOR基因失活的 Zffl菌株的木糖醇和木糖生產(chǎn)的圖表。圖15顯示在97g/L總木糖+葡萄糖上生長的，不含(A)和含(B)GFOR基因失活的 木糖利用運(yùn)動發(fā)酵單胞菌菌株的生長、葡萄糖和木糖利用以及乙醇生產(chǎn)的圖表。圖16顯示在188g/L總木糖+葡萄糖上生長的，不含(A)和含(B)GFOR基因失活 的木糖利用運(yùn)動發(fā)酵單胞菌菌株的生長、葡萄糖和木糖利用以及乙醇生產(chǎn)的圖表。圖17顯示在不同濃度的山梨糖醇的存在下，含GFOR基因失活的木糖利用運(yùn)動發(fā) 酵單胞菌菌株的生長圖表。圖18顯示在174g/L總木糖+葡萄糖中在乙酸鹽的不存在(A，B)和存在(C，D)下， 不含(A，C)和含(B，D) GFOR基因失活的木糖利用運(yùn)動發(fā)酵單胞菌菌株的木糖利用、乙醇生 產(chǎn)和木糖醇生產(chǎn)的圖表。圖19顯示在203g/L總木糖+葡萄糖中在乙酸鹽的不存在(A，B)和存在(C，D)下， 不含(A，C)和含(B，D) GFOR基因失活的木糖利用運(yùn)動發(fā)酵單胞菌菌株的木糖利用、乙醇生 產(chǎn)和木糖醇生產(chǎn)的圖表。圖20顯示在含另外的碳酸氫鉀(bicarbarbonate potassium)用于增加的緩沖能 力的203g/L總木糖+葡萄糖中在乙酸鹽的不存在(A，B)和存在(C，D)下，不含(A，C)和 含(B，D) GFOR基因失活的木糖利用運(yùn)動發(fā)酵單胞菌菌株的木糖利用、乙醇生產(chǎn)和木糖醇生 產(chǎn)的圖表。圖21顯示在pH受控的發(fā)酵運(yùn)行中在189g/L總木糖+葡萄糖中在乙酸鹽的存在 下，含GFOR基因失活的木糖利用運(yùn)動發(fā)酵單胞菌菌株的木糖和葡萄糖利用、乙醇生產(chǎn)和木 糖醇生產(chǎn)的圖表。圖22顯示可以在運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中復(fù)制的Cre表達(dá)載體，p^l88/Kan和pZB188/kan-Cre的質(zhì)粒圖。圖23A顯示ZW801-4和ZW800在含乙酸鹽的高葡萄糖+木糖中在pH受控條件下 的生長的比較。圖23B顯示與ZW800相比較，關(guān)于ZW801-4的葡萄糖和木糖利用以及乙醇 生產(chǎn)的圖表。圖24顯示在ZW801-4中翻譯的突變序列與野生型GFOR蛋白質(zhì)的比對。根據(jù)構(gòu)成本申請的部分的下列詳細(xì)描述和伴隨的序列描述，可以更充分地理解本 發(fā)明。下述序列符合 37 C. F. R. 1. 821-1. 825 ("Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules”)，且與 EPO 和 PCT 的世界知識產(chǎn)權(quán)組織(World Intellectual Property Organization) (WIPO)標(biāo)準(zhǔn) ST. 25 (1998)和序列表要求一致(Administrative Instructions的規(guī)則5. 2和49. 5(a_bis)以及部分208和附錄C)。用于核苷酸和氨基酸 序列數(shù)據(jù)的符號和形式遵守37 C. F. R. § 1. 822中描述的規(guī)則。序列表在光盤上并此提供。包含序列表的光盤的內(nèi)容遵照37 CFR1. 52(e)在此引 入作為參考。光盤一式兩份提交且彼此相同。盤標(biāo)記為“Copy I-Sequence Listing”和 "Copy 2 Sequence listing，，。盤包含下述文件CL3662 seq list. ST25。SEQ ID NOs :1和2是用于擴(kuò)增包含來自pZB4的甘油醛3_磷酸脫氫酶基因啟動 子(Pgap)的DNA片段的引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs 3和4是用于擴(kuò)增包含來自pZB4的tal編碼區(qū)的DNA片段的引物的 核苷酸序列。SEQ ID NOs 5和6是用于擴(kuò)增包含來自Pgap和tal片段的Pgaptal的DNA片段的 引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs 7和8是用于擴(kuò)增包含來自pZB186的IoxP: :Cm的DNA片段的引物 的核苷酸序列。SEQ ID NO 9是關(guān)于pM0DPgaptaltktCm質(zhì)粒的全核苷酸序列。SEQ ID NOs 10和11是用于擴(kuò)增在接受pM0DPgaptaltktCm的轉(zhuǎn)化體中包含tal和 tkt編碼區(qū)的3kb DNA片段的引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 12是關(guān)于pM0DPgapxyIABCm質(zhì)粒的全核苷酸序列。SEQ ID NOs 13 和 14 是用于擴(kuò)增來自含 pM0DPgapxyIABCm 的 T2C、T3C、T4C 和 T5C 整合體的1.6kb PgapxylA DNA片段的引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs 15 和 16 是用于擴(kuò)增來自含 pM0DPgapxyIABCm 的 T2C、T3C、T4C 和 T5C 整合體的1.3kb xylB DNA片段的引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs 17和18是用于擴(kuò)增來自運(yùn)動發(fā)酵單胞菌Wl基因組DNA的2268bp DNA frag的引物的核苷酸序列，所述DNA frag包含pgm基因的3'末端的部分、Idh基因 和adhl基因的5'末端的部分。SEQ ID NOs 19和20是用于擴(kuò)增來自pACYC184的四環(huán)素抗性盒的引物的核苷酸 序列。SEQ ID NOs 21和22是用于生成IoxP位點(diǎn)的寡核苷酸序列。SEQ ID NOs 23和24是用于生成IoxP位點(diǎn)的寡核苷酸序列。
SEQ ID NOs :25和沈是用于擴(kuò)增來自pHP15578的Speclr盒的引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs 27和28是用于擴(kuò)增來自ZWl基因組DNA的3，GFOR側(cè)翼DNA的引物 的核苷酸序列。SEQ ID NOs 29和30是用于擴(kuò)增來自ZWl基因組DNA的5，GFOR側(cè)翼DNA的引物 的核苷酸序列。SEQ ID NO :31 是 pGF0RSp-9ffff 質(zhì)粒的核苷酸序列。SEQ ID NOs 32和33是用于擴(kuò)增來自pET-24a的Kanr盒的引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 34是衍生自pZB4的大腸桿菌xylA表達(dá)盒的核苷酸序列。SEQ ID NOs 35和36是用于擴(kuò)增Cre表達(dá)盒的引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 37是ZW801-4中破壞的GFOR編碼區(qū)的全核苷酸序列(從原始起始密 碼子到原始終止密碼子)，SEQ ID NO :38是野生型GFOR編碼區(qū)的全核苷酸序列(從原始起 始密碼子到原始終止密碼子)。申請人:根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit ofMicro-organisms for the Purposes of Patent Procedure)的條款在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC) 10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209 進(jìn)行下述生物保藏
保藏者認(rèn)別參考符號國際保藏名稱_保藏曰期
ZW658ATCC # PTA-7858 2006 年 9 月 12 日詳述本發(fā)明描述了使用具有減少的GFOR酶活性的經(jīng)遺傳修飾的木糖利用發(fā)酵單胞菌 屬菌株用于從發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法。該方法中使用的木糖利用重組發(fā)酵單胞菌屬被用葡萄 糖-果糖氧化還原酶(GFOR)基因中的至少一種修飾進(jìn)一步人工改造，從而使得活性酶的表 達(dá)得到減少或消除。申請人顯示GFOR酶活性的消除導(dǎo)致在木糖代謝期間減少的木糖醇生 產(chǎn)和增強(qiáng)的乙醇生產(chǎn)。由新發(fā)酵單胞菌屬菌株產(chǎn)生的乙醇可以用作關(guān)于礦物燃料的代用能 源。下述縮寫和定義將用于解釋說明書和權(quán)利要求書。“葡萄糖-果糖氧化還原酶”被縮寫為GF0R。RM是豐富培養(yǎng)基。RMG5 % 是 RM+5 % 葡萄糖。RMG10% 是 RM+10% 葡萄糖。RMX8 % 是 RM+8 % 木糖。RMX2 % 是 RM+2 % 木糖。RMX5 % 是 RM+5 % 木糖。RMGX10% 8%是 RM+10%葡萄糖和 8%木糖。RMGX5% 8%是冊+5%葡萄糖和8%木糖?！盎颉敝副磉_(dá)特定蛋白質(zhì)的核酸片段，包括在編碼序列前(5'非編碼序列)和 后(3'非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列?！疤烊换颉被颉耙吧突颉敝溉缭谧匀唤缰信c其自身的調(diào)節(jié)序列一起發(fā)現(xiàn)的基因。“嵌合基因”指并非天然基因的任何基因，包含在自然界中未 一起發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)和編碼序列。因此，嵌合基因可以包含衍生自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼 序列，或衍生自相同來源但以不同于自然界中發(fā)現(xiàn)的那種的方式排列的調(diào)節(jié)序列和編碼序 列。“內(nèi)源基因”指在生物的基因組中處于其天然位置中的天然基因?！巴鈦怼被蛑冈谒?主生物中通常未發(fā)現(xiàn)但通過基因轉(zhuǎn)移引入宿主生物內(nèi)的基因。外來基因可以包含插入非天 然生物內(nèi)的天然基因或嵌合基因。術(shù)語“遺傳構(gòu)建體”指編碼用于表達(dá)一種或多種特定蛋白質(zhì)的核酸片段。在基因 構(gòu)建體中，基因在性質(zhì)中可以是天然的、嵌合的或外來的。一般地遺傳構(gòu)建體將包含“編碼 序列”?！熬幋a序列”指編碼特定氨基酸序列的DNA序列?！皢幼印被颉捌鹗伎刂茀^(qū)”指能夠控制編碼序列或功能RNA表達(dá)的DNA序列。一 般而言，編碼序列位于啟動子序列的3'。啟動子可以整體衍生自天然基因，或由衍生自在 自然界中發(fā)現(xiàn)的不同啟動子的不同元件組成，或甚至包含合成DNA區(qū)段。本領(lǐng)域技術(shù)人員 理解不同啟動子可以指導(dǎo)基因在不同組織或細(xì)胞類型中、或在不同發(fā)育階段、或響應(yīng)不同 環(huán)境條件的表達(dá)。引起基因在大多數(shù)細(xì)胞類型中在大多數(shù)時間表達(dá)的啟動子通常稱為“組 成型啟動子”。如本文所使用的，術(shù)語“表達(dá)”指衍生自基因的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和 穩(wěn)定積聚。表達(dá)還可以指mRNA翻譯成多肽。“反義抑制”指能夠抑制靶蛋白的表達(dá)的反義 RNA轉(zhuǎn)錄物的生產(chǎn)。“超表達(dá)”指在轉(zhuǎn)基因生物中超過正常或非轉(zhuǎn)化生物的生產(chǎn)水平的基因 產(chǎn)物的生產(chǎn)?！肮惨种啤敝改軌蛞种葡嗤蚧旧舷嗨频耐鈦砘騼?nèi)源基因表達(dá)的有義RNA轉(zhuǎn) 錄物的生產(chǎn)(U. S. 5，231，020)。如本文所使用的，術(shù)語“信使RNA (mRNA) ”指不含內(nèi)含子且能夠由細(xì)胞翻譯成蛋白 質(zhì)的RNA。如本文所使用的，術(shù)語“非功能性基因”指不像在其中基因是內(nèi)源的野生型菌株一 樣正常表達(dá)所編碼的蛋白質(zhì)的基因。非功能性基因的表達(dá)可以在任何水平上進(jìn)行破壞，例 如轉(zhuǎn)錄、RNA加工或翻譯。非功能性基因通常具有所編碼的蛋白質(zhì)的很少表達(dá)或無表達(dá)。然 而，它還可以編碼具有比野生型蛋白質(zhì)低的酶活性的經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)。如本文所使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主生物內(nèi)，從而導(dǎo)致遺傳上穩(wěn) 定的遺傳。經(jīng)轉(zhuǎn)移的核酸可以是維持在宿主細(xì)胞中的質(zhì)粒的形式，或一些經(jīng)轉(zhuǎn)移的核酸可 以整合到宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)。包含經(jīng)轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物被稱為“轉(zhuǎn)基因”或“重 組”或“經(jīng)轉(zhuǎn)化的”生物。如本文所使用的，術(shù)語“質(zhì)?！焙汀拜d體”指通常攜帶基因的染色體外元件，所述基 因并非細(xì)胞的中心代謝的部分，且通常為環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式。此種元件可以是自主 復(fù)制序列，基因組整合序列，噬菌體或核苷酸序列，線性或環(huán)狀，單鏈或雙鏈DNA或RNA，衍 生自任何來源，其中許多核苷酸序列已連接或重組成獨(dú)特的構(gòu)建體，其能夠?qū)㈥P(guān)于所選擇 的基因產(chǎn)物的啟動子片段和DNA序列連同合適的3'非翻譯序列引入細(xì)胞內(nèi)。術(shù)語“可操作地連接”指核酸序列在單個核酸片段上的結(jié)合，從而使得一種的功能 受另一種的影響。例如，當(dāng)啟動子序列能夠影響編碼序列的表達(dá)時(即，編碼序列在啟動子 的轉(zhuǎn)錄控制下)，所述啟動子與那種編碼序列可操作地連接。編碼序列可以以有義或反義方 向與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。
術(shù)語“選擇標(biāo)記”意指鑒定因子，通常是抗生素或化學(xué)抗性基因，其能夠基于標(biāo)記 基因的作用進(jìn)行選擇，即對于抗生素的抗性，其中所述作用用于追蹤目的核酸的遺傳和/ 或鑒定已遺傳目的核酸的細(xì)胞或生物。術(shù)語“基本上消除的”木糖醇生產(chǎn)和“基本上無”副產(chǎn)物木糖醇指其中使用一般的 實(shí)驗(yàn)室分析檢測出的木糖醇的量接近于零的情況。術(shù)語“高濃度的混合糖”指培養(yǎng)基中導(dǎo)致抑制GFOR突變木糖利用運(yùn)動發(fā)酵單胞菌 的生長的總糖濃度。這一般超過約100g/L，盡管確切濃度可能依賴于培養(yǎng)基中的其他組分 而變。術(shù)語“可發(fā)酵糖”指在發(fā)酵過程中可以由微生物用作碳源的寡糖和單糖。術(shù)語“木素纖維素的”指包含木素和纖維素的組合物。木素纖維素材料還可以包 含半纖維素。術(shù)語“纖維素的”指包含纖維素和另外組分包括半纖維素的組合物。術(shù)語“糖化作用，，指來自多糖的可發(fā)酵糖的生產(chǎn)。術(shù)語“預(yù)處理的生物質(zhì)”意指在糖化作用前已實(shí)施預(yù)處理的生物質(zhì)?！吧镔|(zhì)”指任何纖維素或木素纖維素材料且包括這樣的材料，其包含纖維素且任 選進(jìn)一步包含半纖維素、木素、淀粉、寡糖和/或單糖。生物質(zhì)還可以包含另外組分，例如 蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)。生物質(zhì)可以衍生自單一來源，或生物質(zhì)可以包含衍生自超過一種來源 的混合物；例如，生物質(zhì)可以包含玉米穗軸和玉米秸稈的混合物，或草和葉的混合物。生物 質(zhì)包括但不限于生物能農(nóng)作物、農(nóng)業(yè)廢物、城市固體廢物、工業(yè)固體廢物、來自紙制造的淤 渣、院子廢物、木材和林業(yè)廢物。生物質(zhì)的例子包括但不限于玉米粒，玉米穗軸，農(nóng)作物殘?jiān)?例如玉米殼，玉米秸稈，草，小麥，小麥秸稈，大麥，大麥秸稈，干草，稻草，柳枝稷，廢紙，甘蔗 渣，高粱，大豆，得自谷粒、樹、枝、根、葉、木片、鋸屑、灌木和矮樹叢的碾磨的組分，蔬菜，水 果，花和牲畜糞。“生物質(zhì)水解產(chǎn)物”指起因于生物質(zhì)的糖化作用的產(chǎn)物。生物質(zhì)還可以在糖化作用 前進(jìn)行預(yù)處理。本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的且由下述參 考文獻(xiàn)進(jìn)行描述Sambrook, J.，F(xiàn)ritsch, E. F.禾口 Maniatis, T. Molecular Cloning A Laboratory Manual，第 2 片反；Cold Spring HarborLaboratory :Cold Spring Harbor， New York，1989(下文為 “Maniatis”)；以及 Silhavy，T. J.，Bennan，M. L 和 Enquist， L. W. Experiments with GeneFusions ；Cold Spring Harbor Laboratory :Cold Spring Harbor，New York，1984 ；禾口 Ausubel，F(xiàn). Μ.等人，In Current Protocols in Molecular Biology，由 Greene Publishing and Wiley-Interscience，1987 出片反。本發(fā)明涉及使用木糖利用發(fā)酵單胞菌屬的GFOR突變體用于從包含木糖的培養(yǎng)基 生產(chǎn)乙醇的方法。具有減少的GFOR酶活性的木糖利用發(fā)酵單胞菌屬的人工改造菌株具有 增強(qiáng)的乙醇生產(chǎn)。關(guān)于經(jīng)由木糖利用運(yùn)動發(fā)酵單胞菌改善乙醇生產(chǎn)的挑戰(zhàn)是減少或消除 木糖醇的合成，其(a)代表無價值添加的碳槽(sink) ； (b)抑制木糖利用的第一個步驟；和 (c)磷酸化為抑制細(xì)菌生長的有毒的死端式中間物。申請人已發(fā)現(xiàn)內(nèi)源酶GFOR主要負(fù)責(zé)體 內(nèi)木糖醇合成，并且通過減少或消除GFOR酶活性，改善來自木糖的乙醇生產(chǎn)(比率、產(chǎn)量和 滴度)。
木糖利用發(fā)酵單胞菌屬宿主菌株能夠利用木糖作為碳源的發(fā)酵單胞菌屬的任何菌株都可以用作用于制備在本方 法中使用的菌株的宿主。已人工改造用于木糖發(fā)酵成乙醇的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的菌株是特別 有用的。內(nèi)源基因可以提供代謝途徑的部分，或可以通過任何已知的基因操作技術(shù)加以改 變，以提供具有對于木糖代謝有用的酶活性的蛋白質(zhì)。例如，內(nèi)源轉(zhuǎn)酮醇酶可以補(bǔ)充在生 成木糖利用途徑中其他引入的酶活性。一般地4種基因已引入運(yùn)動發(fā)酵單胞菌內(nèi)用于表 達(dá)涉及木糖代謝的4種酶(圖1)，如US 5514583中描述的，所述專利在本文中引入作為參 考。這些包括編碼木糖異構(gòu)酶(其催化木糖至木酮糖的轉(zhuǎn)化)和木酮糖激酶(其使木酮 糖磷酸化以形成木酮糖5-磷酸)的基因。此外，轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶，戊糖磷酸途徑的2 種酶，將木酮糖5-磷酸轉(zhuǎn)化成中間物，所述中間物使戊糖代謝與糖酵解Entner-Douderoff 途徑偶聯(lián)，從而允許木糖至乙醇的代謝。編碼這些酶的DNA序列可以得自能夠代謝木糖 的眾多微生物中的任何一種，例如腸細(xì)菌，以及一些酵母和真菌。關(guān)于編碼區(qū)的來源包括 黃單胞菌屬(Xanthomonas)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、埃希氏菌屬(Escherichia)^l 細(xì)菌屬(Rhodobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、醋桿菌屬(Acetobacter) >^fHff lif 屬(Gluconobacter) > IH^g ^M (Rhizobium)、木干胃M (Agrobacterium) > fp Π K^M (Salmonella)、假單胞菌屬(Pseudomonads)和發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)。特別有用的是 大腸桿菌的編碼區(qū)。編碼DNA序列與在運(yùn)動發(fā)酵單胞菌細(xì)胞中表達(dá)的啟動子可操作地連接，所述啟動 子例如運(yùn)動發(fā)酵單胞菌甘油醛3-磷酸脫氫酶的啟動子(GAP啟動子)，和運(yùn)動發(fā)酵單胞菌烯 醇化酶的啟動子(ENO啟動子)。編碼區(qū)可以單獨(dú)由啟動子進(jìn)行表達(dá)，或者2個或更多編碼 區(qū)可以在操縱子中進(jìn)行連接由相同啟動子表達(dá)。所得到的嵌合基因可以引入發(fā)酵單胞菌屬 內(nèi)且在質(zhì)粒上維持，或使用例如同源重組、位點(diǎn)定向整合或隨機(jī)整合而整合到基因組內(nèi)。特 別有用的木糖利用菌株包括 CP4 (pZB5) (US5514583)，ATCC31821/pZB5 (US 6566107)，8b (US 20030162271 ；Mohagheghi 等人，(2004) Biotechnol. Lett. 25 ；321-325)和 ZW658 (本文描 述的；保藏的，ATTCC#PTA-7858)。另外人工改造以利用并非其天然使用的除木糖外的糖的發(fā)酵單胞菌屬菌株可以 在本方法中使用。例子是如US 5843760中描述的經(jīng)人工改造用于阿拉伯糖利用的運(yùn)動發(fā) 酵單胞菌的菌株，所述專利引入本文作為參考。經(jīng)由GFOR的木糖醇合成的發(fā)現(xiàn)經(jīng)由運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的木糖利用菌株的不希望有的副產(chǎn)物木糖醇的合成減少了 乙醇的產(chǎn)量，且導(dǎo)致木糖醇5-磷酸的形成，所述木糖醇5-磷酸是抑制細(xì)菌生長的有毒的化 合物(參見圖2)。此外，木糖醇是木糖異構(gòu)酶的有力抑制劑，所述木糖異構(gòu)酶是用于木糖利 用的人工改造途徑中的第一種酶，并且所述木糖醇的合成減少了細(xì)胞代謝木糖的能力。盡 管體外實(shí)驗(yàn)已確定存在關(guān)于運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中的木糖醇形成的至少2種途徑(Feldmarm等 人同上，Danielson等人同上)，但申請人已發(fā)現(xiàn)生理學(xué)產(chǎn)生的大多數(shù)木糖醇是GFOR酶活 性的結(jié)果。申請人已發(fā)現(xiàn)由在包含木糖的培養(yǎng)基上生長的利用木糖的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌菌株 (或野生型運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的木酮糖合成衍生物)合成的木糖醇的量在不存在GFOR酶活性 的情況下極大地減少。申請人還發(fā)現(xiàn)木糖至木酮糖的轉(zhuǎn)化是關(guān)于體內(nèi)GFOR介導(dǎo)的木糖醇 生產(chǎn)的必要條件，并且這種反應(yīng)僅可在表達(dá)木糖異構(gòu)酶的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌菌株中發(fā)生。因此提出經(jīng)人工改造以在木糖上生長的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌菌株中木糖醇的主要生理學(xué)來源經(jīng) 由反應(yīng)之一或兩者由GFOR合成，所述反應(yīng)在圖解II和III中描述。
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)乙醇的方法，其包括，a)提供能夠利用木糖以生產(chǎn)乙醇的重組發(fā)酵單胞菌屬菌株，所述菌株包含減少葡萄 糖-果糖氧化還原酶活性的至少一種遺傳修飾，和b)在包含木糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(a)的菌株，由此將所述木糖轉(zhuǎn)化成乙醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中相對于不含至少一種遺傳修飾的重組發(fā)酵單胞菌屬菌 株，所述(a)的菌株改善木糖至乙醇的轉(zhuǎn)化，所述遺傳修飾減少葡萄糖-果糖氧化還原酶活 性。
3.權(quán)利要求2的方法，其中相對于不含至少一種遺傳修飾的重組發(fā)酵單胞菌屬菌株， 所述(a)的菌株改善木糖轉(zhuǎn)化成乙醇的比率、滴度或產(chǎn)量中的一種或多種，所述遺傳修飾 減少葡萄糖-果糖氧化還原酶活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中與不含至少一種遺傳修飾的發(fā)酵單胞菌屬菌株相比 較，當(dāng)將木糖代謝成乙醇時，所述(a)的菌株生產(chǎn)減少量的木糖醇，所述遺傳修飾減少葡萄 糖-果糖氧化還原酶活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中當(dāng)將木糖代謝成乙醇時，所述(a)的菌株基本上不生產(chǎn) 木糖醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述(a)的重組發(fā)酵單胞菌屬菌株選自ZW800、 ZW801-4 和 ZW801-6。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基包含糖的混合物和糖醇，所述糖包括木糖，所述 糖醇選自山梨糖醇、甘露糖醇、半乳糖醇、核糖醇及其混合物，其中所述糖的混合物的濃度 是至少約120g/L，并且其中所述糖醇的終濃度是約2mM-約100mM。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述糖醇的濃度是約5mM-約20mM。
全文摘要
本發(fā)現(xiàn)使用具有葡萄糖-果糖氧化還原酶基因的遺傳修飾的木糖利用發(fā)酵單胞菌屬菌株的乙醇生產(chǎn)由于極大減少的木糖醇生產(chǎn)而得到改善，所述木糖醇是在發(fā)酵期間合成的木糖代謝的有害副產(chǎn)物。
文檔編號C12N1/22GK102124117SQ200780035804
公開日2011年7月13日 申請日期2007年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月28日
發(fā)明者C·M·麥卡欽, M·安普塔奇, M·張, P·G·凱米, P·V·維塔寧, Y·-C·仇 申請人:可持續(xù)能源聯(lián)盟有限責(zé)任公司, 納幕爾杜邦公司