專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于酶促水解經(jīng)預(yù)處理之木素纖維素原料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及酶混合物。還提供了酶促水解木素纖維素原料的方法，特別是酶促水解經(jīng)預(yù)處理之木素纖維素原料的方法。
背景技術(shù)：
：當(dāng)前，燃料乙醇由原料如玉米淀粉、甘蔗和糖用甜菜來(lái)生產(chǎn)。然而，源，因此利用這些原料生產(chǎn)乙醇的潛力;l一有限的。另外，由于轉(zhuǎn)化過(guò)程中使用化石燃料，因而從這些原料生產(chǎn)乙醇會(huì)排放出大量的溫室氣體。近年來(lái)，利用含有纖維素的原料(例如農(nóng)業(yè)殘余物(agriculturalresidue)、草和林業(yè)殘余物(forestryresidue))生產(chǎn)乙醇已受到廣泛關(guān)注。究其原因是這些原料來(lái)源廣泛且價(jià)格低廉，并且使用這些原料生產(chǎn)乙醇為焚燒或掩埋木素纖維素廢棄物提供了替代方案。此外，所述原料中的一部分~~木質(zhì)素——可用作燃料來(lái)為該方法提供能量，而無(wú)需使用化石燃料。若干研究已表明，當(dāng)考慮到整個(gè)生產(chǎn)和消費(fèi)循環(huán)時(shí)，使用從纖維素生產(chǎn)的乙醇所產(chǎn)生的溫室氣體近乎為零。可用于生產(chǎn)乙醇的最有前景的木素纖維素原料(lignocellulosicfeedstock)包括(1)農(nóng)業(yè)殘余物，例如玉米秸稈、麥秸、大麥秸稈、燕麥秸稈、稻秸、油菜稈和大豆秸稈；(2)草類(lèi)，例如柳枝稷(switchgrass)、芒屬植物(miscanthus)、米草(cordgrass)和草，(reedcanarygrass);(3)纖維加工殘余物，例如玉米纖維、甜菜渣(beetpulp)、紙漿廠細(xì)小纖維(fines)和廢棄物以及甘蔗渣；(4)林業(yè)廢棄物，例如山楊木、其他硬木、M和鋸屑；以及(5)消費(fèi)后的廢棄紙產(chǎn)品。將木素纖維素原料轉(zhuǎn)化成乙醇的最重要工藝步驟包括將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，隨后通itiL酵將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇。實(shí)現(xiàn)該工藝步驟的兩個(gè)主要方法是酸水解，其包括使用一步酸處理來(lái)水解原料；酶促水解，其包括用酸進(jìn)行預(yù)處理以及隨后的纖維素酶水解。在酸水解過(guò)程中，通常在足以使纖維素7jC解為葡萄糖以及使半纖維素水解為木糖和阿拉伯糖的溫度、酸濃度和時(shí)間長(zhǎng)度下用蒸汽和硫酸處理原料。所述酸可以是濃的(25-80%重量/重量)或者稀的(3-8%重量/重量)。然后使用酵母將葡萄糖發(fā)酵生成乙醇，回收乙醇并通過(guò)蒸餾對(duì)其進(jìn)行純化。任選地，可將葡萄糖發(fā)酵為乳酸、丁醇或另一些產(chǎn)物。在酶促水解過(guò)程中，選擇反應(yīng)條件以使纖維性原料被轉(zhuǎn)化為泥狀物(muddytexture)因而使纖維素表面積顯著增加，而纖維素極少轉(zhuǎn)化為葡萄糖。然后，在隨后的步驟中使用纖維素酶將經(jīng)預(yù)處理的纖維素水解為葡萄糖。在該情形中，蒸汽和/或者酸處理被稱(chēng)為"預(yù)處理"。然后，可將葡萄糖發(fā)酵為乙醇、乳酸、丁醇或另一些產(chǎn)物。在加入酶之前，將所述酸性原料的pH調(diào)整至適于進(jìn)行酶促水解反應(yīng)的值。通常，這包括添加堿使pH為約4至約6(其為多種纖維素酶的最適pH范圍)，而當(dāng)4吏用嗜堿纖維素酶時(shí)該pH值可以更高。在一種類(lèi)型的預(yù)處理工藝中,通ii^炸減壓(explosivedecompression)使蒸汽產(chǎn)生的壓力迅速下降，其稱(chēng)為"蒸汽爆炸(steamexplosion)"。Foody(美國(guó)專(zhuān)利No.4,461,648)描述了用于蒸汽爆炸預(yù)處理的裝置和條件。使用硫酸在pH0.4~2.0下進(jìn)行蒸汽爆炸所產(chǎn)生的預(yù)處理材料質(zhì)地均一，并且與其他預(yù)處理方法相比需要較少的纖維素酶來(lái)7jC解纖維素。纖維素酶催化原料中的纖維素水解(P-l,4-D-葡聚糖鍵水解)成葡萄糖、纖維二糖以及另一些纖維寡糖。纖維素酶是多酶混合物的通稱(chēng)，其包括外部作用的纖維二糖水解酶(CBH)、葡聚糖內(nèi)切酶(EG)和P-葡萄糖苷酶(PG)，這些酶可由多種植物和微生物產(chǎn)生。里氏木霉(7Wc/^flfei7iffl^ew/)的纖維素酶中包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的酶包括CBH1(更常稱(chēng)為Cel7A)、CBH2(Cd6A)、EGl(Cel7B)、EG2(Cel5)、EG4(Cel61A)、EG5(Cel45A)、EG6(Cel74A)、Cipl、Cip2、乙酰木聚糖酯酶、卩-甘露聚糖酶和纖維素膨脹因子(swollenin)。EG3(Cel12)則是不含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的纖維素分解酶的例子。纖維素酶協(xié)同作用將纖維素水解為葡萄糖。CBH1和CBH2作用于纖維素^目對(duì)的末端以釋放纖維二糖(Barr等，1996),而葡彩瞎內(nèi)切酶則作用于纖維素的內(nèi)部位點(diǎn)。這些酶的主要產(chǎn)物是纖維二糖，其被P-葡萄糖苷酵進(jìn)一步水解成葡萄糖。已知大多數(shù)CBH和EG通過(guò)其碳7JC化合物結(jié)合模塊(CBM)(如纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD))與原料中的纖維素結(jié)合，而大多數(shù)p-葡萄糖苷酶(包括木霉屬(7Wc/io&r附fl)和曲霉屬(Js/^^i7/ws)的J3-葡萄糖香酶)不含有這樣的結(jié)合模塊并因此在水解過(guò)程中保留在溶液中。纖維素酶可能含有連接催化結(jié)構(gòu)域與碳水化合物結(jié)合模塊的接頭區(qū)域。認(rèn)為該接頭區(qū)域有利于催化活性結(jié)構(gòu)域發(fā)揮活性。纖維素酶酶促水解不溶性纖維素底物的動(dòng)力學(xué)不遵循簡(jiǎn)單的米氏規(guī)律(Michaelis-Mentenbehaviour)(Zhang等，1999)。具體而言，在給定時(shí)間內(nèi)，葡萄糖的產(chǎn)量不隨著7jC解反應(yīng)中纖維素酶劑量的增加而呈線性增加。并且，隨著纖維素7jC解的進(jìn)行，反應(yīng)速率顯著下降(Tolan，2002)。已提出有關(guān)反應(yīng)速率下降的若干種解釋。最主要的假說(shuō)包括產(chǎn)物抑制、在水解過(guò)程中底物的頑拗性(recalcitrance)提高以及酶失活。在纖維素乙醇的生產(chǎn)中，纖維素酶作用的動(dòng)力學(xué)4吏得酶促水解經(jīng)預(yù)處理之材料成為低效步驟。通過(guò)提高纖維素酶的生產(chǎn)或活性以降低酶促水解相關(guān)的成本已被認(rèn)為是節(jié)省成本的主要契機(jī)(Sheehan，1999)。最近，來(lái)自由美國(guó)能源部資助的纖維素乙醇工廠的才艮告估計(jì)，與從淀粉生產(chǎn)乙醇所需的酶相比，生產(chǎn)纖維素乙醇用酶的成本要高出10~25倍(Houghton,2006)。已有幾種方法用來(lái)提高纖維素酶混合物的活性。提高由微生物(其還分泌混合纖維素酶)產(chǎn)生的P-葡萄糖普酶的量可減輕由纖維二糖引起的產(chǎn)物抑制(美國(guó)專(zhuān)利No.6，015，703)。還可使用合理設(shè)計(jì)或隨機(jī)誘變技術(shù)來(lái)調(diào)節(jié)各種酶的活性，如產(chǎn)生了熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的CBH1變體所證明的那樣(WO2005/0277172)。研究基因多樣性的另一種替代方法是直接從多個(gè)纖維素分解性物種(cellulolyticspecies)中尋找酶同源物。4吏用該方法已得到了CBH1(WO2004/0197890)和CBH2(WO2006/0053514)。還已得到將內(nèi)切和外切纖維素分解酶的互補(bǔ)活性進(jìn)行組合的融合蛋白(WO2006/00057672)。纖維素分解酶的模塊式結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)允許構(gòu)建包含催化結(jié)構(gòu)域的酶。CBD的缺失顯著影響這些酶與底物的結(jié)合以及活性(WO2004/0053373，WO2006/0008885)。已創(chuàng)建出經(jīng)遺傳^Lit的包^化活性結(jié)構(gòu)域、接頭區(qū)域和CBD之新組合的纖維素水解酶(美國(guó)專(zhuān)利No.5,763,254)。所有上述方法盡管針對(duì)纖維素酶促水解的不同方面，但是卻沒(méi)有將纖維素酶的活性提高到足以克服纖維素7JC解用酶成本高之問(wèn)題的程度。這些策略的一個(gè)缺點(diǎn)是一次僅關(guān)注于單一種酶，而忽視了可能的與其他纖維素分解酶的協(xié)同作用。因此，提高纖維素酶系統(tǒng)活性的更好方法是致力于使包含多于一種纖維素酶組分的混合物的活性最大化。已有報(bào)道稱(chēng)，內(nèi)切和外切纖維素酶之組合的纖維素7jC解效率要遠(yuǎn)高于這些酶單獨(dú)作用時(shí)的活性總和(W00d和McCrae,1979)。先前的研究已通過(guò)觀察二元或三元混合物的行為來(lái)測(cè)量里氏木霉的纖維素分解酶之間的協(xié)同作用(例如，Nidetsky等，1994)。例如，Wood等人(1989)研究了嗜松青霉(/V",'c,7/,"附/;/wo/7似/"附)的纖維二糖水解酶和葡聚糖內(nèi)切酶的二元、三元和七元混合物。然而，在青霉菌酶的二元混合物中未觀察到協(xié)同性。還對(duì)來(lái)自細(xì)菌T7^riif^訴rf"/"sai的3種酶(其中兩種來(lái)自與包含主要木霉屬酶的家族同樣的家族)的二元混合物的協(xié)同性進(jìn)行了表征(Jeoh，2006)。然而，尚未有關(guān)于性能提高的報(bào)道。已數(shù)次嘗試針對(duì)給定的酶劑量(所述酶劑量是水解給定質(zhì)量的纖維素所需的酶質(zhì)量)研發(fā)使纖維素水解量最大化的CBH和EG混合。例如，已報(bào)道了包含細(xì)菌(主要來(lái)自7:/"sai)的混合來(lái)源的纖維素酶之優(yōu)化混合物(Irwin,1993;Walker等，1993;Kim等，1998)。這些研究中也包括木霉屬的CBH1和CBH2，然而細(xì)菌不能產(chǎn)生纖維素酶家族7的成員，因此EG1不包括在這些混合物中。Baker等人(1998)曾嘗試測(cè)定木霉屬CBH1、CBH2和EG1的優(yōu)化混合物，但他們的實(shí)驗(yàn)中未包含EG2。在Baker等人的研究中，底物為Sigmacdl(—種微晶纖維素制品)。Boisset等人(2001)以細(xì)菌纖維素為底物對(duì)來(lái)自特異腐質(zhì)霉(Hw附/c"/fl/im^附)的CBH1、CBH2和EG5的三元混合物進(jìn)行優(yōu)化。然而，這些研究均未成功開(kāi)發(fā)出對(duì)預(yù)處理木素纖維素生物質(zhì)之水解性能提高的纖維素酶混合物。因此，盡管已進(jìn)行了許多研究，仍需要對(duì)預(yù)處理木素纖維素原料中的纖維素之水解性能提高的纖維素酶混合物。缺乏這樣的酶混合物極大阻礙了將纖維素轉(zhuǎn)化為可溶性糖(包括用于乙醇和另一些產(chǎn)品生產(chǎn)的葡萄糖)的商業(yè)化。發(fā)明概述本發(fā)明涉及酶混合物。還提供了酶促水解木素纖維素原料的方法，特別是酶促水解經(jīng)預(yù)處理之木素纖維素原料的方法。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供酶促水解經(jīng)預(yù)處理之木素纖維素原料的改進(jìn)方法。特別地，本發(fā)明提供了使用四種主要纖維素酶(CBH1、CBH2、EG1和EG2)的組合來(lái)提高將經(jīng)預(yù)處理之木素纖維素原料轉(zhuǎn)化為可溶性糖。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了將經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素原料酶促水解為可溶性糖的方法，所述酶促水解包括將纖維素酶混合物添加至經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素原料中，所述纖維素酶混合物包含纖維二糖水解酶CBH1和CBH2以及葡聚糖內(nèi)切酶EG1和EG2的主要纖維素酶混合物，其中纖維二糖7JC解酶CBH1和CBH2以高于或等于55%且低于85%存在于主要纖維素酶混合物中，并且CBH2以相對(duì)于纖維二糖水解酶CBH1和CBH2的一個(gè)分?jǐn)?shù)而存在(定義為fC2)，EG2以相對(duì)于葡聚糖內(nèi)切酶EG1和EG2的一個(gè)分?jǐn)?shù)而存在(定義為fE2)，其中當(dāng)纖維二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于55%且低于65%存在于主要纖維素酶中時(shí)，fc2和fE2的值涵蓋在圖3A的區(qū)域1內(nèi)；當(dāng)纖維二糖7jC解酶CBH1和CBH2以高于或等于65%且低于75%存在于主要纖維素酶中時(shí)，&2和&2的值涵蓋在圖3B的區(qū)域1、2和3內(nèi)；當(dāng)纖維二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于75%且低于85%存在于主要纖維素酶中時(shí)，&2和&2的值涵蓋在圖3C的區(qū)域1、2和3內(nèi)。本發(fā)明的另一方面提供了以上定義的纖維素酶混合物。優(yōu)選地，纖維二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于65%且低于85%存在于主要纖維素酶中。當(dāng)所述纖維二糖7jC解酶CBH1和CBH2以65%~75%存在于主要纖維素酶中時(shí)，所述fc2和所述fE2的值均優(yōu)選在圖3B的區(qū)域2和3內(nèi)。優(yōu)選地，fc2和fE2的值均在圖3B的區(qū)域3內(nèi)。當(dāng)纖維二糖7jC解酶CBH1和CBH2以75%~85%存在于主要纖維素酶中時(shí)，fC2和fE2的值優(yōu)選在圖3C的區(qū)域2和3內(nèi)。優(yōu)選地，&2和&2的值均在圖3C的區(qū)域3內(nèi)。本發(fā)明還涉及上述發(fā)明的任何上述方面，其中所述主要纖維素酶來(lái)主要纖維素酶的序列可來(lái)自子嚢菌(澮CO附J^"或擔(dān)子菌(5w/力Viiy;ce&)。優(yōu)選地，所述主要纖維素酶來(lái)自木霉屬(7Wc/rf^er挑flssp.)、曲霉屬(Js/7^g/〃i/sssp.)、肉座菌屬(^fy/wcfe"ssp.)或腐質(zhì)霉屬(^Mm/"/assp.)。更優(yōu)選地，編碼所述主要纖維素酶的序列來(lái)自里氏木霉。本發(fā)明還涉及上述發(fā)明的任何上述方面，其中所述主要纖維素酶獲得自表達(dá)內(nèi)源性編碼序列的生物?；蛘撸鲋饕w維素酶獲得自表達(dá)異源性編碼序列的生物。優(yōu)選地，所述主要纖維素酶來(lái)自里氏木霉。優(yōu)選地,所述酶促水解將經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素原料中至少約80%的纖維素轉(zhuǎn)化為可溶性糖?？扇苄蕴强烧蘴酵為乙醇、乳酸、丁醇或其組合。優(yōu)選使用含有P-葡萄糖苷酶和里氏木霉分泌組(secretome)的纖維素酶進(jìn)行酶促水解。本發(fā)明所包括的主要纖維素酶混合物與現(xiàn)有技術(shù)中所述的那些相比表現(xiàn)出顯著更高的活性。結(jié)果顯示，本發(fā)明中纖維素酶混合物比現(xiàn)有的纖維素酶混合物更強(qiáng)或更有活性，其高出約10%~約50%(或其間任意量)；或者約10%~約25%(或其間任意量)；或者約10%~約15%(或其間任意量)。"纖維素-乙醇技術(shù)"的經(jīng)濟(jì)可行性受到纖維素酶成本的制約。通過(guò)提供具有更高活性的酶，本發(fā)明的纖維素酶使得該方法更加經(jīng)濟(jì)，并Jbf目比于現(xiàn)有技術(shù)有顯著進(jìn)步。該發(fā)明概述不必然描述了本發(fā)明的所有特征。圖1包括經(jīng)純化的主要纖維素酶組分的SDS-PAGE和Western印跡分析。圖1A顯示SDS-PAGE之后經(jīng)純化的CBH1、CBH2、EG1和EG2的考馬斯藍(lán)染色。對(duì)木霉屬的纖維素酶進(jìn)行分析作為平行對(duì)照。圖1B顯示在SDS-PAGE分離并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜之后對(duì)這些樣品進(jìn)行組分特異性Western印跡分析。圖2是表示ELISA分析結(jié)果的柱狀圖。黑色實(shí)心柱表示商品木霉屬纖維素酶中CBH1、CBH2、EG1和EG2的百分比組成。其余的柱表明每組ELISA的特異性水平。顯示了以下百分比組成缺乏CBH1之纖維素酶中的CBH1(a)、缺乏CBH2之纖維素酶中的CBH2(b)、缺乏EG1之纖維素酶中的EG1(c)、缺乏EG2之纖維素酶中的EG2(d)。圖3顯示含有CBH1、CBH2、EG1和EG2的主要纖維素酶混合物的酶活性圖。以EG2相對(duì)于EG總量的不同含量分?jǐn)?shù)以及CBH2相對(duì)于CBH總量的不同含量分?jǐn)?shù)(分別表示為fE2和fC2)進(jìn)行測(cè)量來(lái)繪制各纖維素酶混合物的活性。每個(gè)方塊中所列的值表示與該實(shí)施例中所述基準(zhǔn)值相比的所述混合物活性。各種纖維素酶混合物的活性以相對(duì)于基準(zhǔn)混合物(CBH1、CBH2、EG1和EG2的重量百分比分別為57%、29%、7%、7%)的活性來(lái)表示。圖3A顯示，當(dāng)CBH1和CBH2的總含量在主要纖維素酶總量中高于或等于55%且低于65%時(shí)的混合物活性。圖3B顯示，當(dāng)CBH1和CBH2的總含量在主要纖維素酶總量中高于或等于65%且低于75%時(shí)的混合物活性。圖3C顯示，當(dāng)CBH1和CBH2的總含量在主要纖維素酶總量中高于或等于75%且低于85%時(shí)的混合物活性。圖3D顯示，當(dāng)CBH1和CBH2的總含量在主要纖維素酶總量中高于或等于85%且低于95%時(shí)的混合物活性。圖4是三維圖，其顯示在由％CBH、fC2和fE2限定的混合物空間(blendspace)中改進(jìn)的主要纖維素酶混合物所占據(jù)的區(qū)域?；钚詾橄鄬?duì)于基準(zhǔn)混合物的值。每對(duì)圖<緣供了同一區(qū)域的兩個(gè)視圖，其區(qū)別在于繞。/cCBH軸旋轉(zhuǎn)180°。圖4A顯示包含圖3A之區(qū)域l以及圖3B和3C之區(qū)域1、2和3的混合物。圖4B顯示包含圖3B和3C之區(qū)域2和3的混合物。圖4C顯示包含圖3B和3C之區(qū)域3的混合物。圖5是顯示基準(zhǔn)混合物(其是由以野生型纖維素酶中觀察到之相對(duì)比例的主要纖維素酶組成的混合物)與代表性改進(jìn)混合物對(duì)經(jīng)預(yù)處理之木素纖維素底物的轉(zhuǎn)化的圖。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及酶混合物。還提供了酶促水解木素纖維素原料的方法，特別是酶促水解經(jīng)預(yù)處理之木素纖維素原料的方法。以下描述為優(yōu)選實(shí)施方案。本發(fā)明涉及纖維素酶混合物，其包含用于水解經(jīng)預(yù)處理之木素纖維素原料的主要纖維素酶。"主要纖維素酶"被定義為纖維二糖水解酶CBH1和CBH2以及葡聚糖內(nèi)切酶EG1和EG2。除了主要纖維素酶CBH1、CBH2、EG1和EG2外，所述纖維素酶混合物可包>^額外的纖維素酶以及P-葡萄糖苷酶組分，如下文所進(jìn)一步詳述。以下定義涉及由隸屬?lài)?guó)際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)盟的生物化學(xué)命名聯(lián)合委員會(huì)(JointCommissiononBiochemicalNomenclatureoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology)定義(發(fā)表于EnzymeNomenclature1992，AcademicPress,SanDiego,California,ISBN0-12-227164-5;增補(bǔ)于丄5,Vc/^附.1994，223，l國(guó)5;五mk/5,Vc/^/w.1995，232,l隱6;五mk/1996，237，l國(guó)5;五mk/5,》cAe附.1997，250，1-6;以及五iw./祝oc/^附.1999，264;610-650，每篇文獻(xiàn)均通過(guò)參考并入本文中；也可參見(jiàn)chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)的纖維二糖水解酶、葡聚糖內(nèi)切酶和p-葡萄糖苷酶的分類(lèi)，并涉及由CAZy體系定義的糖類(lèi)水解酶(glycohydrolase)家族之纖維素酶和P-葡萄糖苷^，所述CAZy體系被認(rèn)可為糖類(lèi)水解酶的標(biāo)準(zhǔn)命名(Coutinho，P.M.&Henrissat，B.，1999，"Carbohydrate-activeenzymes:anintegrateddatabaseapproach."In及ece/if^vflwces/"Car60/rj^rate5zW"gi>i^*/"g,H.J.Gilbert,GLDavies,B.Henrissat和B.Svensson編輯，TheRoyalSocietyofChemistry,Cambridge,3-12頁(yè)，其通過(guò)參考并入本文中，也可參見(jiàn)afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。"CBHl"是一種碳水化合物活性酶，其表達(dá)自編碼糖類(lèi)水解酶(GH)家族7之催化結(jié)構(gòu)域(歸類(lèi)為EC3.2.1.91)的DNA序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的與任意CBHl酶具有60%~100%氨基酸序列同一性或者更優(yōu)選地65%~100%氨基酸序列同一性并表現(xiàn)出CBH1活性的任何碳水化合物活性酶(參見(jiàn)纖維二糖水解酶命名的參考文獻(xiàn))被類(lèi)似地定義為CBH1。例如，所述CBH1可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的與任意CBHl酶具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%氨基酸序列同一性并表現(xiàn)出CBHl活性的任何碳水化合物活性酶。優(yōu)選地，所述CBHl在功能上與碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydratebindingmodule,CBM)(例如家族l的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域)相關(guān)，該模塊與結(jié)晶纖維素具有高親和力。序列同一性可通過(guò)比對(duì)兩個(gè)氨基酸序列來(lái)容易地進(jìn)行確定，其使用手工比對(duì)或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何序列比對(duì)算法，例如但不限于BLAST算法(BLAST和BLAST2.0;Altschul等，Nuc.Acids.Res.25:3389-3402,1977;以及Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410，1990);由Smith&WatermanAdv.Appl.Math.2:482(1981)所公開(kāi)的算法；Needleman&WunschJ.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比對(duì)算法；Pearson&Lipman,ProcNat，l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性檢索法；以上算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA);或者通過(guò)手動(dòng)比對(duì)以及肉眼觀察來(lái)實(shí)現(xiàn)(參見(jiàn)例如CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等，eds.1995增刊))。"CBH2"被定義為一種碳水化合物活性酶，其表達(dá)自編碼糖類(lèi)水解酶(GH)家族6之催化結(jié)構(gòu)域(歸類(lèi)為EC3.2.1.91)的DNA序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的與任意CBH2酶具有60%~100%氨基酸序列同一性或者更優(yōu)選地65%~100%氨基酸序列同一性并表現(xiàn)出CBH2活性的任何碳水化合物活性酶(參見(jiàn)纖維二糖水解酶命名的參考文獻(xiàn))被類(lèi)似地定義為CBH2。例如，所述CBH2可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的與任意CBH2酶具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%氨基酸序列同一性并表現(xiàn)出CBH2活性的任何碳水化合物活性酶。優(yōu)選地，所述CBH2在功能上與碳水化合物結(jié)合模塊(CBM)(例如家族l的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域)相關(guān)，該模塊與結(jié)晶纖維素具有高親和力。序列同一性可通過(guò)上述方法來(lái)確定。"EG1"被定義為一種碳水化合物活性酶，其表達(dá)自編碼糖類(lèi)水解酶(GH)家族7之催化結(jié)構(gòu)域(歸類(lèi)為EC3.2.1.4)的DNA序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的與任意EG1酶具有60%~100%氨基酸序列同一性或者更優(yōu)選地65%~100%氨基酸序列同一性并表現(xiàn)出EG1活性的任何碳水化合物活性酶(參見(jiàn)葡聚糖內(nèi)切酶命名的參考文獻(xiàn))被類(lèi)似地定義為EG1。例如，所述EG1可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的與任意EG1酶具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、卯％、95%或100%氨基^4列同一性并表現(xiàn)出EG1活性的任何碳水化合物活性酶。優(yōu)選地，所述EG1在功能上與碳水化合物結(jié)合模塊(CBM)(例如家族1的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域)相關(guān)，該模塊與結(jié)晶纖維素具有高親和力。序列同一性可通過(guò)上述方法來(lái)確定。"EG2"被定義為一種碳水化合物活性酶，其表達(dá)自編碼糖類(lèi)水解酶(GH)家族5之催化結(jié)構(gòu)域(歸類(lèi)為EC3.2.1.4)的DNA序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的與任意EG2酶具有60%~100%氨基酸序列同一性或者更優(yōu)選地65%~100%氨基酸序列同一性并表現(xiàn)出EG2活性的任何碳水化合物活性酶(參見(jiàn)葡聚糖內(nèi)切酶命名的參考文獻(xiàn))被類(lèi)似地定義為EG2。例如，所述EG2可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的與任意EG2酶具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、卯％、95%或100%氨基酸序列同一性并表現(xiàn)出EG2活性的任何碳水化合物活性酶。優(yōu)選地，所述EG2在功能上與碳水化合物結(jié)合模塊(CBM)(例如家族1的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域)相關(guān)，該模塊與結(jié)晶纖維素具有高親和力。序列同一性可通過(guò)上述方法來(lái)確定。"P-葡萄糖苷酶"被定義為GH家族3的任一種酶，其也被歸類(lèi)為EC3.2.1.21。BGL1定義為表達(dá)自里氏木霉6gW基因的酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的與BGL1酶具有60%~100%氨基酸序列同一性或者更優(yōu)選地65%~100%氨基酸序列同一性并表現(xiàn)出^-葡萄糖普酶活性的任何蛋白質(zhì)序列(參見(jiàn)葡聚糖內(nèi)切酶命名的參考文獻(xiàn))被類(lèi)似地定義為BGL1。例如，所述BGL1可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的與任意BGL1酶具有60%、65%、70°/。、75%、80%、85%、卯％、95%或100%氨基酸序列同一性并表現(xiàn)出BGL1活性的任何碳水化合物活性酶。序列同一性可通過(guò)上述方法來(lái)確定。在本發(fā)明的纖維素酶混合物中，纖維二糖水解酶CBH1和CBH2(即CBH1和CBH2的總含量)以高于或等于55%且低于85%存在于所述纖維素酶混合物內(nèi)的主要纖維素酶混合物中(即，CBH1和CBH2的量占纖維素酶混合物中主要纖維素酶混合物的約55%~約85%)。在該CBH1和CBH2混合物范圍內(nèi)，已鑒定了三組這樣的主要纖維素酶混合物(其取決于CBH1和CBH2的總含量相對(duì)于主要纖維素酶的不同分?jǐn)?shù)(在圖3A、3B、3C中表示為。/。CBH)表現(xiàn)出對(duì)木素纖維素原料的水解具有優(yōu)勢(shì)?？梢詫⑦@些混合物組用CBH2相對(duì)于CBH1和CBH2纖維二糖水解酶的分?jǐn)?shù)來(lái)定義(基于量、重量或重量:體積)，其中該分?jǐn)?shù)稱(chēng)為fc2:fC2=CBHl/(CBHl+CBH2)。EG2相對(duì)于EG1和EG2葡聚糖內(nèi)切酶的分?jǐn)?shù)稱(chēng)為fE2:fE2=EG2/(EGl+EG2)。所述第一、第二和第三混合物的組分混合物分別圖示于圖3A、圖3B和圖3C中。這些混合物所描述的組分混合物空間的三維代表示于圖4中。占主要纖維素酶混合物約55%~約65%的CBH1和CBH2當(dāng)纖維二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于55°/。且低于65%存在于主要纖維素酶中時(shí)，纖維二糖水解酶的分?jǐn)?shù)(即CBH2的分?jǐn)?shù)(fC2))以及葡聚糖內(nèi)切酶的分?jǐn)?shù)(即EG2的分?jǐn)?shù)(fE2))為圖3A的區(qū)域1所覆蓋。圖3A的區(qū)域1包含以下三個(gè)區(qū)域fb值大于或等于0.35且小于0.45，0.35;fc2值大于或等于0.45且小于0.55，0.25;以及fc2值大于或等于0.45且小于0.55，0.45。并且&2值大于或等于0.15且小于并且fE2值大于或等于0.15且小于并且&2值大于或等于0.35且小于占主要纖維素酶混合物約65%~約75%的CBH1和CBH2當(dāng)纖維二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于65%且低于75%存在于主要纖維素酶中時(shí)，&2和&2的值涵蓋在圖3B的區(qū)域1、2和3內(nèi)。區(qū)域l、2和3包含以下區(qū)域fb值大于或等于0.25且小于0.35，并且&2值大于或等于0.05且小于0.35;fc2值大于或等于0.35且小于0.45，并且&2值大于或等于0.05且小于0.55;fc2值大于或等于0.45且小于0.65，并且&2值大于或等于0.05且0.65;以及fo值大于或等于0.65且小于0.75，并且&2值大于或等于0.15且小于0.55。圖3B的區(qū)域2和3包含以下區(qū)域fb值大于或等于0.25且小于0.35，并且&2值大于或等于0.05且小于0.35;fb值大于或等于0.35且小于0.45，并且&2值大于或等于0.05且小于0.55;以及fc2值大于或等于0.45且小于0.65,并且&2值大于或等于0.15且小于0.55。圖3B的區(qū)域3包含以下兩個(gè)區(qū)域fb值大于或等于0.45且小于0.55，并且&2值大于或等于0.15且小于0.55;以及fb值大于或等于0.55且小于0.65,并且&2值大于或等于0.35且小于0.45。優(yōu)選地，fo和fj;2涵蓋圖3B的區(qū)域2和3的值。更優(yōu)選地，fo和fE2涵蓋圖3B的區(qū)域3的值。占主要纖維素酶混合物約75%~約85%的CBH1和CBH2當(dāng)纖維二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于75%且低于85%存在于主要纖維素酶中時(shí)，fc2和fE2的值涵蓋在圖3C的區(qū)域l、2和3內(nèi)。區(qū)域l、2和3包含以下區(qū)域fc2值大于或等于0.35且小于0.45，并且fE2值大于或等于0.05且小于0.25;fc2值大于或等于0.45且小于0.55，并且&2值大于或等于0.15且小于0.65;以及fc2值大于或等于0.55且小于0.65，并且&2值大于或等于0.15且小于0.35。區(qū)域2和3包含以下三個(gè)區(qū)域fc2值大于或等于0.35且小于0.45，并且&2值大于或等于0.15且小于0.25;fc2值大于或等于0.45且小于0.55，并且&2值大于或等于0.15且小于0.55;fc2值大于或等于0.55且小于0.65，并且&2值大于或等于0.15且小于0.25。區(qū)域3界定了fb值為0.45~0.55且fE2值為0.15~0.25的單一區(qū)域。優(yōu)選地，fo和&2涵蓋圖3C的區(qū)域2和3的值。最優(yōu)選地，&2和&2涵蓋圖3C的區(qū)域3的值。使用實(shí)施例3的方法來(lái)確定纖維素酶混合物中每種纖維素酶組分的分?jǐn)?shù)或百分比。因此，本發(fā)明提供了酶混合物以及用于將經(jīng)預(yù)處理之木素纖維素原料酶促水解為可溶性糖的方法，該方法包括應(yīng)用所述酶混合物水解經(jīng)預(yù)處理的原料。所述纖維素酶混合物包含纖維二糖水解酶CBH1和CBH2以及葡聚糖內(nèi)切酶EG1和EG2的主要纖維素酶混合物。所述纖維二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于55%且低于85%的總含量存在于主要纖維素酶混合物中。CBH2以相對(duì)于纖維二糖水解酶CBH1和CBH2的一個(gè)分?jǐn)?shù)(定義為fC2)而存在，EG2以相對(duì)于葡聚糖內(nèi)切酶EG1和EG2的一個(gè)分?jǐn)?shù)(定義為fE2)而存在，其中(i)當(dāng)所述纖維二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于55%且>(氐于65%存在于主要纖維素酶中時(shí)，所述fC2和所述fE2的值涵蓋在圖3A的區(qū)域1內(nèi)；(ii)當(dāng)所述纖維二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于65%JU氐于75%存在于主要纖維素酶中時(shí)，所述fC2和所述fE2的值涵蓋在圖3B的區(qū)域1、(m)當(dāng)所述纖維二糖水解酶CBH1和CBH2以高于或等于75%且低于85%存在于主要纖維素酶中時(shí)，所述fc2和所述fE2的值涵蓋在圖3C的區(qū)域l、2和3內(nèi)。本發(fā)明的纖維素酶混合物用于酶促水解"經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素原料"。經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素原料為來(lái)源于植物的材料，其在預(yù)處理前含有至少20%的纖維素(干重)以及至少12%的木質(zhì)素(干重)，并且已經(jīng)過(guò)物理和/或者化學(xué)方法處理以使纖維素分解酶對(duì)纖維的作用更易接近和/或更易接受。預(yù)處理后，所述木素纖維素原料可包含高于約20%的纖維素以及高于約12%的木質(zhì)素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素原料包含高于約20%的纖維素以及高于約100/。的木質(zhì)素?？捎糜诒景l(fā)明的木素纖維素原料包括但不限于農(nóng)業(yè)殘余物，例如玉米秸稈、麥秸、大麥秸稈、稻秸、燕麥秸稈、油菜稈和大豆秸稈；纖維加工殘余物，例如玉米纖維、糖用甜菜渣(sugarbeetpulp)、紙漿廠細(xì)小纖維和廢棄物或者甘蔗渣；林業(yè)廢棄物，例如山楊木、其他硬木、#和鋸屑；或者草類(lèi)，例如柳枝稷、芒屬植物、米草和草，。所#素纖維素原料可首先進(jìn)行粉碎處理，所述粉碎方法包括但不限于碾磨、研磨、攪拌、撕碎、壓擠/膨脹或另一些類(lèi)型的機(jī)械作用。可以使用適于所述目的的任何類(lèi)型的設(shè)備(例如但不限于錘式粉碎機(jī))來(lái)實(shí)現(xiàn)機(jī)械式尺寸減小。預(yù)處理方法的非限制性實(shí)例包括使用以下物質(zhì)對(duì)木素纖維素原料進(jìn)行化學(xué)處理硫酸或亞硫酸或者其它的酸；氨、石灰、氫氧化銨或其它的堿；乙醇、丁醇或其它的有機(jī)溶劑；或者加壓水(pressurizedwater)(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.4,461,648、5,916,780、6,090,595、6，043，392、4，600，5卯,Weil等(1997)和dhgren，K.等(2005);其均通過(guò)參考并入本文中)?？蛇M(jìn)行預(yù)處理以將木素纖維素原料中存在的半纖維素或其一部分水解為單體糖(例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或其組合)。優(yōu)選地，進(jìn)行預(yù)處理從而使半纖維素幾乎完全水解并且纖維素少量轉(zhuǎn)化為葡萄糖。在預(yù)處理過(guò)程中，通常使用含水漿液中約0.02%(重量/重量)~約2%(重量/重量)(或其間的任何量)的酸濃度來(lái)處理木素纖維素原料。優(yōu)選地，預(yù)處理過(guò)程中使用的酸為硫酸?？稍陬A(yù)處理之后但在酶促水解之前對(duì)經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素原料進(jìn)行以下任意步驟的處理，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的用7jC稀釋、用水清洗、緩沖、過(guò)濾、離心或這些方法的組合。接下來(lái)對(duì)經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素原料進(jìn)行酶促水解。術(shù)語(yǔ)"酶促水解"意指纖維素酶作用于纖維素以使所有或一部分的纖維素轉(zhuǎn)化為可溶性糖的方法?？扇苄蕴且庠诎ㄋ苄缘募禾菃误w和最多六個(gè)單體單元的寡聚體，其來(lái)源于經(jīng)預(yù)處理之木素纖維素原料的纖維素部分。可溶性糖的實(shí)例包括葡萄糖、纖維二糖、纖維糊精或其混合物。優(yōu)選地，所述可溶性糖主要為纖維二糖和葡萄糖。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述可溶性糖主要為葡萄糖。所述酶促水解方法優(yōu)選地將約80%~約10(T/。(或其間的任何范圍)的纖維素轉(zhuǎn)化為可溶性糖。更優(yōu)選地，所述酶促水解方法將約卯％~約100%(或其間的任何范圍)的纖維素轉(zhuǎn)化為可溶性糖。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶促水解方法將約98%~約100%(或其間的任何范圍)的纖維素轉(zhuǎn)化為可溶性糖。使用所述纖維素酶混合物進(jìn)行酶促水解可以是分批水解(batchhydrolysis),連續(xù)水解(continuoushydrolysis)或其纟且合?？梢詫?duì)所述水解進(jìn)行攪拌、非混合或其組合。優(yōu)選在約45"C75X:(或其間的任何溫度)以及約3.5~約7.5的pH值(或其間的任何值)下進(jìn)行酶促水解。在水解開(kāi)始前，水解反應(yīng)器中的纖維素初始濃度優(yōu)選為約4%(重量/重量)~約15%(重量/重量)(或其間的任何濃度)。所有主要纖維素酶的總劑量可為約5~約45mg/克纖維素(或其間的任何量)。水解可進(jìn)行約12小時(shí)~約200小時(shí)(或其間的任何值)。優(yōu)選地，水解進(jìn)行15小時(shí)~100小時(shí)。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，所述反應(yīng)條件不意在以任何方式限制本發(fā)明，并且可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的需要進(jìn)行調(diào)整。所述酶促水解通常在水解反應(yīng)器中進(jìn)行?？稍趯⒌孜锛尤胨夥磻?yīng)器之前、期間或之后將所述主要纖維素酶加至經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素原料(即"底物")中。優(yōu)選地，所述主要纖維素酶在一個(gè)或多個(gè)液體深層培養(yǎng)發(fā)酵(submergedliquidculturefermentation)中產(chǎn)生，并且在發(fā)酵結(jié)束時(shí)與細(xì)胞分離?？梢酝ㄟ^(guò)過(guò)濾、離心或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他方法將細(xì)胞與所述纖維素酶分離。在使用前，可以對(duì)所述不含細(xì)胞的含纖維素酶級(jí)分進(jìn)行濃縮(例如通過(guò)超濾來(lái)實(shí)現(xiàn))、保存和/或穩(wěn)定?；蛘撸鲋饕w維素酶不與細(xì)胞分離，而是與細(xì)胞一起加入酶促水解中。所述纖維素酶混合物可以是蛋白質(zhì)于水中的水溶液或者蛋白質(zhì)于水中的漿液、固體粉劑或顆?；蛘吣z。含有纖維素酶的混合物可包含添加劑如緩沖劑、去污劑、穩(wěn)定劑、填充劑以及本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它這樣的添加劑。優(yōu)選地，所述主要纖維素酶表達(dá)自真菌編碼序列。在該實(shí)施方案中，所述編碼序列可來(lái)自任何真菌來(lái)源。術(shù)語(yǔ)"真菌"、"真菌類(lèi)"、"真菌的"、"子嚢菌亞門(mén)"、"擔(dān)子菌亞門(mén)"以;M目關(guān)術(shù)語(yǔ)(例如"子嚢菌"和"擔(dān)子菌")意在嚢括定義于J7ieFw"g/:J/iv4^wic^7Vefl他e(GCAinsworth，F(xiàn)KSparrow,ASSussman,eds"AcademicPress1973)中的生物?？梢栽诒景l(fā)明的實(shí)踐中使用纖維素酶的任何來(lái)源。本發(fā)明中纖維素酶的編碼序列優(yōu)選來(lái)自子嚢菌亞門(mén)或擔(dān)子菌亞門(mén)。例如，所述編碼序列來(lái)自選自以下的屬木霉屬、曲霉屬、肉座菌屬、腐質(zhì)霉屬、脈抱菌屬(A^"ras/wraspp.)、Of/wW/ifjcesspp.、赤霉屬((？歸《"http://<1spp.)、棵胞殼屬(￡>wc/ce//flspp.)、毛殼菌屬(C7ifleto挑/wwspp.)、鐮刀菌屬(F"s""'謂spp.)、青霉菌7廣屬(7^"/"7//"附spp.)、稻瘋菌屬(Mfl^ifl/wW/respp.)和平革菌屬(/Vifl"mc/metespp.)。優(yōu)選地，所述主要纖維素酶的編碼序列來(lái)自里氏木霉?？梢栽诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的作為表達(dá)宿主的微生物(如細(xì)菌或真菌)中克隆并表it^發(fā)明的主要纖維素酶。優(yōu)選地，所述微生物是真菌?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何數(shù)量的微生物轉(zhuǎn)化方法將所述基因構(gòu)建體導(dǎo)入宿主微生物體中，所述方法包括但不限于用CaCh處理細(xì)胞、電穿孔、基因槍轟擊(biolisticbombardment)、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體融合(例如，White等，WO2005/093072，其通過(guò)參考并入本文中)?？梢詮囊粋€(gè)生物林系表達(dá)所有的主要纖維素酶。或者，也可以從不同生物的不同林系單獨(dú)地或分組地表達(dá)主要纖維素酶。也可考慮從單一生物的不同林系單獨(dú)地或分組地表達(dá)主要纖維素酶，例如M氏木霉的不同林系。優(yōu)選地，所有纖維素酶表達(dá)自里氏木霉的單一林系。優(yōu)選地，所述主要纖維素酶是由表達(dá)生物所產(chǎn)生的總纖維素酶系統(tǒng)的一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述主要纖維素酶是纖維素酶系統(tǒng)中僅有的纖維素酶。在另一實(shí)施方案中，所述主要纖維素酶是包含P-葡萄糖苷酶之纖維素酶系統(tǒng)的一部分。所述主要纖維素酶可以是包含里氏木霉分泌組的總纖維素酶系統(tǒng)的一部分。術(shù)語(yǔ)"分泌組"是指由特定微生物細(xì)胞外分泌至培養(yǎng)基中的所有蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述主要纖維素酶是包含里氏木霉的BGL1P-葡萄糖苷酶以及里氏木霉的分泌組的總纖維素酶系統(tǒng)的一部分?？衫梦⑸飦?lái)發(fā)酵由酶促水解產(chǎn)生的可溶性糖。發(fā)酵產(chǎn)物可包含能為發(fā)酵工廠帶來(lái)價(jià)值的任何期望產(chǎn)物。優(yōu)選的發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇、丁醇和乳酸，它們都具有廣闊的市場(chǎng)并且可由多種微生物有效產(chǎn)生。對(duì)于乙醇生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，可以利用能將糖發(fā)酵成乙醇的一種或多于一種微生物來(lái)進(jìn)行發(fā)酵。例如，可利用重組的釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵，所述酵母已被^Lit可以將葡萄糖、甘露糖、半乳糖和;MI發(fā)酵生成乙醇或者可以將葡萄糖、甘露糖，半乳糖、木糖和阿拉伯糖發(fā)酵生成乙醇。美國(guó)專(zhuān)利No.5,789,210中描述了可以將木糖發(fā)酵生成乙醇的重組酵母(其通過(guò)參考并入本文中)。所述酵母產(chǎn)生在水溶液中含有乙醇的發(fā)酵液。對(duì)于乳酸生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，可以利用能將糖發(fā)酵成乳酸的微生物來(lái)進(jìn)行發(fā)酵。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維素酶混合物通過(guò)微生物在酸性pH值下表達(dá)主要纖維素酶來(lái)生產(chǎn)。優(yōu)選地，pH值為約2約5。例如，發(fā)酵pH值可以是約2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8或5.0,或者其間的任意pH值。與現(xiàn)有技術(shù)中描述的酶促水解相比，本發(fā)明的酶混合物具有非常不同的組成。本發(fā)明的主要纖維素酶混合物是與"基準(zhǔn)混合物"(CBH1、CBH2、EG1EG2的組成分別為57%、29%、7%、7%)顯著不同的組合物。最優(yōu)的混合物圖示于圖3A、3B和3C中，基準(zhǔn)混合物標(biāo)注于圖3D所示的混合物空間中。圖4中顯示這些區(qū)域描述的組分混合物空間的三維表征。本發(fā)明的酶混合物與現(xiàn)有技術(shù)中所述的那些相比具有更高的活性。所述圖的區(qū)域l、2和3所示活性比基準(zhǔn)混合物高出10%或更多。區(qū)域2和3所示活性比基準(zhǔn)混合物高出13%或更多。區(qū)域3所限定之混合物的活性比基準(zhǔn)混合物高出16。/?；蚋唷D3A、3B和3C所示區(qū)域的不規(guī)則形狀是未預(yù)見(jiàn)到的，其表明在整個(gè)混合物空間內(nèi)活性急劇漸變。與使用模式底物或者少于四種主要纖維素酶的酶混合物之現(xiàn)有技術(shù)可得出的結(jié)論相比，本發(fā)明的纖維素酶混合物所限定的空間更加復(fù)雜。過(guò)去優(yōu)化混合物的嘗試通常在三角形圖上描繪三元混合物(參見(jiàn)Baker等，1998)。這些嘗試落在空間的角、邊或面上，因此與實(shí)際的優(yōu)化相去甚遠(yuǎn)。以下的實(shí)施例將進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1:從里氏木霉纖維素酶純化主要纖維素酶CBH1、CBH2、EG1和EG2在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)的條件下，利用液體深層發(fā)酵來(lái)培養(yǎng)里氏木霉菌林。木霉菌蛋白質(zhì)的粗混合物由細(xì)胞分泌到發(fā)酵液中。利用過(guò)濾通過(guò)包含Harborlite濾墊的玻璃微纖維濾器來(lái)除去發(fā)酵液中的真菌細(xì)胞。如Bhikhabhai等人(1984)所述使用DEAE-瓊脂糖^31柱進(jìn)行陰離子交換層析從而將粗過(guò)濾物中的主要纖維素酶(CBH1、CBH2、EG1和EG2)分離出來(lái)。該步驟將EG1和EG2分開(kāi)。然后利用Piyachomkwan等人(1997，1998)報(bào)道的對(duì)^J^苯基-l-硫代-卩-D-纖維二糖香親和層析來(lái)進(jìn)一步純化CBH1和CBH2。使用攪拌式超過(guò)濾器(stirredultrafiltrationcell)(Amicon)和10kDaNMWL聚醚fl^將經(jīng)純4fc的纖維素酶組分進(jìn)行濃縮并將緩沖液更換為50mM檸檬酸鈉(pH5.0)。實(shí)施例2:測(cè)量主要纖維素酶的濃度和純度使用Bradford等人(1976)的方法來(lái)通過(guò)化學(xué)方法確定蛋白質(zhì)濃度。白樣品分開(kāi)，并利用考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行電泳后觀察，如圖1中A圖所示。對(duì)于每種純化組分來(lái)說(shuō)，使用Chemigenius2(Syngene)成像系統(tǒng)通過(guò)掃描密度測(cè)定法來(lái)定量測(cè)定每一條帶的染色強(qiáng)度。將每種組分的條帶強(qiáng)度除以凝膠上中同一泳道中針對(duì)所有條帶所測(cè)量的總?cè)旧珡?qiáng)度來(lái)計(jì)算得到相對(duì)純度。缺乏碳水化合物結(jié)合模塊的EG2以痕量存在，然而不認(rèn)為其是該酶制備中的污染物。CBH1和CBH2的相對(duì)純度大于95%,而EG1和EG2的相對(duì)純度大于90%。為了證明每種組分制備物未被主要纖維素酶所污染，使用組分特異性的多克隆兔抗血清對(duì)純化的CBH1、CBH2、EG1和EG2進(jìn)行Western印跡分析(圖l，B圖)。利用10%SDS-PAGE來(lái)分離蛋白質(zhì)，然后使用來(lái)自BioRad的MiniTrans-BlotCell以100伏電壓將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜1小時(shí)。使用Birkett等人的方法進(jìn)行Western印跡。使用合成肽來(lái)產(chǎn)生組分特異性的多克隆抗血清，所述肽的序列基于來(lái)自里氏木霉的CBH1、CBH2、EG1和EG2的一級(jí)^J^酸序列，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些實(shí)施例表明，所使用的純化方法得到基本上純的CBH1、CBH2、EG1和EG2。這也表明這些抗血清針對(duì)每種所述主要纖維素酶組分的特異性。實(shí)施例3:測(cè)定木霉菌纖維素酶中CBH1、CBH2、EG1和EG2的相對(duì)濃度利用ELISA來(lái)測(cè)定里氏木霉纖維素酶中CBH1、CBH2、EG1和EG2的相對(duì)濃度。用pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)將纖維素酶和純化組分的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成1-100ng/mL，并在微量滴定板(CostarEIA-高結(jié)合力)中4'C孵育過(guò)夜。用含有0.1%吐溫20的PBS(PBS/吐溫)清洗這些板，然后在含有1%牛血清白蛋白的PBS(PBS/BSA)中室溫孵育1小時(shí)。用PBS/吐溫清洗經(jīng)封閉的微量滴定孔。用PBS/BSA稀釋特異性針對(duì)CBH1、CBH2、EG1和EG2的兔多克隆抗血清，將所述抗血清分別加至備微量滴定板并于室溫下孵育2小時(shí)。清洗微量滴定板，然后與偶聯(lián)有辣根過(guò)氧物酶的山羊抗兔抗體一起在室溫下孵育1小時(shí)。清洗后，向每個(gè)板內(nèi)加入四甲J^苯胺，并在室溫下孵育l小時(shí)。測(cè)量每個(gè)孔中360nm處的吸光度，并使用實(shí)施例2中制備的CBH1、CBH2、EG1和EG2標(biāo)準(zhǔn)將所述吸光度轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)濃度。將這些蛋白質(zhì)濃度除以CBH1、CBH2、EG1和EG2的總濃度計(jì)算得到每種組分的相對(duì)濃度。木霉菌纖維素酶中CBH1、CBH2、EG1和EG2的相對(duì)組成分別為57%:29%:7%:7%(圖2)。這在本文中稱(chēng)為"基準(zhǔn)混合物"。該混合物來(lái)自商業(yè)化的木霉菌纖維素酶產(chǎn)品，如以下所圖示。CBH相對(duì)于全部主要纖維素酶的濃度(％CBH)為57%+29%=86%。這使該組合處于圖3D中(CBH占85%~95%)。在其他圖中圖3A——％CBH=55%~65%;圖3B——％CBH=65%~75%;圖3C——％CBH=75%~85%。CBH2相對(duì)于所有CBH的濃度(fC2)為29%/(57%+29%)=0.337。EG2相對(duì)于所有主要EG的濃度(fE2)為7%/(7%+7%)=0.5。還對(duì)來(lái)自不分泌CBH1(無(wú)CBH1)、CBH2(無(wú)CBH2)、EG1(無(wú)EG1)或EG2(無(wú)EG2)的木霉菌菌林的纖維素酶進(jìn)行分析，以證明每一組ELISA特異性地檢測(cè)CBH1、CBH2、EG1或EG2(圖2)。實(shí)施例4:測(cè)量主要纖維素酶混合物對(duì)經(jīng)預(yù)處理之木素纖維素原料的纖維素水解活性將具有實(shí)施例3中基準(zhǔn)CBH1、CBH2、EG1和EG2比例的主要纖維素酶混合物與具有不同組成的混合物進(jìn)行比較。在0.25mL混合纖維素水解測(cè)定(mixedcellulosehydrolysisassay)中檢測(cè)這些主要纖維素物，補(bǔ)充來(lái)自黑曲霉(l/w^7//s/i/ger)P-葡^糖苷酶制備,物:i與經(jīng)酸預(yù)處理的麥秸一起孵育。參照Foody的美國(guó)專(zhuān)利No.4，461，648進(jìn)行預(yù)處理。在50。C孵育24小時(shí)，纖維素的目標(biāo)轉(zhuǎn)化水平大于70%。通過(guò)測(cè)定實(shí)現(xiàn)纖維素目標(biāo)轉(zhuǎn)化水平所需的酶量并歸一化為基準(zhǔn)纖維素酶混合物所需的酶量來(lái)計(jì)算酶活性。所述歸一化值的不確定性在±0.04的數(shù)量級(jí)上，這表明可認(rèn)為高出基準(zhǔn)值10%的觀察值(即歸一化值為I.IO)顯著大于基準(zhǔn)。應(yīng)用跨三維混合物空間(空間的維度分別為fC2、fE2和。/。CBH)的加權(quán)平均值來(lái)使活性數(shù)據(jù)平滑。將給定點(diǎn)(該點(diǎn)的坐標(biāo)為fC2=x、fE2=y、％CBH=z)的歸一化活性數(shù)據(jù)與其最鄰近的6個(gè)點(diǎn)(其坐標(biāo)分別為x+0.1,y，z;x-O.l，y，z;x,y+O.l,z;x，y國(guó)O.l，z;x,y，z+10%;以及x，y，z-10%)進(jìn)行平均。在用于計(jì)算加權(quán)平均值(Xw)的式x^i:wiXi/i:wi中，將所研究的點(diǎn)賦予權(quán)重w=1.00,將6個(gè)鄰近點(diǎn)賦予權(quán)重w=0.15，其中下標(biāo)i表示計(jì)數(shù)變量以加和上述所有7個(gè)點(diǎn)，Xi和Wi分別表示第i點(diǎn)的歸一化活性和權(quán)重。為了直觀地展示這些結(jié)果，實(shí)施例3中所述的酶活性示于圖3A、3B、3C或3D中，并例舉于表l中。表l:主要纖維素酶混合物的歸一化葡萄糖產(chǎn)率<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>首先，鑒定出活性顯著高于基準(zhǔn)混合物(其主要纖維素酶比例可在通常市售的纖維素酶中發(fā)現(xiàn))的主要纖維素酶混合物。這表明有可能生產(chǎn)出活性比現(xiàn)有混合物高出15%的纖維素酶混合物。這些混合的組成與基準(zhǔn)混合物顯著不同。第二點(diǎn)是所圖示區(qū)域的不規(guī)則形狀。這些不規(guī)則的形狀是未預(yù)見(jiàn)到的，其表明在整個(gè)混合物空間內(nèi)活性急劇變化。與4吏用模式底物或者少于四種主要纖維素酶的酶混合物之現(xiàn)有技術(shù)可得出的結(jié)論相比，該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所限定的空間更加復(fù)雜。第三點(diǎn)是最優(yōu)混合物的組成與現(xiàn)有技術(shù)中的混合物顯著不同(參見(jiàn)實(shí)施例5)。不限于任何理論，我們認(rèn)為有必要使用經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素原料來(lái)測(cè)量纖維素酶的活性。而現(xiàn)有技術(shù)中的許多研究使用純纖維素模式底物。圖4顯示由這些區(qū)域構(gòu)成的組分混合物空間的三維表征。實(shí)施例5:圖示分析木霉菌纖維素酶的組成來(lái)自科學(xué)和專(zhuān)利文獻(xiàn)的用于水解纖維素的十種木霉菌纖維素酶的相對(duì)組成如下確定將所報(bào)道的CBH1、CBH2、EG1和EG2的蛋白濃度除以每種纖維素酶中這四個(gè)組分濃度之和。然后基于CBH的百分比將這些纖維素酶進(jìn)行分組，如實(shí)施例4中對(duì)主要纖維素酶混合物所進(jìn)行的分組一樣。然后，將這些纖維素酶繪制成其fc2和fE2的函數(shù)，隨后相對(duì)于基準(zhǔn)組分混合物與纖維素水解活性改善的相關(guān)區(qū)域進(jìn)行比較。該分析中不包括文獻(xiàn)中CBIK55。/。或CBH〉95。/。的木霉菌纖維素酶。發(fā)表的所有主要纖維素酶的組成均在所述產(chǎn)生最高纖維素酶活性的區(qū)域之外。表2:將已知組成標(biāo)示到圖3上<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>一種缺乏EG2的木霉菌纖維素酶也標(biāo)示于圖3D中。該組合物包含6L3。/。的CBH1，31.2。/。的CBH2，7.50/。的EG1，并且^2和^2值分別為0.337和0。該組成也在所述產(chǎn)生最高纖維素酶活性的區(qū)域之外(參見(jiàn)圖3B和3C)。實(shí)施例6:測(cè)量主要纖維素酶混合物對(duì)經(jīng)預(yù)處理之木素纖維素原料在長(zhǎng)時(shí)間中的水解活性在長(zhǎng)時(shí)間的水解中，將具有實(shí)施例3中基準(zhǔn)CBH1、CBH2、EG1和EG2比例的主要纖維素酶混合物與實(shí)施例4中活性提高15%的改進(jìn)型混合物進(jìn)行比較。所述改進(jìn)型混合物由32%的Cel7A、47%的Cel6A、17%的Cel7B和4。/。的Cel5A組成。兩種混合物的用量均為每克纖維素18mg酶，此外補(bǔ)充來(lái)自黑曲霉的j3-葡萄糖苷酶制備物(每克纖維素100IU)。在50。C、200rpm連續(xù)振蕩的條件下，將所述混合物與50mM檸檬酸鹽(pH5.0X其含有0.5%苯甲酸鈉和0.01%TritonX-100)中25g/L纖維素一起孵育56小時(shí)。在圖5所示的時(shí)間點(diǎn)取出0.5mL等分試樣，測(cè)定可溶部分中葡萄糖的濃度并將其換算為轉(zhuǎn)化分?jǐn)?shù)。然后，將該轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)與一條直角雙曲線擬合，以及使用最小化擬合殘差平方和(sumofsquaredresiduals)的額外線性項(xiàng)。所述等式具有以下形式轉(zhuǎn)化率=(最大x時(shí)間)/(半數(shù)最大+時(shí)間)+cx時(shí)間。這兩組數(shù)據(jù)均與唯一的最大值和半數(shù)最大值以及共用的變量c值完全擬合。使用模型比較法(Motulsky和Christ叩olous，2003)計(jì)算最大轉(zhuǎn)化率值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。使用t-檢驗(yàn)來(lái)比較基準(zhǔn)混合物與所優(yōu)化混合物(如上所述)的最大轉(zhuǎn)化率值。所述優(yōu)化混合物的最大轉(zhuǎn)化率值為0.69，這比基準(zhǔn)混合物的最大轉(zhuǎn)化率值0.外有所提高。這代表了16%的顯著提高(p<0.05)。在除了本文涉及的四種纖維素酶之外的另一些纖維素酶組分存在下，這些混合物的轉(zhuǎn)化率將更高。所有引用均通過(guò)參考并入本文中。本發(fā)明已通過(guò)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案來(lái)進(jìn)行描述。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不背離權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明范圍的前提下可進(jìn)行多處改動(dòng)和修改是顯而易見(jiàn)的。參考文獻(xiàn)Baker，J.,etal.，"Hydrolysisofcelluloseusingternarymixturesofpurifiedcdhilases",AppliedBiochemistryaadBiotechnology,70-72:395-403，(1998),Barr,B.,etal,，"IdentificationoftwoftmctkmallydifferentclassesofexoceUulases"，Biochemistry,35:586-592,(1996).Berghem，L,andPettersson'L曾，"ThetnechanismofenzymaticcelMosedegradatioiLPurificationofacdlulo!yticenzymefromTrichodramavirideactiveonhighlyorderedcellulose.",EuropeanJournalofBiochemistiy，37:21-30,(197》.Bhikhabhai,R.，改al.,"IsolationofCellublyticEnzymesfromr"c&o血rnwweseiQM9414"，JournalofAppliedBiocheraisby，6:336-345(1訴4)-Bkket^C.R,,etal.，"Useofmonoclonalantibodiestoanalyzetheexpressionofamulti-tutulbfemily",FEBSLetters,187(2):211-218,(l訴5).Boisset,C.，etal.，"OptimizedmixturesofrecotnbhiantHumicolainsol咖ceMasesfortheWodegradatioaof(ays礎(chǔ)necelido站"，BiotechnologyandBioeAgineoiigj72:339-345,(2001).Bradford,MJM.，etal.,"Arapidandsensitivemethodforquantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotdn-dyebinding",AnalyticalBiochemistry,72:248-254,(1976).助ari,TM.andNiku-Paavola,ML.,"AssaysforCelhilolyticEnzymes:MefliodsforMeasuringCellulaseActivities",InJ.N.AbdsonandM..Simon(Ed/s.),inEnzymotogy，117-126,SanDiego,CaKfomia:AcademicPress,Inc.,(1988).Henrissat,B,,etal,,"SynergismofcellulasesfromIWcftodfermareesez'inthedegradationofcellulose",Bio/Technoiogy,3:722-726,(l訴5).Houghton,J.,etal.，'^BreakingtheBiologicalBarrierstoCellutosicEthanoi",U.S.DepartmentofEnergyOfficeofScienceandOfficeofEnergyEfficiencyandRenewableEnergy,DOE/SC-0095,(2006).Hui,J.，etal""CharacterizationofcellobiohydrokseI(Ce!7A)glycofo加sfromextractsof7h'cWawwr鄉(xiāng)e!'usingcapillaryisoelectricfocusingandelectrospray加ssspectrometry",JournalofChromatographyB,752:3移-368(2001).IrwiiijD,,etal""Activitystudiesofeightpurifiedcellulases:specificity,synergism,andbindingdomaineffects",BiotechnologyandBioengin明ring,42:1002-1013,(1993).Kimetal""Factorialoptimizationofasix-cdlulasemixture",BiotechnologyandBioengineering58:494-501,(1998).Kubicek,C.，'Thecdl由eproteiflsofTrichoderraareesei:Structure,irvultiplicity，modeofactionandregulationofforraatk)ri"，AdvancesinBiodiemicalEngiaeering/Bioteclmology,45:2-22,(l卯2).Motulsky，H，andChristopolous,A""Fittingmodelstobiologicaldatausinglinearandnonlinearregression:Apracticalguidetocurvefitting."OxfordUrdversityPress,NewYork,(2004),Nidetsky,B.,eta.，"CellulosefaydrolysisfoytheceHulasesfixjinTrichodemtareesd:anewmodelforsynergisticinteraction.",BiochemicalJournal,298:705-710，(;994).。hgren'K"etal.,"OptimizationofSte咖PretreatoentofSCVIrr^regftatedCornStoverforFuelEthanolProduction",AppliedBiochemistryandBiotechnology,121-Z24:,-賄,(2卿Piyacbomkw叫K.,etal.,>Aminophenyll-thio-p-D-celiobioside:synthesisandapplicationinaffinitychromatograpliyofexo-typeceilulases",CarbohydrateResearch,303:255-259(1997).Piyachomkwan,K.,改al,,"ArylThiogtycoside-B蹈edAffinityPurificationofEko-ActingCeilulases",AnalyticalBiochemistry,255:223'235,(1998).Slieeh叫J.andHimmd，M.，"Enzymes,Energy,andtheEnvironment:AStrategicPerspectiveontheU.S.D印artm加ofEnergy'sResearchandDevelopmentActivitiesforBioethanol",BiotechnologyProgress,15:817-827，(1999).Tolan，/.，"tog切,sprocessibrprodiidnge出咖JfromcellulosicWomass"，CleanTechnologiesandEnvironmentalPolicy,3:339-345,(2002).Walker,L.，etal.,"EngiiieeriiigceM欲mixturesbyvaryingthemolefiactionof!TAeJ7no"as/ww*。yiiscaE5幼dE3，7WeAcwferwareeseiCBHIandCaWoceZZww■swc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15且小于0.25。19.權(quán)利要求18的纖維素酶混合物，其中所述纖維二糖水解酶CBH1和CBH2以75°/。~85%存在于主要纖維素酶中并且所述fc2值大于或等于0.35且小于0.45,并且所述&2值大于或等于0.15且小于0.25;所述fc2值大于或等于0.45且小于0.55，并且所述&2值大于或等于0.15且小于0.55;或者所述fc2值大于或等于0.55且小于0.65，并且所述&2值大于或等于0.15且小于0.25。20.權(quán)利要求19的纖維素酶混合物，其中所述fC2值大于或等于0.45且小于0.55，并且所述fE2值大于或等于0.15且小于0.25。21.權(quán)利要求18的纖維素酶混合物，其中所述纖維二糖水解酶CBH1和CBH2以65%~75%存在于主要纖維素酶中，并且所述fc2值大于或等于0.25且小于0.35，并且所述fE2值大于或等于0.05且小于0.35;所述fc2值大于或等于0.35且小于0.45，并且所述fE2值大于或等于,0.05且小于0.55;或者所述fc2值大于或等于0.45且小于0.65，并且所述&2值大于或等于0.15且小于0.55。22.權(quán)利要求21的纖維素酶混合物，其中所述fc2值大于或等于0.45且小于0.55，并且所述&2值大于或等于0.15且小于0.55;或者所述fc2值大于或等于0.55且小于0.65，并且所述&2值大于或等于0.35且小于0.45。23.權(quán)利要求17的纖維素酶混合物，其中所述纖維素酶混合物在pH值為約2至約5時(shí)通過(guò)微生物表達(dá)所述主要纖維素酶而產(chǎn)生。全文摘要本發(fā)明提供了用于將經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素原料酶促水解成可溶性糖的酶混合物。還提供了用酶混合物水解經(jīng)預(yù)處理之木素纖維素原料的方法。所述酶促水解包括將纖維素酶混合物添加至經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素原料中。所述纖維素酶混合物包含CBH1和CBH2以及EG1和EG2的主要纖維素酶混合物。在所述主要纖維素酶混合物中，CBH1和CBH2以高于或等于55％且低于85％存在。此外，CBH2以相對(duì)于CBH1和CBH2的一個(gè)分?jǐn)?shù)而存在，EG2以相對(duì)于EG1和EG2的一個(gè)分?jǐn)?shù)而存在。文檔編號(hào)C12P19/14GK101517073SQ200780036082公開(kāi)日2009年8月26日申請(qǐng)日期2007年8月30日優(yōu)先權(quán)日2006年8月31日發(fā)明者克里斯多佛·希爾,布賴(lài)恩·R·斯克特,約翰·托馬舍克申請(qǐng)人:艾歐基能源公司