一種超氧化物歧化酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種來源于動物凝血塊的超氧化物歧化酶的制備方法，包括：(1)、將動物凝血塊一邊攪拌一邊加入蛋白質(zhì)沉淀劑，過濾；(2)、離心，水溶，速冷、靜置、純化、稀釋、過濾；(3)、在冰箱中析出的沉淀，真空冷凍干燥，制得超氧化物歧化酶。本發(fā)明具有制備工藝簡單，無復(fù)雜生產(chǎn)設(shè)備，成本低，環(huán)境友好，產(chǎn)率高，可適合進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)等特點，所得超氧化物歧化酶pH具有很好的穩(wěn)定性，良好的熱穩(wěn)定性以及蛋白酶水解能力。
【專利說明】一種超氧化物歧化酶的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種來源于動物凝血塊的超氧化物歧化酶的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]超氧化物歧化酶(SOD)是一種新型酶制劑。它在生物界的分布極廣，幾乎從動物到植物，甚至從人到單細(xì)胞生物，都有它的存在。SOD被視為生命科技中最具神奇魔力的酶、人體內(nèi)的垃圾清道夫。
[0003]SOD具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，是機體內(nèi)氧自由基的頭號殺手，是生命健康之本。SOD在生物體內(nèi)的水平高低意味著衰老與死亡的直觀指標(biāo)；現(xiàn)已證實，由氧自由基引發(fā)的疾病多達(dá)60多種。它可對抗與阻斷因氧自由基對細(xì)胞造成的損害，并及時修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原因自由基造成的對細(xì)胞傷害。由于現(xiàn)代生活壓力，環(huán)境污染，各種輻射和超量運動都會造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化機制中SOD的地位越來越重要。
[0004]SOD是機體活性氧清除反應(yīng)過程中第一個發(fā)揮作用的抗氧化酶，對防止氧自由基破壞細(xì)胞的組成、結(jié)構(gòu)和功能，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷具有十分重要的作用。作為生物體細(xì)胞中最主要的抗氧化酶，SOD是通過催化下類反應(yīng):0廠+O2- +2H++S0D — H202+02+S0D起作用的，即:將生物體內(nèi)多余的并對細(xì)胞破壞力極強的超氧陰離子自由基通過歧化反應(yīng)而生成過氧化氫和氧氣，過氧化氫隨后被體內(nèi)的抗壞血酸和過氧化氫酶(CAT)分解為H2O和O2，從而解除02_，所造空城的氧化脅迫。這在維持生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的產(chǎn)生與消除的動態(tài)平衡中起著重要作用。
[0005]至今為止，人們已從細(xì)菌、真菌、藻類、魚類、昆蟲、植物和哺乳動物等各種生物體內(nèi)分離得到了多種S0D、按照結(jié)合的金屬離子的種類不同，可分為三種類型，即Mn-SOD、Fe-SOD和Cu-Zn-SOD。第一種類型含Mn，呈粉紅色，目前已從真核細(xì)胞的線粒體及元和細(xì)胞漿分離得到；第二種類型含F(xiàn)e，呈黃色，只存在于原核細(xì)胞內(nèi)；第三種類型含Cu和Zn，呈藍(lán)綠色，主要存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)。
[0006]由于原材料有限，純化困難等原因，導(dǎo)致SOD的純度地、產(chǎn)品少。在現(xiàn)有技術(shù)中，對在動物血中進(jìn)行超氧化物歧化酶的提取通常采用分離然然后用乙醇和氯仿進(jìn)行提取，取得粗酶液。由于動物血耐熱性差，因而取得的粗酶液常常含有較多的雜蛋白。
[0007]針對以上不足，本發(fā)明提供一種在動物學(xué)血中提取高純度的超氧化物歧化酶的制備方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過對動物凝血塊進(jìn)行過濾、三次離心、純化、沉淀，得到一種超氧化物歧化酶的方法。
[0009]本發(fā)明技術(shù)方案如下:
[0010]步驟1:按每10g動物凝血塊對應(yīng)20?30g蛋白質(zhì)沉淀劑，將動物凝血塊一邊攪拌一邊加入蛋白質(zhì)沉淀劑，使動物凝血塊與蛋白質(zhì)沉淀劑充分接觸，過濾掉沉淀物，收集濾液；
[0011]步驟2:將濾液離心，分離血紅蛋白沉淀，取上清液加入2?8mL 0.9mol/L NaCl分3次沖洗，避免殘留，得到溶血；
[0012]步驟3:將步驟2所得溶血離心，在其中加入2mol/L NaClUmol/L ZnCljP去離子水，NaCl、ZnCl2、去離子水和步驟2所得溶血的體積比為1:1:2:5，在40?50°C下水溶20?40分鐘，取出速冷至常溫；
[0013]步驟4:將步驟3所得溶血離心，加入丙酮，使酶蛋白沉淀，丙酮與溶血的體積比為1: 2，在冰箱中靜置2?4小時，得到粗酶沉淀；
[0014]步驟5:在步驟4所得粗酶沉淀中加入質(zhì)量比為10%?20%的去離子水，充分?jǐn)噭?，裝入透析袋，加到已用pH值為7.8的0.5mmol/L磷酸鈉緩沖液平衡好的CM-S^hadexC色譜柱上吸附，透析6?10小時后，用pH值為7.8的2.5mmol/L磷酸鈉緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，用部分收集器收集；
[0015]步驟6:將步驟5所得粗酶用2.5mmol/L的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行稀釋，粗酶與磷酸鈉緩沖液的體積比為5:1，進(jìn)行兩次稀釋、兩次過濾；
[0016]步驟7:在步驟6所得濾液中加入lmol/L的CuCl2,濾液與CuCl^體積比10:1，置于冰箱中I?2天，析出的沉淀，即為濕超氧化物歧化酶；
[0017]步驟8:真空冷凍干燥即得超氧化物歧化酶產(chǎn)物。
[0018]進(jìn)一步，所述的動物凝血塊是豬、?；蜓虻哪獕K。
[0019]進(jìn)一步，步驟I中的過濾采用兩層紗布進(jìn)行過濾。
[0020]進(jìn)一步，步驟2中離心的條件為，O?4°C，5000轉(zhuǎn)/分，離心時間為10?20分鐘。
[0021]進(jìn)一步，步驟3中離心的條件為，O?4°C，5000轉(zhuǎn)/分，離心時間為30?40分鐘。
[0022]進(jìn)一步，步驟4中離心的條件為，O?4°C，3000轉(zhuǎn)/分，離心時間為50?60分鐘。
[0023]進(jìn)一步，步驟6中的兩次過濾，第一次采用紗布過濾，第二次采用濾紙過濾。
[0024]與現(xiàn)有的超氧化物歧化酶的制備方法相比，本發(fā)明方法主要具有以下幾個方面的優(yōu)點:
[0025]1、本發(fā)明方法可以用凝血塊作為制備超氧化物歧化酶的原料；現(xiàn)有的制備工藝多以動物血液為制備原料，本發(fā)明的方法可以將所取回的動物凝血塊直接使用，這樣對原料的要求就大大降低，從而更有利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
[0026]2、加入的丙酮，可以使粗酶得以沉淀，即利用冷的有機溶劑與蛋白質(zhì)短時間接觸導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀(而不變性)的性質(zhì)來沉淀蛋白質(zhì)。
[0027]3、磷酸鈉緩沖液有調(diào)節(jié)pH值的作用，可以確保超氧化物歧化酶的穩(wěn)定性增強。
[0028]4、CuCl2在超氧化物歧化酶的制備中起到催化反應(yīng)的作用，提高了超氧化物歧化酶的產(chǎn)率。

【具體實施方式】
[0029]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說明。
[0030]實施例1
[0031]取10g豬凝血塊對應(yīng)，20g蛋白質(zhì)沉淀劑，將豬凝血塊一邊攪拌一邊加入蛋白質(zhì)沉淀劑，使豬凝血塊與蛋白質(zhì)沉淀劑充分接觸，用兩層紗布進(jìn)行過濾、收集濾液；在o°c，5000轉(zhuǎn)/分條件下，將濾液離心20分鐘，取上清液加入的4mL 0.9mol/L NaCl，分3次沖洗，得到溶血；在0°C，5000轉(zhuǎn)/分條件下，將溶血離心40分鐘后，在其中加入2mol/L NaCl、lmol/L ZnCl2和去離子水，NaCl, ZnCl 2、去離子水和步驟2所得溶血的體積比為1: 1:2: 5，在40°C下，水溶40分鐘，取出速冷至常溫；在0°C，3000轉(zhuǎn)/分條件下，離心60分鐘，加入丙酮，丙酮與溶血的體積比為1:2，在冰箱中靜置4小時，得到粗酶沉淀；在粗酶沉淀中加入質(zhì)量比為10%的去離子水，充分?jǐn)噭?，裝入透析袋，加到已用pH值為7.8的2.5mmol/L磷酸鈉緩沖液平衡好的CM-S印hadexC色譜柱上吸附，透析10小時后，用pH值為7.8的2.5mmol/L磷酸鈉緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，用部分收集器收集；將部分收集器中的粗酶用2.5mmol/L的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行稀釋，粗酶與磷酸鈉緩沖液的體積比為5:1，用紗布過濾；再用體積比為20%的2.5mmol/L的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行稀釋，用濾紙過濾；在所得濾液中加入lmol/L的CuCl2，濾液與&1(:12的體積比10:1，置于冰箱中2天，析出的沉淀，即為濕超氧化物歧化酶；真空冷凍干燥得超氧化物歧化酶成品。
[0032]實施例2
[0033]取10g牛凝血塊對應(yīng)，30g蛋白質(zhì)沉淀劑，將牛凝血塊一邊攪拌一邊加入蛋白質(zhì)沉淀劑，使牛凝血塊與蛋白質(zhì)沉淀劑充分接觸，用兩層紗布進(jìn)行過濾、收集濾液；在4°C，5000轉(zhuǎn)/分條件下，將濾液離心10分鐘，取上清液加入的8mL 0.9mol/L NaCl，分3次沖洗，得到溶血；在40C，5000轉(zhuǎn)/分條件下，將溶血離心30分鐘后，在其中加入2mol/L NaCl、lmol/L ZnCl2和去離子水，NaCl, ZnCl 2、去離子水和步驟2所得溶血的體積比為1: 1:2: 5，在50°C下，水溶20分鐘，取出速冷至常溫；在4°C，3000轉(zhuǎn)/分條件下，離心50分鐘，加入丙酮，丙酮與溶血的體積比為1:2，在冰箱中靜置2小時，得到粗酶沉淀；在粗酶沉淀中加入質(zhì)量比為20%的去離子水，充分?jǐn)噭颍b入透析袋，加到已用pH值為7.8的2.5mmol/L磷酸鈉緩沖液平衡好的CM-S印hadexC色譜柱上吸附，透析6小時后，用pH值為7.8的2.5mmol/L磷酸鈉緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，用部分收集器收集；將部分收集器中的粗酶用2.5mmol/L的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行稀釋，粗酶與磷酸鈉緩沖液的體積比為5:1，用紗布過濾；再用體積比為20%的2.5mmol/L的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行稀釋，用濾紙過濾；在所得濾液中加入lmol/L的CuCl2，濾液與&1(:12的體積比10:1，置于冰箱中I天，析出的沉淀，即為濕超氧化物歧化酶；真空冷凍干燥得超氧化物歧化酶成品。
[0034]實施例3
[0035]取10g羊凝血塊對應(yīng)，25g蛋白質(zhì)沉淀劑，將羊凝血塊一邊攪拌一邊加入蛋白質(zhì)沉淀劑，使羊凝血塊與蛋白質(zhì)沉淀劑充分接觸，用兩層紗布進(jìn)行過濾、收集濾液；在2°C，5000轉(zhuǎn)/分條件下，將濾液離心15分鐘，取上清液加入的6mL 0.9mol/L NaCl，分3次沖洗，得到溶血；在2°C，5000轉(zhuǎn)/分條件下，將溶血離心35分鐘后，在其中加入2mol/L NaCl、lmol/L ZnCl2和去離子水，NaCl, ZnCl 2、去離子水和步驟2所得溶血的體積比為1: 1:2: 5，在45°C下，水溶30分鐘，取出速冷至常溫；在2°C, 3000轉(zhuǎn)/分條件下，離心55分鐘，加入丙酮，丙酮與溶血的體積比為1:2，在冰箱中靜置3小時，得到粗酶沉淀；在粗酶沉淀中加入質(zhì)量比為15%的去離子水，充分?jǐn)噭颍b入透析袋，加到已用pH值為7.8的2.5mmol/L磷酸鈉緩沖液平衡好的CM-S印hadexC色譜柱上吸附，透析8小時后，用pH值為7.8的2.5mmol/L磷酸鈉緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，用部分收集器收集；將部分收集器中的粗酶用2.5mmol/L的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行稀釋，粗酶與磷酸鈉緩沖液的體積比為5:1，用紗布過濾；再用體積比為20%的2.5mmol/L的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行稀釋，用濾紙過濾；在所得濾液中加入lmol/L的CuCl2，濾液與&1(:12的體積比10:1，置于冰箱中2天，析出的沉淀，即為濕超氧化物歧化酶；真空冷凍干燥得超氧化物歧化酶成品。
[0036]本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會意識到，這里所述的實施例是為了幫助讀者理解本發(fā)明的原理，應(yīng)被理解為本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于這樣的特別陳述和實施例。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明公開的這些技術(shù)啟示做出各種不脫離本發(fā)明實質(zhì)的其它各種具體變形和組合，這些變形和組合仍然在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種超氧化物歧化酶的制備方法，包括以下步驟: 步驟1:按每10g動物凝血塊對應(yīng)20?30g蛋白質(zhì)沉淀劑，將動物凝血塊一邊攪拌一邊加入蛋白質(zhì)沉淀劑，過濾、收集濾液； 步驟2:將濾液離心10?20分鐘，取上清液加入的2?8mL 0.9mol/L NaCl分3次沖洗，得到溶血； 步驟3:將步驟2所得溶血離心30?40分鐘，在其中加入2mol/L NaClUmol/L ZnCl2和去離子水，NaCl、ZnCl2、去離子水和步驟2所得溶血的體積比為1: 1:2: 5，在40?50°C下，水溶20?40分鐘，取出速冷至常溫； 步驟4:將步驟3所得溶血離心50?60分鐘，加入丙酮，丙酮與溶血的體積比為1: 2，在冰箱中靜置2?4小時，得到粗酶沉淀； 步驟5:在步驟4所得粗酶沉淀中加入質(zhì)量比為10%?20%的去離子水，充分?jǐn)噭颍b入透析袋，加到已用pH值為7.8的2.5mmol/L磷酸鈉緩沖液平衡好的CM-S^hadexC色譜柱上吸附，透析6?10小時后，用pH值為7.8的2.5mmol/L磷酸鈉緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，用部分收集器收集； 步驟6:將步驟5所得粗酶用2.5mmol/L的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行稀釋，粗酶與磷酸鈉緩沖液的體積比為5:1，進(jìn)行兩次稀釋、兩次過濾； 步驟7:在步驟6所得濾液中加入lmol/L的CuCl2，濾液與CuCl^體積比10:1，置于冰箱中I?2天，析出的沉淀，即為濕超氧化物歧化酶； 步驟8:真空冷凍干燥即得超氧化物歧化酶產(chǎn)物。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的動物凝血塊是豬、?；蜓虻哪獕K。
3.如權(quán)利要求1所述的的制備方法，其特征在于，步驟I中的過濾采用兩層紗布進(jìn)行過濾。
4.如權(quán)利要求1所述的的制備方法，其特征在于，步驟2中離心的條件為，O?4°C，5000轉(zhuǎn)/分。
5.如權(quán)利要求1所述的的制備方法，其特征在于，步驟3中離心的條件為，O?4°C，5000轉(zhuǎn)/分。
6.如權(quán)利要求1所述的的制備方法，其特征在于，步驟4中離心的條件為，O?4°C，3000轉(zhuǎn)/分。
7.如權(quán)利要求1所述的的制備方法，其特征在于，步驟6中的兩次過濾，第一次采用紗布過濾，第二次采用濾紙過濾。
【文檔編號】C12N9/02GK104450636SQ201410834602
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月29日
【發(fā)明者】楊正君 申請人:成都市真陽子生物科技有限公司