用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒及方法
【專利摘要】一種用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，包括分別裝有RNA提取液、漂洗液、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、特異性鑒別引物、陰性對照品、陽性對照品并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或試劑管，其中的特異性鑒別引物的核苷酸序列如下：上游引物：5’-AACRCCCAGGCGACTTCAG-3’；下游引物：5’-TCTCATTAGGAGCAGTTCTTACAC-3’。本發(fā)明設(shè)計(jì)的試劑盒及方法不僅特異、準(zhǔn)確、靈敏，且具有簡便、快速的特點(diǎn)，一次可鑒別三種不同的豬繁殖與呼吸綜合征病毒類型，并解決了以往方法可能存在的漏檢問題。
【專利說明】用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)，特別涉及一種用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒 及方法。 技術(shù)背景
[0002] 豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒（PRRSV)引起的一種 高度接觸性傳染病，以引起母豬繁殖障礙、仔豬和肥育豬呼吸道癥狀為主要特征。豬繁殖與 呼吸系統(tǒng)綜合征病毒（PRRSV)與多種病毒混合感染，常常伴發(fā)細(xì)菌繼發(fā)感染，且該病在全 世界范圍內(nèi)大規(guī)模的流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。該病1987年首次在美國發(fā) 現(xiàn)，當(dāng)時(shí)被稱為"豬神秘病"（mystery swine disease, MSD，之后便迅速蔓延至世界大多數(shù) 養(yǎng)豬國家。1991年Wensvoort等首次分離到該病毒，并命名為（lelystad virus, LV)，在第 10次國際病毒大會(huì)上將該病毒歸屬于新設(shè)立的動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬。1996年郭寶 清等首次從國內(nèi)PRRS血清陽性豬群中分離到PRRSV，從而證實(shí)了我國也有此病的流行（童 光志，周艷君，郝小芳等）。
[0003] 2006年夏季，我國中南部爆發(fā)了高致病性豬藍(lán)耳病，之后蔓延到全國各個(gè)省市。其 病原已確定是Nsp2基因發(fā)生連續(xù)缺失的高致病性豬藍(lán)耳病病毒變異株。高致病性豬藍(lán)耳 病能使各種年齡、各種品種的豬都感染發(fā)病，且發(fā)病率高、病死率高、治愈率較低。據(jù)農(nóng)業(yè)部 通報(bào)，2006年6月份，全國共有12個(gè)省份暴發(fā)"高致病性豬藍(lán)耳?。℉P-PRRS) "疫情28次， 因"高致病性豬藍(lán)耳病"發(fā)病生豬379. 8萬頭，死亡99. 2萬頭。2007年，有26個(gè)省份的310 個(gè)縣市發(fā)生不同程度的豬高致病性藍(lán)耳病疫情，發(fā)病豬31. 3萬頭，死亡8. 2萬頭。近年來， 疫病形勢依然嚴(yán)峻，嚴(yán)重地影響了我國畜牧業(yè)發(fā)展。因此，為了監(jiān)測和控制高致病性豬藍(lán)耳 病的感染，研究高致病性豬藍(lán)耳病毒變異株的快速檢測方法具有重要意義。
[0004] PRRSV傳統(tǒng)的檢測方法主要是病毒的分離培養(yǎng)鑒定，雖然該方法具有一定的特異 性和敏感性，但是PRRSV培養(yǎng)的條件苛刻，一般實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn)。同時(shí)操作繁瑣且耗時(shí)長， 不利于對大規(guī)模樣品進(jìn)行檢測。免疫學(xué)檢測PRRSV的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、間接 熒光抗體試驗(yàn)等，但都有敏感性低或特異性較差的問題。此外，上述的這些檢測方法還存在 著無法區(qū)分普通PRRSV和現(xiàn)時(shí)國內(nèi)流行的高致病性PRRSV變異株以及PRRSV疫苗毒株的局 限性。由于高致病性豬藍(lán)耳病發(fā)病率高、病程進(jìn)展快、病死率高，傳統(tǒng)的檢測方法有可能延 誤診斷和治療。因此，開發(fā)早期、快速、特異、敏感的檢測技術(shù)非常必要。
[0005] 隨著分子診斷技術(shù)的飛速發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì) 菌、微生物基因水平的研究，也給病毒的快速鑒定提供了可能。針對國內(nèi)流行的高致病性 PRRSV變異株基因組的特點(diǎn)，國內(nèi)學(xué)者建立了高致病性PRRSV RT-PCR檢測技術(shù)（童光志，周 艷君，郝曉芳.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學(xué)分析.中 國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007, 29(5) :321-326)，該方法可以擴(kuò)增PRRSV Nsp2基因，測序后通過軟 件進(jìn)行比較，看是否在NSP2處發(fā)生缺失或缺失的區(qū)域是否與報(bào)道的缺失區(qū)域相同。這種方 法雖然能夠區(qū)分普通豬藍(lán)耳病和高致病性豬藍(lán)耳病，但顯然比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適用與臨床 檢測。還有學(xué)者通過參考普通PRRSV及高致病性PRRSV變異株的Nsp2基因序列，設(shè)計(jì)一 對位于緊靠缺失區(qū)兩端的保守區(qū)的引物，其擴(kuò)增范圍覆蓋整個(gè)缺失區(qū)域，缺失毒株（高致 病性PRRSV變異株）和非缺失毒株（普通PRRSV株），預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別約230bp和 320bp，通過凝膠電泳分析可分別檢測出普通豬藍(lán)耳病和高致病性豬藍(lán)耳?。ê聲苑迹芷G 君，田志軍。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT - PCR鑒別診斷方法的建立.中國預(yù)防 獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007, 29 (9) : 705-709)。但該方法由于需要對PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交分析等后處理， 極易造成PCR產(chǎn)物污染，導(dǎo)致假陽性，不宜用于臨床診斷。
[0006] 常規(guī)的病毒血清學(xué)檢測方法普遍存在靈敏度不高的缺點(diǎn)，而一般的分子檢測病 毒，RNA提取質(zhì)量的好壞對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大，而RNA又特別容易降解，提取技術(shù)要求高；同 時(shí)，要檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的三種不同類型必須要設(shè)計(jì)不同引物對，檢測的過程 也要分開進(jìn)行，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的，就是為了解決上述問題，提供一種用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征 病毒的試劑盒及方法。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：一種用于鑒別豬繁殖與呼 吸綜合征病毒的試劑盒，包括分別裝有RNA提取液、漂洗液、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、PCR擴(kuò)增反應(yīng) 液、特異性鑒別引物、陰性對照品、陽性對照品并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或試劑管，以及分 隔并集中包裝這些試劑瓶或試劑管的包裝盒；
[0009] 所述特異性鑒別引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如下：
[0010] 上游引物：5' -AACRCCCAGGCGACTTCAG-3' ；
[0011] 下游引物：5 ' -TCTCATTAGGAGCAGTTCTTACAC-3 '。
[0012] 所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒包括PRRSV經(jīng)典毒株、PRRSV高致病性毒株，以及 PRRSV疫苗毒株TJM-F92株。
[0013] 所述RNA提取液的配方包括：
[0014] Carrier RNA，4 ?IOul ;蛋白酶 K，10 ?20ul ;十二燒基硫酸鈉，1% ?4% ; Tris_C1150 ?250mmol/L ;EDTA,0? 5 ?lmmol/L ;pH7 ?8 ;
[0015] 所述漂洗液包括漂洗液1和漂洗液2 ;
[0016] 漂洗液1的配方為：鹽酸胍，4?6mol/L ;無水乙醇，50%?70% ;蛋白酶K, 80? 100ug/ml ；
[0017] 漂洗液2為：60?80%無水乙醇。
[0018] 所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的配方包括：
[0019] 5 X RT Buffer ;2. 5mmol dNTP ;RNA 酶抑制劑（Rnase Inhibitor);逆轉(zhuǎn)錄酶 (M-MLV)。
[0020] 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的配方包括：
[0021] 10mmol dNTP Mix ； 10XTaq Buffer ；5U/ul Taq DNA Polymerase0
[0022] 所述陽性對照品包括PRRSV經(jīng)典毒株陽性對照品、PRRSV高致病性毒株陽性對照 品和PRRSV疫苗毒株TJM-F92株陽性對照品；三個(gè)陽性對照品分別含有三種特定目的基因 序列的質(zhì)粒；其中PRRSV經(jīng)典毒株陽性對照品所含質(zhì)粒的目的基因序列如SEQ ID NO. 3所 示，PRRSV高致病性毒株陽性對照品所含質(zhì)粒的目的基因序列如SEQ ID NO. 4所示，PRRSV 疫苗毒株TJM-F92株陽性對照品所含質(zhì)粒的目的基因序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0023] 基于上述試劑盒的一種鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法，包括以下步驟：
[0024] (1)、提取待測樣品病毒總RNA ;
[0025] (2)、樣品病毒總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA ;
[0026] (3)、以樣品cDNA為模板，加入特異性鑒別引物和PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，若電泳結(jié)果出現(xiàn)1879bp特異性條帶，則表示樣品中含有 PRRSV經(jīng)典毒株；若樣品中出現(xiàn)1789bp條帶，則表示樣品中含有PRRSV高致病性毒株；若電 泳結(jié)果出現(xiàn)1429bp條帶，則表示樣品中含有PRRSV疫苗毒株TJM-F92株；若陽性對照溶液 出現(xiàn)條帶而待檢樣品無條帶的為待檢樣品陰性；兩者均無條帶或待檢樣品出現(xiàn)條帶而陽性 對照溶液無條帶的需重新檢測并判定。
[0027] 所述樣品取自豬的血液、唾液、肺臟、肝臟、腎臟、淋巴結(jié)、扁桃體、腦組織、糞便、精 液、尿液、豬場內(nèi)外環(huán)境表面拭子、空氣、PRRSV疫苗以及與PRRSV相關(guān)的樣品。
[0028] 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：95°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒，53°C退火1分 鐘，72 °C延伸90秒，循環(huán)次數(shù)為38次，72 °C再延伸10分鐘。
[0029] 本發(fā)明設(shè)計(jì)的試劑盒及方法不僅特異、準(zhǔn)確、靈敏，且具有簡便、快速的特點(diǎn)，一次 可鑒別三種不同的豬繁殖與呼吸綜合征病毒類型，并解決了以往方法可能存在的漏檢問 題。人工污染試驗(yàn)檢測結(jié)果表明，該系統(tǒng)亦適合于組織樣品中PRRSV的直接檢測，具有快 速、特異和簡便的特點(diǎn)。本發(fā)明還涉及針對NSP2的基因的引物設(shè)計(jì)、PCR反應(yīng)條件以及應(yīng) 用此試劑盒進(jìn)行組織樣品的檢測方法。
[0030] 本發(fā)明建立的PCR方法可同時(shí)擴(kuò)增出NSP2基因上種豬繁殖與呼吸綜合征病毒的 三種類型（經(jīng)典毒株、高致病性毒株、疫苗毒株），但對其它4種豬常見病毒均未擴(kuò)增出任何 條帶，表明該檢測系統(tǒng)具有很強(qiáng)的特異性。測序同源性均在98. 67%-100%，進(jìn)一步反應(yīng)了 該系統(tǒng)具有很好的準(zhǔn)確性及特異性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1為質(zhì)控樣品擴(kuò)增條帶。
[0032] 具體實(shí)施方法
[0033] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0034] 1、材料與方法
[0035] I. 1陽性對照選取豬繁殖與呼吸綜合征的三種活疫苗：豬繁殖與呼吸綜合征活 疫苗CH-IR株購自上海海利生物藥品有限公司；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗 JXAl-R株購自廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫 苗TJM-F92株購自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司。陰性對照使用豬圓環(huán)病毒2型滅 活疫苗SH株購自普萊柯生物工程股份有限公司；豬偽狂犬病活疫苗Bartha-K61株購自云 南生物制藥有限公司；豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）購自洛陽普萊柯生物工程股份有限公司；豬 乙型腦炎活疫苗SA14-14-2株購自中牧實(shí)業(yè)股份有限公司成都藥械廠?？瞻讓φ帐褂秒p蒸 水。
[0036] I. 2提取待測樣品病毒總RNA
[0037] 1. 2. 1取已處理好的樣品、陰性對照和陽性對照各200ul，分別加入RNA提取液 250ul，充分顛倒混勻，56°C水浴10?15min。
[0038] 1. 2. 2將液體吸入已套好收集管的吸附柱中，8000rpm離心lmin。
[0039] 1. 2. 3棄去收集管中液體，加入600ul漂洗液1，12000rpm離心30s。
[0040] 1. 2. 4棄去收集管中液體，加入500ul漂洗液2,12000rpm離心30s。
[0041] 1. 2. 5棄去收集管中液體，12000rpm空柱離心2min，以除去殘留的洗脫液。
[0042] 1.2. 6將吸附柱移入新的1.5ml離心管中，向柱中央加入CldH2O 20?50ul，室溫 靜置3?5min，12000rpm離心lmin，離心管中液體即為模板RNA。
[0043] 1. 3病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄
[0044] 1. 3. 1在PCR反應(yīng)管中依次加入Iul下游引物、17ulRNA模板、7ul逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液， 震蕩混勻，短暫離心。
[0045] 1. 3. 2按以下反應(yīng)條件在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：42°C逆轉(zhuǎn)錄45min?60min，即為 cDNA。
[0046] 1.4PCR 擴(kuò)增
[0047] 1.4. 1在PCR反應(yīng)管中依次加入Iii L上游引物、Iii L下游引物、2 ii L待檢樣品、 6 ii LPCR擴(kuò)增反應(yīng)液及10 ii L ddH20,震蕩混勻，離心數(shù)秒。
[0048] 1. 4. 2將1. 4. 1按以下反應(yīng)條件在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增：95°C預(yù)變性5分鐘，94°C變 性30秒，53 °C退火1分鐘，72 °C延伸90秒，循環(huán)次數(shù)為38次，72 °C再延伸10分鐘。
[0049] 1. 4. 3將1. 4. 2反應(yīng)后的產(chǎn)物使用1. 5%瓊脂糖凝膠，在IXTAE緩沖液中電泳，用 凝膠成像系統(tǒng)分析。
[0050] I. 4. 4PCR產(chǎn)物的測序及分析按1. 4所述步驟加樣后進(jìn)行PCR檢測，并將PCR產(chǎn)物 割膠回收測序。
[0051] 1. 4. 5特異性試驗(yàn)使用I. 1中的空白對照，用建立的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。
[0052] 2、結(jié)果
[0053] 2. 1通過優(yōu)化的鑒別引物，豬繁殖與呼吸障礙綜合征活疫苗CH-IR株出現(xiàn)1879bp 條帶；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗JXAl-R株出現(xiàn)1789bp條帶；高致病性豬繁殖 與呼吸綜合征活疫苗TJM-F92株出現(xiàn)1429bp條帶。質(zhì)控樣品擴(kuò)增條帶如圖1所示，圖中 所示，A為PRRSV經(jīng)典毒株陽性對照品；B為PRRSV高致病性毒株陽性對照品；C為PRRSV 疫苗毒株TJM-F92株陽性對照品；D為陰性對照品；Mark為對比參照條帶，從上到下依次為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
[0054] 2. 2PCR產(chǎn)物的測序鑒定：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過TA克隆、測序后在NCBI上進(jìn)行 BLAST對比，結(jié)果顯示，與NSP2已知經(jīng)典毒株序列（CH-1R、VR2332等）比對同源性為 98. 67%-100% ;與已知高致病性毒株序列（JXAUHuN等）的同源性為99. 62%-100% ;與 已知高致病性疫苗毒株序列（TJ)的同源性為99. 52%。表明該P(yáng)CR反應(yīng)系統(tǒng)具有很好的準(zhǔn) 確性。
[0055] 2. 3特異性試驗(yàn)：利用試劑盒分別對豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗SH株、豬偽狂犬病 活疫苗Bartha-K61株、豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）、豬乙型腦炎活疫苗SA14-14-2株為待檢樣品 檢測，結(jié)果顯示未見任何條帶，表明該P(yáng)CR反應(yīng)擴(kuò)增NSP2基因片段具有很好的特異性。
[0056] 3、討論：研究表明，針對NSP2基因設(shè)計(jì)的鑒別引物可以鑒定到豬繁殖與呼吸綜合 征毒株的三種類型，因此，針對上述基因設(shè)計(jì)的PCR引物，不僅可用于豬繁殖與呼吸綜合征 病毒的檢測，又可以進(jìn)行不同病毒類型之間的檢測。
[0057] 本試驗(yàn)建立的PCR方法可同時(shí)擴(kuò)增出NSP2基因上種豬繁殖與呼吸綜合征病毒的 三種類型（經(jīng)典型毒株、高致病性毒株、高致病性疫苗毒株），但對其它4種豬常見病毒均未 擴(kuò)增出任何條帶，表明該檢測系統(tǒng)具有很強(qiáng)的特異性。測序同源性均在98. 67%-100%，進(jìn) 一步反應(yīng)了該系統(tǒng)具有很好的準(zhǔn)確性及特異性。
[0058] 本發(fā)明設(shè)計(jì)的PCR試劑盒方法不僅特異、準(zhǔn)確、靈敏，且具有簡便、快速的特點(diǎn)，一 次可鑒別三種不同的豬繁殖與呼吸綜合征病毒類型，并解決了以往方法可能存在的漏檢問 題。人工污染試驗(yàn)檢測結(jié)果表明，該系統(tǒng)亦適合于組織樣品中PRRSV的直接檢測，具有快 速、特異和簡便的特點(diǎn)。本發(fā)明還涉及針對NSP2的基因的引物設(shè)計(jì)、PCR反應(yīng)條件以及應(yīng) 用此試劑盒進(jìn)行組織樣品的檢測方法。
[0059] 本發(fā)明中的試劑盒組成具體如下：
[0060] A管，含有2mL溶液，為豬繁殖與呼吸綜合征經(jīng)典毒株陽性對照品，保存于-20°c。 [0061] B管，含有2mL溶液，為豬繁殖與呼吸綜合征高致病性毒株陽性對照品，保存 于-20。。。
[0062] C管，含有2mL溶液，為豬繁殖與呼吸綜合征疫苗毒株TJM-F92株陽性對照品，保存 于-20。。。
[0063] D管，含有2ml溶液，為陰性對照品，保存于_20°C。
[0064] E管、F管分別為上游引物和下游引物，保存于_20°C。
[0065] G管，為RNA提取液，4°C保存。
[0066] H管，為漂洗液1，室溫保存。
[0067] I管，為漂洗液2,室溫保存。
[0068] J管,為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,保存于_20°C。
[0069] K管，含有PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，保存于_20°C。
[0070] L 管，含有 ddH20,保存于-20°C。
[0071] 加樣及檢測步驟說明：
[0072] 1提取待測樣品病毒總RNA
[0073] I. 1取已處理好的樣品、A、B、C、D各200ul，分別加入G管液體250ul，充分顛倒混 勻，56°C水浴 10 ?15min。
[0074] 1. 2將液體吸入已套好收集管的吸附柱中，8000rpm離心lmin。
[0075] 1.3棄去收集管中液體，加入600ul H管液體，12000rpm離心30s。
[0076] 1. 4棄去收集管中液體，加入500ul I管液體，12000rpm離心30s。
[0077] 1. 5棄去收集管中液體，12000rpm空柱離心3min，以除去殘留的洗脫液。
[0078] 1. 6將吸附柱移入新的I. 5ml離心管中，向柱中央加入L管液體20?50ul，室溫 靜置3?5min，12000rpm離心lmin，離心管中液體即為模板RNA。
[0079] 2病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄
[0080] 2. 1在PCR反應(yīng)管中依次加入Iul F管液體、17ulRNA模板、7ulJ管液體，震蕩混 勻，短暫離心。
[0081] 2. 2按以下反應(yīng)條件在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：42°C逆轉(zhuǎn)錄45min?60min，即為 cDNA。
[0082] 3PCR 擴(kuò)增
[0083] 3. 1在PCR反應(yīng)管中依次加入IiiL E管液體、IiiL F管液體、2iiL待檢樣品、6iiL K管液體及10 U L L管液體，震蕩混勻，簡短離心。
[0084] 3. 2將3. 1按以下反應(yīng)條件在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增：95°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30 秒，53°C退火1分鐘，72°C延伸90秒，循環(huán)次數(shù)為38次，72°C延伸10分鐘。
[0085] 3. 3將3. 2反應(yīng)后的產(chǎn)物使用1. 5%瓊脂糖凝膠，在IXTAE緩沖液中電泳，用凝膠 成像系統(tǒng)分析。
[0086] 3. 4PCR產(chǎn)物的測序及分析按上述步驟進(jìn)行PCR檢測，并將PCR產(chǎn)物割膠回收測序。
[0087]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，其特征在于：包括分別裝有RNA 提取液、漂洗液、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、特異性鑒別引物、陰性對照品、陽性對照品 并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或試劑管，以及分隔并集中包裝這些試劑瓶或試劑管的包裝盒； 所述特異性鑒別引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如下： 上游引物：5 ' -AACRCCCAGGCGACTTCAG-3 ' ； 下游引物：5' -TCTCATTAGGAGCAGITCTTACAC-3'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，其特征在于， 所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒包括PRRSV經(jīng)典毒株、PRRSV高致病性毒株，以及PRRSV疫苗 毒株TJM-F92株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，其特征在于， 所述RNA提取液的配方包括： Carrier RNA，4?10ul ;蛋白酶K，10?20ul ;十二燒基硫酸鈉，1%?4%; Tris_C1150 ?250mmol/L ;EDTA,0? 5 ?lmmol/L ;pH7 ?8。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，其特征在于， 所述漂洗液包括漂洗液1和漂洗液2 ; 漂洗液1的配方為：鹽酸胍，4?6111〇1/1^;無水乙醇，50(%?70(% ;蛋白酶1(，80?1001^/ ml ； 漂洗液2為：60?80 %無水乙醇。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，其特征在于， 所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的配方包括： 5XRT Buffer ;2. 5mmol dNTP ;RNA 酶抑制劑；逆轉(zhuǎn)錄酶。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，其特征在于， 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的配方包括： lOmmol dNTP Mix ；10XTaq Buffer ；5U/ul Taq DNA Polymerase〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，其特征在于， 所述陽性對照品包括PRRSV經(jīng)典毒株陽性對照品、PRRSV高致病性毒株陽性對照品和 PRRSV疫苗毒株TJM-F92株陽性對照品；三個(gè)陽性對照品分別含有三種特定目的基因序列 的質(zhì)粒；其中PRRSV經(jīng)典毒株陽性對照品所含質(zhì)粒的目的基因序列如SEQ ID NO. 3所示， PRRSV高致病性毒株陽性對照品所含質(zhì)粒的目的基因序列如SEQ ID NO. 4所示，PRRSV疫苗 毒株TJM-F92株陽性對照品所含質(zhì)粒的目的基因序列如SEQ ID NO. 5所示。
8. 基于權(quán)利要求1所述試劑盒的一種鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法，其特征在 于，包括以下步驟： (1) 、提取待測樣品病毒總RNA; (2) 、樣品病毒總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA ; (3) 、以樣品cDNA為模板，加入特異性鑒別引物和PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)， 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，若電泳結(jié)果出現(xiàn)1879bp特異性條帶，則表示樣品中含有PRRSV經(jīng) 典毒株；若樣品中出現(xiàn)1789bp條帶，則表示樣品中含有PRRSV高致病性毒株；若電泳結(jié)果 出現(xiàn)1429bp條帶，則表示樣品中含有PRRSV疫苗毒株TJM-F92株；若陽性對照溶液出現(xiàn)條 帶而待檢樣品無條帶的為待檢樣品陰性；兩者均無條帶或待檢樣品出現(xiàn)條帶而陽性對照溶 液無條帶的需重新檢測并判定。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法，其特征在于，所述樣 品取自豬的血液、唾液、肺臟、肝臟、腎臟、淋巴結(jié)、扁桃體、腦組織、糞便、精液、尿液、豬場內(nèi) 外環(huán)境表面拭子、空氣、PRRSV疫苗以及與PRRSV相關(guān)的樣品。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法，其特征在于，所述 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：95°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒，53°C退火1分鐘，72°C延伸90 秒，循環(huán)次數(shù)為38次，72°C再延伸10分鐘。
【文檔編號】C12Q1/70GK104450970SQ201410821987
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月22日
【發(fā)明者】馬晶晶, 張瑜, 賴 志, 吳碧清, 高俊鋒, 韓相敏 申請人:上海創(chuàng)宏生物科技有限公司