一種屎腸球菌和枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)提高生物量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種屎腸球菌和枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)的方法，兩者均為動物飼養(yǎng)中重要的益生菌，廣泛應用于飼料添加劑中作為微生物制劑。屎腸球菌為乳酸菌的一種，在發(fā)酵過程中能產(chǎn)酸和細菌素等抑菌物質(zhì)，枯草芽孢桿菌適合在中性條件下培養(yǎng)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)兩者混合培養(yǎng)的不同接種比例、裝料系數(shù)、培養(yǎng)基成分用量等對最后收獲菌體時的生物量有重大影響，經(jīng)過對培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的優(yōu)化最終獲得了能夠顯著提高二者混合培養(yǎng)總生物量的方法，本發(fā)明適合于微生態(tài)制劑的液體發(fā)酵生產(chǎn)，其優(yōu)點是將兩種不同生長生理特征的菌株進行混合培養(yǎng)，最終總生物量有了顯著提高，并且二者生物量的比例接近1:1，提高設備利用率，降低生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種屎腸球菌和枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)提高生物量的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種屎腸球菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的方法，尤其涉及一種屎腸球菌和枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)提高生物量方法，屬于生物【技術領域】。

【背景技術】
[0002]益生素(Probities)又名益生菌、活菌劑、微生態(tài)制劑等，是活的微生物飼料添加齊?。經(jīng)口或其他粘膜途經(jīng)投入，旨在改善粘膜表面微生物或酶的平衡，或者刺激特異性或非特異性免疫機制，提高飼料利用率、增強動物抗病能力和提高生產(chǎn)性能等作用。在飼料工業(yè)中人們將微生態(tài)制劑作為抗生素最有效的替代產(chǎn)品之一，寄希望于通過微生態(tài)制劑生產(chǎn)安全的畜禽產(chǎn)品，同時強化對環(huán)境的保護。2013年12月我國農(nóng)業(yè)部2045號公告公布了《飼料添加劑品種目錄(2013)》，其中針對養(yǎng)殖動物允許在其飼料中添加的微生物有地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、兩歧雙歧桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、乳酸腸球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、德式乳桿菌乳酸亞種、植物乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、沼澤紅假單胞菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、羅伊氏乳桿菌、動物雙歧桿菌、黑曲霉、米曲霉、遲緩芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、纖維二糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種。
[0003]微生態(tài)制劑根據(jù)菌株的組成又可分為單一菌劑和復合菌劑，單一菌劑的研究和開發(fā)較多，目前的發(fā)展趨勢是研制復合菌劑。復合菌劑能適應多種條件和宿主，比單一菌制劑更能促進畜禽的生長和提高飼料轉化率。目前應用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)微生態(tài)制劑中的益生菌主要是乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌。乳酸菌能發(fā)酵產(chǎn)生乳酸降低腸道PH，并且能夠分泌細菌素從而抑制致病菌的生長。芽孢桿菌能夠產(chǎn)生維生素、各種酶以及多種代謝產(chǎn)物，對飼料的降解消化吸收和動物的營養(yǎng)代謝起到促進作用。酵母菌菌體中含有非常豐富的蛋白質(zhì)、B族維生素、脂肪、糖、酶等多種營養(yǎng)成分，在提高動物免疫力、生產(chǎn)性能和減少應激等方面均有作用。
[0004]乳酸菌為兼性厭氧菌，芽孢桿菌為好氧菌，兩者的生長特性及營養(yǎng)要求差異很大，并且乳酸菌在培養(yǎng)的過程中會產(chǎn)生具有抑菌或殺菌效果的有機酸、過氧化氧、雙乙酰和細菌素，其中細菌素對革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用，影響枯草芽孢桿菌的生長，混合培養(yǎng)菌體生物量較低，因此傳統(tǒng)的工業(yè)發(fā)酵中通常采用單獨培養(yǎng)，然后再混合的生產(chǎn)工藝，由此造成設備利用率低，周期延長，生產(chǎn)成本增加，目前還沒有屎腸球菌和枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有生產(chǎn)工藝的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種屎腸球菌和枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)提高生物量的方法。
[0006]本發(fā)明方法具體步驟如下:
(I)將斜面保存的屎腸球菌菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)14h，連續(xù)增殖三代；將斜面保存的枯草芽孢桿菌菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中活化，37°C、150rpm搖床培養(yǎng)14h，連續(xù)增殖三代。
[0007](2)將活化好的屎腸球菌和枯草芽孢桿菌按體積比1:12-1:8的比例混合后，按體積百分比3-6%的比例將混合菌種接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35-42°C、裝料系數(shù)(即發(fā)酵培養(yǎng)基與容器的體積比)為1/8-1/10、150-180rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)16_20h獲得，其中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蛋白胨13.0-16.0g/L,牛肉膏13.0-16.0g/L,酵母粉6.0-8.0g/L,葡萄糖18.0-22.0g/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，檸檬酸氫二胺2.0g/L,乙酸鈉5.0g/L，硫酸鎂0.2g/L，硫酸錳 0.04g/L，pH 6.2-6.8。
[0008]上述屎腸球菌iEnteTococcus faecium)為腸球菌屬菌株，枯草芽孢桿菌{Bacillus subtilis)為芽抱桿菌屬菌株。
[0009]上述屎腸球菌和枯草芽孢桿菌的活化中所用的LB液體培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10.0g/L，酵母粉 5.0 g/L，氯化鈉(NaCl) 10.0 g/L。
[0010]上述MRS液體培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10.0g，牛肉膏10.(^，酵母粉5.(^，葡萄糖(C6H12O6.H2O) 20.0g,磷酸氫二鉀(K2HPO4.3H20) 2.0g,檸檬酸氫二胺[(NH4) 2HC6H507] 2.0g,乙酸鈉(CH3COONa.3H20) 5.0g，硫酸鎂(MgSO4.7H20) 0.2g，硫酸錳(MnSO4.H2O) 0.04g,吐溫-80 1.0mL，蒸餾水 100mL0
[0011]本發(fā)明方法，適用于微生態(tài)制劑的液體發(fā)酵生產(chǎn)，本發(fā)明利用兩種菌株的生理特點進行混合培養(yǎng)，最終總生物量有了顯著提高，比單獨培養(yǎng)時至少提高了 5倍，并且二者生物量的比例接近1:1，芽孢率也比較理想，提高設備利用率，降低生產(chǎn)成本。

【具體實施方式】
[0012]下面通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍不局限于所述內(nèi)容。
[0013]實施例1:屎腸球菌和枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)提高生物量方法中不同接種比例的比較，具體操作如下:
(I)將斜面保存的屎腸球菌菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)14h，連續(xù)增殖三代；將斜面保存的枯草芽孢桿菌菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，37°C、150rpm搖床培養(yǎng)14h，連續(xù)增殖三代。
[0014](2)將充分活化的屎腸球菌和枯草芽孢桿菌按照體積比1:12，按接種體積百分比3%的比例將混合菌種接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、裝料系數(shù)為1/10 (即每500ml的發(fā)酵瓶裝50ml的發(fā)酵培養(yǎng)基)、180rpm搖床培養(yǎng)16h收獲，對照組中二者比例為1:5，其余處理均相同。
[0015]MRS液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖(C6H12O6.H2O) 20.0g,磷酸氫二鉀(K2HPO4.3H20) 2.0g,檸檬酸氫二胺[(NH4) 2HC6H507] 2.0g,乙酸鈉(CH3COONa.3H20) 5.0g，硫酸鎂(MgSO4.7H20) 0.2g，硫酸錳(MnSO4.H2O) 0.04g,吐溫-80 1.0mT,,蒸懼水 100mL, 115°C條件滅菌 30min。
[0016]LB液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨10.(^/1，酵母粉5.(^/1，氯化鈉(似(:1) 10.0g/L,121 °C條件滅菌20min。
[0017]發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蛋白胨14.0g，牛肉膏14.0g,酵母粉7.0g，葡萄糖(C6H12O6.H2O) 20.0g,磷酸氫二鉀(K2HPO4.3H20) 2.0g,檸檬酸氫二胺[(NH4) 2HC6H507] 2.0g,乙酸鈉(CH3COONa.3H20) 5.0g，硫酸鎂(MgSO4.7H20) 0.2g，硫酸錳(MnSO4.H2O) 0.04g，蒸餾水 100mL, pH 6.5。
[0018]采用平板稀釋涂布法檢測，得知試驗組發(fā)酵液中屎腸球菌與枯草芽孢桿菌活菌數(shù)分別達到3.91 X 1010CFU/mL和2.92 X 1010CFU/mL, 二者的生物量接近1:1。對照組屎腸球菌與枯草芽孢桿菌活菌數(shù)分別2.89X1010CFU/mL和1.41 X 1010CFU/mL,對照組生物量低于試驗組，且兩種菌體生物量的比例有所失衡。
[0019]實施例2:屎腸球菌和枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)提高生物量方法中不同裝液量的比較，具體操作如下:
(I)將斜面保存的屎腸球菌菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)14h，連續(xù)增殖三代；將斜面保存的枯草芽孢桿菌菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，37°C、150rpm搖床培養(yǎng)14h，連續(xù)增殖三代。
[0020](2)將充分活化的屎腸球菌和枯草芽孢桿菌按照體積比1:12，按接種體積百分比3%的比例將混合菌種接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、裝料系數(shù)為1/10 (即每500ml的發(fā)酵瓶裝50ml的發(fā)酵培養(yǎng)基)、180rpm搖床培養(yǎng)16h收獲，對照組的裝液量為150/500mL，其余處理相同。
[0021]MRS液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖(C6H12O6.H2O) 20.0g,磷酸氫二鉀(K2HPO4.3H20) 2.0g,檸檬酸氫二胺[(NH4) 2HC6H507] 2.0g,乙酸鈉(CH3COONa.3H20) 5.0g，硫酸鎂(MgSO4.7H20) 0.2g，硫酸錳(MnSO4.H2O) 0.04g,吐溫-80 1.0mL,蒸懼水 100mL, 115°C條件滅菌 30min。
[0022]LB液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨10.(^/1，酵母粉5.(^/1，氯化鈉(似(:1) 10.0g/L,121 °C條件滅菌20min。
[0023]發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蛋白胨14.0g，牛肉膏14.0g、酵母粉7.0g，葡萄糖(C6H12O6.H2O) 20.0g,磷酸氫二鉀(K2HPO4.3H20) 2.0g,檸檬酸氫二胺[(NH4) 2HC6H507] 2.0g,乙酸鈉(CH3COONa.3H20) 5.0g，硫酸鎂(MgSO4.7H20) 0.2g，硫酸錳(MnSO4.H2O) 0.04g，蒸餾水 100mL, pH 6.5。
[0024]采用平板稀釋涂布法檢測，得知試驗組發(fā)酵液中屎腸球菌與枯草芽孢桿菌活菌數(shù)分別達到3.91 X 1010CFU/mL和2.92 X 1010CFU/mL,對照組屎腸球菌與枯草芽孢桿菌活菌數(shù)分別8.98 X 109CFU/mL和5.23 X 109CFU/mL,對照組兩種菌的生物量都明顯低于試驗組，且兩種菌體生物量的比例有所失衡。
[0025]實施例3:屎腸球菌和枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)提高生物量方法中培養(yǎng)基成分不同用量的比較，具體操作如下
(I)將斜面保存的屎腸球菌菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)14h，連續(xù)增殖三代；將斜面保存的枯草芽孢桿菌菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，37°C、150rpm搖床培養(yǎng)16h，連續(xù)增殖三代。
[0026](2)將充分活化的屎腸球菌和枯草芽孢桿菌按照體積比1:12，按接種體積百分比3%的比例將混合菌種接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、裝料系數(shù)為1/10 (即每500ml的發(fā)酵瓶裝50ml的發(fā)酵培養(yǎng)基)、180rpm搖床培養(yǎng)16h收獲。
[0027]MRS液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖(C6H12O6.H2O) 20.0g,磷酸氫二鉀(K2HPO4.3H20) 2.0g,檸檬酸氫二胺[(NH4) 2HC6H507] 2.0g,乙酸鈉(CH3COONa.3H20) 5.0g，硫酸鎂(MgSO4.7H20) 0.2g，硫酸錳(MnSO4.H2O) 0.04g,吐溫-80 1.0mT,,蒸懼水 100mL, 115°C條件滅菌 30min。
[0028]LB液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨10.(^/1，酵母粉5.(^/1，氯化鈉(似(:1) 10.0g/L,121 °C條件滅菌20min。
[0029]發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蛋白胨14.0g，牛肉膏14.0g,酵母粉7.0g，葡萄糖(C6H12O6 -H2O) 20.0g,磷酸氫二鉀(K2HPO4.3H20) 2.0g,檸檬酸氫二胺[(NH4) 2HC6H507] 2.0g,乙酸鈉(CH3COONa.3H20) 5.0g，硫酸鎂(MgSO4.7H20) 0.2g，硫酸錳(MnSO4.H2O) 0.04g，蒸餾水1000mL,pH 6.5。對照組的發(fā)酵培養(yǎng)基用量為蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，其余處理相同。
[0030]采用平板稀釋涂布法檢測，得知試驗組發(fā)酵液中屎腸球菌與枯草芽孢桿菌活菌數(shù)分別達到3.91 X 1010CFU/mL和2.92 X 1010CFU/mL, 二者的生物量接近1:1。對照組屎腸球菌與枯草芽孢桿菌活菌數(shù)分別2.47X1010CFU/mL和8.69 X 109CFU/mL,對照組中枯草芽孢桿菌生物量明顯低于試驗組，且兩種菌體生物量的比例失衡較大。
[0031]同時對屎腸球菌和枯草芽孢桿菌分別進行單獨培養(yǎng)試驗，培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基，其余處理條件和混合培養(yǎng)相同，分別進行靜置和搖床培養(yǎng)16h后，屎腸球菌和枯草芽孢桿菌活菌數(shù)分別為1.35X1010CFU/mL和5.07 X 109CFU/mL,相比混合培養(yǎng)時的活菌數(shù)量，單獨培養(yǎng)的活菌數(shù)明顯比較少，且混合培養(yǎng)時的總生物量6.83X1010CFU/mL是單獨培養(yǎng)時屎腸球菌生物量1.35X1010CFU/mL的5倍。
[0032]實施例4:屎腸球菌和枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)提高生物量的方法，是將活化好的屎腸球菌和枯草芽孢桿菌按體積比1:10的比例混合后，按體積百分比4%的比例將混合菌種接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35°C、裝料系數(shù)為1/8 (即每500ml的發(fā)酵瓶裝62.5ml的發(fā)酵培養(yǎng)基)的條件下，150rpm搖床培養(yǎng)20h獲得，其中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蛋白胨13.0g，牛肉膏16.0g,酵母粉6.0g,葡萄糖22.0g,磷酸氫二鉀2.0g,檸檬酸氫二胺2.0g,乙酸鈉5.0g,硫酸鎂 0.2g，硫酸錳 0.04g，蒸餾水 100mL，pH 6.2。
[0033]采用平板稀釋涂布法檢測，混合發(fā)酵液中屎腸球菌與枯草芽孢桿菌活菌數(shù)分別達到 2.97X 1010CFU/mL 和 1.89 X 1010CFU/mL。
[0034]同時對屎腸球菌和枯草芽孢桿菌分別進行單獨培養(yǎng)試驗，培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基，其余處理和混合培養(yǎng)相同，分別進行靜置和搖床培養(yǎng)16h后，屎腸球菌和枯草芽孢桿菌活菌數(shù)分別為9.44X 109CFU/mL和4.18X 109CFU/mL，混合培養(yǎng)時的活菌數(shù)量明顯多于單獨培養(yǎng)。
[0035]實施例5:屎腸球菌和枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)提高生物量的方法，是將活化好的屎腸球菌和枯草芽孢桿菌按體積比1:8的比例混合后，按體積百分比6%的比例將混合菌種接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中，在42°C、裝料系數(shù)為1/9 (即每500ml的發(fā)酵瓶裝55.6ml的發(fā)酵培養(yǎng)基)的條件下170rpm搖床培養(yǎng)17h獲得，其中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蛋白胨16.0g，牛肉膏
13.0g,酵母粉8.0g,葡萄糖18.0g,磷酸氫二鉀2.0g,檸檬酸氫二胺2.0g,乙酸鈉5.0g,硫酸鎂 0.2g，硫酸錳 0.04g，蒸餾水 100mL，pH 6.8。
[0036]采用平板稀釋涂布法檢測，混合發(fā)酵液中屎腸球菌與枯草芽孢桿菌活菌數(shù)分別達到 3.82X1010CFU/mL 和 2.66 X 10lclCFU/mL，二者的生物量接近 1:1。
[0037]同時對屎腸球菌和枯草芽孢桿菌分別進行單獨培養(yǎng)試驗，培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基，其余處理和混合培養(yǎng)相同，分別進行靜置和搖床培養(yǎng)16h后，屎腸球菌和枯草芽孢桿菌活菌數(shù)分別為1.07X1010CFU/mL和4.96X 109CFU/mL,相比混合培養(yǎng)時的活菌數(shù)量，屎腸球菌和枯草芽孢桿菌單獨培養(yǎng)時的活菌數(shù)都有明顯差距。
【權利要求】
1.一種屎腸球菌和枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)提高生物量的方法，其特征在于:將活化好的屎腸球菌和枯草芽孢桿菌按體積比1:12-1:8的比例混合后，按體積百分比3-6%的比例將混合菌種接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35-42°C、裝料系數(shù)為1/8-1/10、150_180rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)16_20h獲得，其中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蛋白胨13.0-16.0g/L,牛肉膏.13.0-16.0g/L,酵母粉 6.0-8.0g/L,葡萄糖 18.0-22.0g/L,磷酸氫二鉀 2.0g/L,檸檬酸氫二胺 2.0g/L,乙酸鈉 5.0g/L，硫酸鎂 0.2g/L，硫酸錳 0.04g/L，pH 6.2-6.8。
【文檔編號】C12R1/46GK104371958SQ201410653601
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月18日 優(yōu)先權日:2014年11月18日
【發(fā)明者】林連兵, 胡治銘, 鄭健, 梁叢叢, 鄧先余 申請人:昆明理工大學