專(zhuān)利名稱：一株益生屎腸球菌的篩選及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸用微生物添加劑技術(shù)領(lǐng)域，與抗生素添加劑領(lǐng)域有關(guān)，本發(fā)明涉及一種對(duì)常見(jiàn)腸道致病菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌具有明顯的抑菌效果的屎腸球菌(Enterococcus faecium)菌株的分離鑒定、安全性評(píng)價(jià)、抗逆性能及益生性能鑒定及作為飼料添加劑的用途。
背景技術(shù)：
自1946年Moore首次報(bào)道在飼料中添加抗生素能明顯提高肉雞的日增重以來(lái)，先后有60余種抗生素應(yīng)用于畜牧業(yè)，在動(dòng)物疾病防治、提高畜禽生產(chǎn)性能等方面發(fā)揮了重要作用。但隨著抗生素的大量使用，特別是不科學(xué)的濫用，導(dǎo)致耐藥菌株的大量產(chǎn)生、動(dòng)物正常菌群失調(diào)、畜產(chǎn)品中藥物殘留等問(wèn)題日益突顯，嚴(yán)重危害養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展，影響人類(lèi)食品安全，引起世界各國(guó)政府及業(yè)內(nèi)人士的高度重視。在這種背景下，益生菌以其無(wú)毒、無(wú)殘 留、無(wú)抗藥性的特點(diǎn)，被認(rèn)為是規(guī)模化養(yǎng)殖中抗生素的最佳替代品(Shanahan et al,2000 ；Park et al. , 2002) 2008年，中國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布了 1126號(hào)公告，《飼料添加劑品種目錄》明確規(guī)定飼用微生物添加劑的種類(lèi)，屎腸球菌位列其中。盡管腸球菌被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及飼料行業(yè)，但其作為益生菌的使用一直是備受爭(zhēng)議的話題，爭(zhēng)議的核心是抗生素抗性基因或編碼毒力因子的基因可能轉(zhuǎn)移給胃腸道的其它微生物(Franz et al，2003)。因此，在篩選益生腸球菌時(shí)，除了要對(duì)其益生特性先行篩選外，還必須對(duì)菌株進(jìn)行毒力因子和抗生素抗性進(jìn)行檢測(cè)，以確保菌株的安全性。本發(fā)明在篩選菌株時(shí)，在國(guó)內(nèi)首次對(duì)菌株益生特性、毒力因子和抗生素抗性同時(shí)進(jìn)行考察檢測(cè)，另外還考慮菌株來(lái)源動(dòng)物品種的抗逆性能。這樣的研究思路為最終得到優(yōu)良菌株奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，分離篩選ー株既安全又有明顯益生特性的益生菌，該菌株對(duì)常見(jiàn)腸道致病菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌具有明顯的抑菌效果，經(jīng)鑒定分離得到的該益生菌株為屎腸球菌(Enterococcus faecium),對(duì)其微生物菌學(xué)特征利用16SrDNA進(jìn)行了鑒定，對(duì)其安全性、抗逆性及益生性及作為飼料添加劑的用途進(jìn)行了相關(guān)試驗(yàn)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下根據(jù)篩選目標(biāo)和益生菌的生理生化特性及遺傳學(xué)特性，以經(jīng)典的生理生化手段及現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，從抗逆性強(qiáng)的地方優(yōu)良品種“通城豬”的直腸內(nèi)容物中，經(jīng)過(guò)大量分選，分離篩選得到一株屎腸球菌菌株，申請(qǐng)人將其命名為屎腸球菌(Enterococcusfaecium)HDRsEfl,已于2011年I月24日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號(hào)為CCTCC NO :M2011031。屎腸球菌(Enterococcus faecium) HDRsEfl的菌學(xué)特性如下所述
該菌株為革蘭氏陽(yáng)性，呈單在、成雙或短鏈排列的卵圓形球菌。在KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基上為紅色，光滑凸起，周邊整齊，Imm左右大小的菌落，菌落周?chē)囵B(yǎng)基顔色由紫色變?yōu)辄S色。過(guò)氧化酶陰性。菌株能耐受6. 5% NaCl、pH9. 6的生長(zhǎng)環(huán)境；可在45°C生長(zhǎng)、60°C耐受30min、膽汁-七葉苷水解試驗(yàn)為陽(yáng)性，能水解阿拉伯糖，說(shuō)明該菌株屬于腸球菌屬屎腸球菌種；將其16S rRNA基因進(jìn)行克隆測(cè)序，結(jié)果在NCBI進(jìn)行Blastn比較，發(fā)現(xiàn)其16SrRNA與屎腸球菌(AB362603. I)的序列同源性最高，相似性為99% ;另外，從該菌基因組中擴(kuò)增出了屎腸球菌特異性片段ddlE.faeeiUffl。該菌株在酸性和高膽鹽環(huán)境中的生存能力強(qiáng)，能耐受O. 5%膽鹽，在ρΗ2· 5孵育2h后，其活菌數(shù)幾乎沒(méi)有下降；另外，該菌株對(duì)粘蛋白有明顯的粘附性(P <0.05)。由此推測(cè)，該菌株能夠抵抗胃酸和小腸中高濃度膽鹽的不利影響，粘附于腸道存活下來(lái)發(fā)揮益生作用，這在動(dòng)物試驗(yàn)中也得到證實(shí)。該菌株繁殖能力很強(qiáng)，無(wú)遲緩期，很快進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期(Oh 4h)，4h后進(jìn)入穩(wěn)定期，一直持續(xù)到18h，細(xì)菌數(shù)達(dá)到最大，為3. 50X 109CFU/mL，18h后進(jìn)入衰退期。 該菌株雖然不產(chǎn)芽胞，但對(duì)高溫的耐受能力相對(duì)較強(qiáng)，可耐受60°C，30min ；65°C，IOmin存活率大于97% ;這為該菌株作飼料添加劑的應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際奠定了良好基礎(chǔ)。該菌株對(duì)常見(jiàn)腸道致病菌(金黃色萄萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌)均有明顯的抑菌活性。用PCR方法，評(píng)價(jià)了該菌株的安全性，發(fā)現(xiàn)該菌株僅含efaAfni I個(gè)毒カ基因。對(duì)常用獸藥如氨芐西林、萬(wàn)古霉素、四環(huán)素、諾氟沙星、呋喃妥因、氯霉素敏感，而對(duì)青霉素、紅霉素表現(xiàn)耐藥；對(duì)環(huán)丙沙星表現(xiàn)中等耐藥。申請(qǐng)人:應(yīng)用將本發(fā)明的屎腸球菌HDRsEfl菌株通過(guò)液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種方式制作的微生態(tài)制劑，用作飼料添加剤，進(jìn)行了抗生素替代試驗(yàn)，對(duì)斷奶仔豬有明顯的預(yù)治腹瀉、促進(jìn)食欲，促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，達(dá)到了預(yù)期的效果，從而完成了本發(fā)明的任務(wù)。本發(fā)明的屎腸球菌具有如下優(yōu)點(diǎn)(I)菌株來(lái)源于抗逆性好的中國(guó)地方豬優(yōu)良豬種-即湖北省“通城豬”--腸道的內(nèi)容物，從大量候選菌株中分離和篩選得到，該菌株被命名為屎腸球菌HDRsEfl，其對(duì)常見(jiàn)腸道致病菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌)具有明顯的抑菌效果，為替代抗生素添加劑提供了有力依據(jù)。(2)對(duì)菌株用分子生物學(xué)的方法進(jìn)行了安全性淘選，因此安全性更高。(3)該菌株可完全耐受胃酸及腸道膽鹽高滲透壓環(huán)境，且具有粘附能力，因此可在腸道定植發(fā)揮益生作用。(4)該菌株雖然不產(chǎn)芽胞，但對(duì)高溫的耐受能力相對(duì)較強(qiáng)，可耐受60°C，30min ；65°C，IOmin存活率大于97% ;62°C，30秒制粒飼料中55%存活。90°C，30秒制粒飼料中30%存活；80°C，30秒制粒飼料中40%存活。這為該菌株作飼料添加劑的應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際打下了良好基礎(chǔ)。(5)動(dòng)物試驗(yàn)證明，可替代抗生素作畜禽飼料添加劑使用，生產(chǎn)及使用均十分簡(jiǎn)單，不僅可提高畜禽生產(chǎn)性能，更具有環(huán)境友好，對(duì)人畜安全的優(yōu)點(diǎn)。將其制備為益生菌制劑，替代豬飼料中的抗生素添加劑，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)起防病促生長(zhǎng)作用，大大削減豬飼料中的抗生素所造成的對(duì)環(huán)境的破壞以及人類(lèi)身體健康的影響，同進(jìn)減少細(xì)菌抗藥性的產(chǎn)生，以實(shí)現(xiàn)畜牧業(yè)、人類(lèi)和環(huán)境的和諧、可持續(xù)發(fā)展。
更詳細(xì)的技術(shù)方案見(jiàn)《具體實(shí)施方案》的內(nèi)容。


序列表SEQ ID NO 1是本發(fā)明分離株屎腸球菌株HDRsEfl的16S rDNA基因部分序列。圖I :是本發(fā)明分離篩選的屎腸球菌株在KF鏈球菌瓊脂平板上的生長(zhǎng)狀態(tài)。圖IA是空白KF鏈球菌瓊脂平板；圖1B.是屎腸球菌株在KF鏈球菌瓊脂平板上長(zhǎng)成紅色菌落，菌落周?chē)呐囵B(yǎng)基變成紅色。圖2 :是本發(fā)明分離篩選的屎腸球菌株革蘭氏染色陽(yáng)性反應(yīng)(X 1000)圖3 :16S rRNA基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果。 圖中各泳道M DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I :陰性對(duì)照；泳道2 :本發(fā)明菌株；泳道3 HB6腸球菌分離株；泳道4 TC12腸球菌分離株；泳道5 TC13腸球菌分離株圖4屎腸球菌的種特異性基因ddlE.faeeimi的PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果。圖中各泳道M DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I :屎腸球菌HDRsEfl株。圖5是本發(fā)明菌株發(fā)酵上清液對(duì)常見(jiàn)腸道致病菌的體外抑菌性試驗(yàn)結(jié)果。圖5A :對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抑菌性試驗(yàn)；圖5B :對(duì)大腸桿菌的體外抑菌性試驗(yàn)；圖5C :對(duì)沙門(mén)氏菌的體外抑菌性試驗(yàn)。圖6 :屎腸球菌HDRsEfl毒力因子efaAfmPCR檢測(cè)結(jié)果。圖中各泳道M DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I :屎腸球菌HDRsEfl。圖7 :是屎腸球菌TC3的生長(zhǎng)曲線。圖8 cylA的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中各泳道M DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I :HB6腸球菌分離株；泳道2 TC12腸球菌分離株；泳道3 TC13腸球菌分離株。圖9 :esp的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中各泳道M DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I :HB6腸球菌分離株；泳道2 TC12腸球菌分離株；泳道3 TC13腸球菌分離株。 圖10 agg的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中各泳道M DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I :TC12腸球菌分離株。圖11 : ef aAf s的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中各泳道M DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I :HB6腸球菌分離株；泳道2 TC12腸球菌分離株；泳道3 TC13腸球菌分離株。
具體實(shí)施方案實(shí)施例I :益生菌菌株的分離和鑒定一、菌株的分離樣品取自100日齡、21日齡中國(guó)地方豬品種湖北“通城豬”(品種來(lái)源于湖北省通城縣保種場(chǎng))，用滅菌棉拭子從肛門(mén)采集豬的直腸內(nèi)容物。樣品采集后，用棉拭子在KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基(購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司)中劃線培養(yǎng)，37°C、24h 48h培養(yǎng)后，選取紅色，光滑凸起，周邊整齊，Imm左右大小的菌落做純培養(yǎng)。將純培養(yǎng)物經(jīng)菌落形態(tài)的觀察、革蘭氏染色、過(guò)氧化酶試驗(yàn)進(jìn)行初歩篩選。細(xì)菌呈單個(gè)、成雙或短鏈排列的卵圓形革蘭陽(yáng)性球菌及過(guò)氧化酶試驗(yàn)陰性的菌株，均傳代保存。該發(fā)明的菌株在KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性見(jiàn)圖I，其革蘭氏染色特性見(jiàn)圖2。ニ、屬的鑒定將上述分離的菌株(以下簡(jiǎn)稱分離株)進(jìn)行6. 5% NaCl生長(zhǎng)試驗(yàn)、pH9. 6肉湯生長(zhǎng)試驗(yàn)、45°C生長(zhǎng)試驗(yàn)、60°C，30min生長(zhǎng)試驗(yàn)、膽汁-七葉苷水解試驗(yàn)。能耐受6. 5% NaCl、在pH9. 6肉湯中生長(zhǎng)、45°C能存活、60°C作用30min能存活、膽汁-七葉苷水解陽(yáng)性的菌株即定為腸球菌屬細(xì)菌。具體步驟是(I)耐6. 5% NaCl試驗(yàn)取幼齡分離株接種在適宜生長(zhǎng)的含6. 5% NaCl的TSB培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)BD公司)試管中，37°C培養(yǎng)24h，與未接種的對(duì)照管對(duì)比，目測(cè)生長(zhǎng)情況?；鞚峒礊殛?yáng)性，否則為陰性。
(2)pH9. 6肉湯生長(zhǎng)試驗(yàn)將分離株接種于pH9. 6TSB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基變混濁為陽(yáng)性，否則為陰性。(3)45°C生長(zhǎng)試驗(yàn)用接種環(huán)吊起ー環(huán)24h培養(yǎng)的液體培養(yǎng)物，接入清亮的BHI肉湯中，45°C恒溫水浴培養(yǎng)，培養(yǎng)基變混濁為陽(yáng)性，否則為陰性。重復(fù)該試驗(yàn)3次，結(jié)果相同才確認(rèn)。(4) 60V，30min生長(zhǎng)試驗(yàn)挑取幼齡菌落，接種于TSA斜面，60V培養(yǎng)30min后，轉(zhuǎn)入37°C培養(yǎng)24h，有菌落生長(zhǎng)判為陽(yáng)性。(5)膽汁七葉苷水解試驗(yàn)將分離株接種于膽汁七葉苷培養(yǎng)基中，37°C孵育18_24h后，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基完全變黑為陽(yáng)性，不變黑為陰性。經(jīng)過(guò)上述腸球菌屬試驗(yàn)，篩選到4株腸球菌菌株，申請(qǐng)人將其分別命名為HB6，TC12, TC13, HDRsEfl。三、對(duì)分離株進(jìn)行種的初步鑒定對(duì)篩選出的4株腸球菌菌株HB6，TC12，TC13，HDRsEfl進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，對(duì)抑菌效果較明顯的菌株，通過(guò)一系列的生化實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一歩進(jìn)行種的鑒定。包括葡萄糖、木糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖、精氨酸雙水解酶。將鑒定結(jié)果(見(jiàn)表I)與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠等，2001)中關(guān)于腸球菌屬種間鑒別的描述相對(duì)照，初步確定分離株HDRsEfl是屎腸球菌。表I屎腸球菌株HDRsEfl生化鑒定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種分離篩選的對(duì)致病金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌具有明顯的抑菌效果的屎腸球菌菌株，其特征在于，所述的菌株是屎腸球菌菌株(Enterococcus faecium)HDRsEfl，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號(hào)為CCTCC NO :M2011031。
權(quán)利要求I所述的屎腸球菌菌株在制備畜禽飼用微生物添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于獸用微生物添加劑制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分離篩選的對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物常見(jiàn)腸道致病菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌具有明顯的抑菌效果的屎腸球菌菌株及應(yīng)用。本發(fā)明的特征在于，所述的菌株是屎腸球菌菌株(Enterococcus faecium)HDRsEf1，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號(hào)為CCTCC NOM2011031。該菌株具有生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)酸能力高，抗逆性強(qiáng)，安全、抗病和促生長(zhǎng)特點(diǎn)，可用作畜禽飼用微生物添加劑。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102747003SQ20111045208
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者劉梅, 周祖濤, 李自力, 畢丁仁, 熊嬡嬡, 王喜亮, 石德時(shí), 肖宏德, 肖運(yùn)才, 許光勝, 許青榮, 郝曉莉, 高曉聰 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 武漢華大瑞爾科技有限公司