專利名稱：糞腸球菌cms－h(huán)001及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及糞腸球菌的新的菌株以及該菌株的應用。
背景技術(shù)：
幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)感染是人類最常見的感染之一，感染率在全球人口中達50％以上。1982年Warren和Marshall從人胃黏膜標本中成功培養(yǎng)出幽門螺桿菌，并確定HP為胃炎和消化性潰瘍的致病菌以來，改變了慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)性淋巴瘤(MALT)的治療和胃癌的預防格局，已將上述四種疾病定為HP相關(guān)性疾病。大量研究表明，HP感染是慢性活動性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，與胃癌及胃黏膜相關(guān)性淋巴瘤(MALT)的關(guān)系非常密切，并于1996年被世界衛(wèi)生組織確認為一級致癌原。根除HP治療可以降低胃疾病的發(fā)生率。目前國內(nèi)外治療Hp感染的標準方案根除HP感染是以質(zhì)子泵抑制劑(PPI)和(或)鉍劑加上兩種抗生素的“三聯(lián)”或“四聯(lián)”療法(MalfertHeiner P，MegraudF，O’Morain C et al.Current concepts in the management of Helicobacterpylori infection-tHe Maastricht 2-2000 Consensus Report.AlimentaryPharmacology and Therapeutics 2002；16167-180)。用抗生素抑殺HP取得了滿意的療效并縮短了治療時間。
盡管目前用抗生素抑殺HP非常有效，但費用較昂貴，且人們必須承受抗生素帶來的危害也相當大。隨著抗生素的聯(lián)合廣泛使用，HP耐藥菌株增多，抗生素使用的種類、時間和量將隨之增加，這將引起如下危害1、大量長時間和聯(lián)合多種抗生素，對人體的毒副作用將增大；2、菌株變異和耐藥菌株增多，變異的菌株將不僅只限于HP；3、其他腔部和皮膚的微生態(tài)破壞，導致各腔道自凈功能降低，使其他粘膜萎縮相關(guān)性疾病甚至腫瘤的發(fā)生率增加?？股芈?lián)合大量應用，會產(chǎn)生抗生素相關(guān)性腹瀉、腸道菌群失調(diào)、甚至產(chǎn)生偽膜性腸炎等一系列問題，使療效下降，患者依從性降低，停藥后易復發(fā)和再感染等缺陷，及耐藥菌株的迅速增加更使根除率下降。因此尋找非抗生素治療HP勢在必行。
Adamasson等(Nomura A，Stemmermann GN，Chyou PH，Kato I，Perez-Perez GI.Blaser MJ.Helicobacter pylori infection and gastric carcinomaamong Japanese Americans in Hawaii.N Engl J Med 1991；3251132-1136.)報道了幾例使用抗生素治療Hp導致的菌群失調(diào)口腔內(nèi)出現(xiàn)抗藥性鏈球菌和葡萄球菌；胃粘膜中細菌數(shù)增加，且出現(xiàn)抗藥性共生菌；腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境的改變最明顯，抗藥性腸道球菌、腸桿菌、類桿菌在治療后都有所增加。故尋求一種毒副作用少，病人容易接受的治療方法成為目前醫(yī)學研究中的熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了解決以上問題，提供一種能有效治療幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)感染的新的糞腸球菌菌株及其在制備藥物等方面的應用。
本發(fā)明的再一目的是提供含有上述菌株的幽門螺桿菌抑制劑、藥物組合物、食品、保健品及食品添加劑。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開了一種糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CMS-H001，其保藏號為CCTCC No.M 206108。
本發(fā)明還公開了幽門螺桿菌抑制劑，所述抑制劑含有保藏號為CCTCCNo.M 206108的糞腸球菌CMS-H001。
本發(fā)明還公開了所述的糞腸球菌CMS-H001在制備用于治療幽門螺桿菌感染導致的疾病的藥物中的應用。
具體的，所述疾病為胃病。
或者具體的，所述疾病為慢性胃炎。
或者具體的，所述疾病為消化性潰瘍。
或者具體的，所述疾病為胃黏膜相關(guān)性淋巴瘤。
或者具體的，所述疾病為胃癌。
本發(fā)明進一步公開了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有藥學有效劑量的上述的糞腸球菌CMS-H001。
本發(fā)明還公開了一種食品，所述食品含有上述的糞腸球菌CMS-H001。
優(yōu)選的，所述食品為飲料。
本發(fā)明進一步公開了一種保健品，所述保健品包含上述的糞腸球菌CMS-H001。
本發(fā)明進一步公開了一種食品添加劑，所述食品添加劑包含上述的糞腸球菌CMS-H001。
本發(fā)明的糞腸球菌CMS-H001，是一種分離的全新的菌株，該菌株在體內(nèi)、體外均能夠有效拮抗幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)；且對酸和膽汁都有良好的耐受性；能減輕HP感染引起的黏膜慢性炎癥損傷，減少淋巴細胞、漿細胞的浸染，對HP的根除率達到75％-87.5％，與現(xiàn)階段常規(guī)的PPI三聯(lián)療法比較差異無顯著性。本發(fā)明的新的菌株可用于治療HP感染與HP相關(guān)性疾病，如慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)性淋巴瘤和胃癌。
保藏信息菌株名稱糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CMS-H001保藏日期2006年10年23日保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏編號CCTCC No.M 206108


圖1為本發(fā)明糞腸球菌CMS-H001在光鏡下的形態(tài)圖。
圖2為本發(fā)明糞腸球菌CMS-H001的5000×倍掃描電鏡圖像。
圖3為本發(fā)明糞腸球菌CMS-H001的20000×倍掃描電鏡圖像圖4為本發(fā)明糞腸球菌CMS-H001的6000×倍透射電鏡圖。
圖5為本發(fā)明糞腸球菌CMS-H001的12000×倍透射電鏡圖。
圖6為實施例2中的胃體、胃竇損傷積分直方圖，A代表胃體損傷積分直方圖，B代表胃竇損傷積分直方圖。
圖7為實施例2中Giemsa染色細菌記數(shù)積分的直方圖，A代表胃體Hp積分直方圖，B代表胃竇Hp積分直方圖。
圖8為實施例2中各治療組胃粘膜改良Giemsa染色圖，空白對照組(A)胃小凹內(nèi)未見明顯桿菌，模型組(B)可見大量桿菌黏附；而糞腸球菌CMS-H001治療組(C)和PPI治療組(D)則僅可見少量桿菌黏附(Giemsa染色，×1000)。
圖9為實施例2中模型組胃組織勻漿染色結(jié)果圖，A、B分別為模型組胃組織勻漿涂片和勻漿組織細菌培養(yǎng)的HE染色光鏡下形態(tài)，均可見Gram’s染色陰性細菌，呈彎曲桿菌或弧形(Gram’s染色，油鏡)。
具體實施例方式
微生態(tài)學研究正常微生物群與其宿主的相互關(guān)系，微生態(tài)療法應用可拮抗病原菌活性的活菌制劑來治療細菌感染，作用特異、直接、長久，無明顯毒副作用。微生態(tài)調(diào)節(jié)劑——益生菌通過提高某些有利于健康的細菌的數(shù)量和活性，重建菌群平衡而對宿主起有益作用。常見的益生菌主要包括乳桿菌、乳酸鏈球菌、雙歧桿菌等，這些細菌是健康人胃腸道的正常菌群，其代謝產(chǎn)物中含有乙酸、乳酸、過氧化氫等，對病原菌有一定的拮抗作用。另外，這些細菌能夠產(chǎn)生多種細菌素，有高度特異的抑菌或殺菌作用。因此益生菌通過多種途徑拮抗病原菌，減少了耐藥性的發(fā)生，為治療細菌感染性疾病提供了新的途徑。
本發(fā)明的新的菌株糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CMS-H001，是一種益生菌，能夠有效拮抗幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)，可用于治療HP感染與HP相關(guān)性疾病，如慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)性淋巴瘤和胃癌。
本發(fā)明的新的菌株糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CMS-H001，已經(jīng)于2006年10年23日在位于中國武漢市的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)進行了保藏，保藏號為CCTCC No.M 206108。
本發(fā)明的糞腸球菌CMS-H001菌株在EC培養(yǎng)基上為醬紫色扁平菌落，直徑1～2毫米，邊緣齊，表面光滑，光鏡下表現(xiàn)為革蘭氏染色陽性球菌；掃描電鏡和透射電鏡下呈球狀或串珠狀，無芽孢球菌，胞壁結(jié)構(gòu)完整，無芽生現(xiàn)象，胞質(zhì)均勻。菌株代謝終產(chǎn)物中，VFA主要為乙酸，NVFA主要為乳酸，以及少量琥鉑酸。
在糞腸球菌CMS-H001菌株的體外拮抗Hp試驗中發(fā)現(xiàn)，高壓滅菌的和過濾除菌的糞腸球菌CMS-H001上清液無抑制Hp作用，而糞腸球菌CMS-H001培養(yǎng)上清液則有明顯的拮抗Hp作用，說明糞腸球菌CMS-H001抗Hp作用效力的發(fā)揮依賴于活菌狀態(tài)或代謝終產(chǎn)物的有效成分。
進一步的體外模擬胃十二指腸環(huán)境抗性研究發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌CMS-H001接種到pH為2.0的酸性環(huán)境中活菌計數(shù)與接種到pH6.8的近中性環(huán)境中的無顯著差異，表明糞腸球菌CMS-H001菌株對pH2.0的MRS液體培養(yǎng)基耐受良好；同時，糞腸球菌CMS-H001菌株在含0.3％膽汁鹽的MRS液體培養(yǎng)基活菌計數(shù)較接種于不含膽鹽的MRS無顯著性差異。表明本發(fā)明的糞腸球菌CMS-H001菌株對酸和膽汁都有良好的耐受性。
以上研究表明，從人胃竇和十二指腸分離的厭養(yǎng)菌株中篩選出的糞腸球菌CMS-H001菌株，對模擬胃酸和十二指腸膽汁環(huán)境抗性良好，體外可明顯抑制Hp臨床株，而且這種作用依賴活菌的直接參與。這些研究表明本發(fā)明的糞腸球菌CMS-H001菌株已經(jīng)具備成為藥用菌的必備條件，可用于開發(fā)成應用微生態(tài)療法防治Hp感染的新藥、保健品以及食品添加劑等。
本發(fā)明進一步用糞腸球菌CMS-H001菌株對HP誘導的胃炎模型鼠進行體內(nèi)治療研究，并與現(xiàn)階段常規(guī)的治療方法“PPI三聯(lián)療法”進行比較。研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的益生菌糞腸球菌CMS-H001能減輕HP感染引起的黏膜慢性炎癥損傷，減少淋巴細胞、漿細胞的浸染，與模型組比較有顯著性差異，與PPI治療組比較無明顯差異，并有抑制HP的作用，治療后HP細菌檢測明顯減少，對HP的根除率達到75％-87.5％，與PPI三聯(lián)療法比較差異無顯著性。
本發(fā)明的研究結(jié)果說明正常人胃內(nèi)存在對Hp有拮抗作用的共生菌，并且存在菌株特異性。本發(fā)明從健康人胃竇分離的厭養(yǎng)菌株中篩選出的糞腸球菌CMS-H001，在體內(nèi)有明顯抑制Hp臨床株的作用，其對HP的根除率與PPI加抗菌素的三聯(lián)療法比較無顯著性差異。此結(jié)果對Hp感染的治療提供了新的方法，為微生態(tài)在治療HP相關(guān)性疾病方面提供了理論基礎(chǔ)。
利用本發(fā)明的糞腸球菌CMS-H001可以制備成藥物組合物。該藥物組合物含有藥學有效劑量的糞腸球菌CMS-H001的活菌形式。此外，所述藥物組合物還可以含有合適的藥物載體。本發(fā)明的藥物組合物可以為膠囊、溶液或可飲用懸浮液、袋裝粉劑等形式，每一單一劑量一般含有糞腸球菌CMS-H001菌株約為106～1010細胞。本發(fā)明的藥物組合物可用于防治HP相關(guān)性疾病，如慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)性淋巴瘤和胃癌等。
利用本發(fā)明的糞腸球菌CMS-H001還可以制備成食品、保健品或食品添加劑的形式，這些食品、保健品或食品添加劑可用于防治HP相關(guān)性疾病，如慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)性淋巴瘤和胃癌等，提高使用者的健康水平。本發(fā)明的食品可以是含有本發(fā)明糞腸球菌CMS-H001活菌的飲料的形式，也可以是含有該活菌的乳制品、發(fā)酵乳、酸豆奶等形式。
下面通過具體的實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述。
實施例1糞腸球菌CMS-H001的分離鑒定及其生物學特性1、培養(yǎng)基處方及配置MRS液體培養(yǎng)基取蛋白胨5g，牛肉粉5g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖10g，K2HPO42.5g，檸檬酸銨1g，NaCl 2.5g，MgSO40.25g，MnSO40.1g，Tween-80 0.5g加蒸餾水500ml溶解后121℃高壓蒸氣滅菌，置4℃冰箱備用。
MRS固體培養(yǎng)基蛋白胨5g，牛肉粉5g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖10g，K2HPO42.5g，檸檬酸銨1g，NaCl 2.5g，MgSO40.25g，MnSO40.1g，Tween-800.5g加蒸餾水500ml溶解，加入瓊脂粉10g，121℃高壓蒸氣滅菌，澆注無菌培養(yǎng)皿，置4℃冰箱備用。
2、胃鏡取材和標本轉(zhuǎn)送胃鏡下抽吸健康成人十二指腸降段液體0.5ml入2mlMRS液體培養(yǎng)基，按上法共取三個標本，厭氧盒30分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)送至實驗室。
3、糞腸球菌CMS-H001種子菌的分離培養(yǎng)糞腸球菌CMS-H001種子菌分離自一健康成人十二指腸降段液體，標本在厭氧盒內(nèi)于37℃恒溫培養(yǎng)4h后取出，按10-1系列稀釋至10-7，原液和各級稀釋液各取100ul滴加到MRS平板，L型玻棒涂布均勻，37℃厭氧培養(yǎng)48h后取出觀察菌落形態(tài)，挑單克隆行革蘭氏染色鏡檢，將不同形態(tài)和染色性的菌落單克隆挑入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧環(huán)境培養(yǎng)24h后取出染色鏡檢，觀察鏡下形態(tài)，并劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基，再次37℃厭氧培養(yǎng)48h觀察菌落形態(tài)，挑單克隆染色鏡檢，反復四次傳代純化，直至固體平板上所長菌落形態(tài)一致，革蘭氏染色鏡檢形態(tài)一致確定已分純。分純的各株細菌可添加防凍劑后于-70℃冰箱低溫保存?zhèn)溆谩?br> 3、菌落特征糞腸球菌CMS-H001在EC培養(yǎng)基上為醬紫色扁平菌落，直徑1～2毫米，邊緣齊，表面光滑。光鏡下為革蘭氏染色陽性球菌，球形或串珠狀，無芽孢。見圖1。
4、掃描電鏡觀察取1g菌泥生理鹽水洗3次，取600ul菌懸液2500rpm/min離心5min，加入600ul 2.5％戊二醛，打散沉淀，固定24h；0.1M PBS清洗，3次×5min；1％的OSO4固定1h；50％、70％、90％、100％的丙酮梯度脫水，每級10min×2次；50％、70％、90％、100％醋酸異戊酯，每級置換5min×2次；臨界點干燥儀干燥；離子濺射儀，噴鉑金鍍膜；JSM5600-LV型掃描電鏡觀察、照相。結(jié)果如圖2、3所示，糞腸球菌CMS-H001株細菌表面光滑、完整，形態(tài)均一，呈球狀或串珠狀，無芽孢，圖2、圖3分別代表5000×和20000×倍。
5、透射電鏡觀察取1g菌泥生理鹽水洗3次，取600ul菌懸液2500rpm/min離心5min，沿管壁加入2.5％戊二醛固定24h，2％的鋨酸固定2h，50％、70％、90％、100％的丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂混合液∶純丙酮＝1∶1，37℃，浸泡24h，Epon812(Epoxiaquivalentgewicht145-160)、DDSA(DodecenylsuccinicAnhydride)、MNA(Methyl Nadic Anhydride)、DMP30(Tris-(dimethylaminomethgl)-phenc)，60℃，包埋成塊；修塊、定位；半薄切片；瑞典LKB-III型超薄切片機切片，厚約500A；醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色，日立H-600型透射電鏡觀察、照相。結(jié)果如4、5所示，圖像顯示在透射電鏡下細菌形態(tài)規(guī)整，胞壁結(jié)構(gòu)完整，無腫脹及芽生現(xiàn)象，胞質(zhì)均勻，未發(fā)現(xiàn)異常顆粒，所有切片中未見病毒、支原體等外源因子，圖4、圖5分別代表6000×和12000×倍。
6、糞腸球菌CMS-H001代謝終產(chǎn)物測定(1)儀器日本島津GC2010型氣相色譜檢測儀(GC)，氫焰離子檢測器(FID)，DB-5MS色譜柱；日本島津UV-2501PC；(2)標準液的制備醇和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)標準液的制備將甲酸37μl、乙酸57μl、丙酸74μl、異丁酸93μl、丁酸92μl、異戊酸109μl、戊酸108μl、己酸125μl、乙醇100μl、丙醇5μl、異丁醇5μl、丁醇10μl、異戊醇0.5μl、戊醇0.5μl加蒸餾水定容至100ml，即為10mmol/L的標準液。
非揮發(fā)性脂肪酸(NVFA)標準液的配制將乳酸84μl、苯乙酸60mg、琥珀酸60mg加蒸餾水至100ml，即為10mmol/L的標準液。
(3)VFA制備選用偏磷酸法取標準液或培養(yǎng)物1ml加偏磷酸0.5ml，調(diào)整pH值在2.0以下，37℃勻化2h，10000轉(zhuǎn)/分，4℃離心2min，取上清1μl用于進樣分析。
(4)NVFA制備選用甲醇硫酸法取標準液或培養(yǎng)物2ml加50％硫酸0.2ml，調(diào)整PH值在2.0以下，取硫酸酸性培養(yǎng)物1ml，加入甲醇溶液1ml和50％硫酸0.1ml，將樣品煮沸5分鐘或室溫下過夜，加入氯仿0.5ml，混勻后靜置片刻，1000轉(zhuǎn)/分，4℃離心2min，取氯仿層1μl用于進樣分析。
(5)標本及標準品中各物質(zhì)的分析分別取提取后的樣品和標準品1μl進樣分析，由日本島津GC2010型氣相色譜檢測儀(GC)檢測各物質(zhì)的保留時間并以標準品作為樣本中該物質(zhì)的定量標準。
結(jié)果顯示糞腸球菌CMS-H001菌株VFA主要為乙酸，乙酸出峰時間為7.970min，NVFA主要為乳酸，并有少量琥鉑酸，乳酸出峰時間為7.300min，琥鉑酸出峰時間為9.775min。
7、糞腸球菌CMS-H001的生化鑒定API-20 STREP(法國酶里埃)是一個結(jié)合各方面的20個生化試驗的標準化方法。該系統(tǒng)能夠堅定醫(yī)學細菌中絕大多數(shù)鏈球菌的種或群。
API-20 STREP試驗條由含能進行酶測定和糖發(fā)酵的干燥底物的20個小管所組成，可測定酶活或糖發(fā)酵。酶活測定是以濃、純菌懸液接種于干燥的酶底物。在培養(yǎng)期間，所產(chǎn)生的最終代謝產(chǎn)物通過自然變色或加入試劑而變色而顯示。發(fā)酵試驗是以接種于由糖底物組成的培養(yǎng)基。發(fā)酵的碳水化合物是以PH指示劑來顯示。
取鏡檢Gram′s染色陽性球菌菌株行API-20 STREP生化鑒定，鑒定方法參見API-20 STREP鑒定試劑盒中廠商配備的說明書。結(jié)果見表1。
表1 糞腸球菌CMS-H001菌株API-20 STREP生化反應結(jié)果


實施例2糞腸球菌CMS-H001對幽門螺桿菌(Hp)的體外抑制試驗(1)糞腸球菌CMS-H001菌株上清液制備菌株按1％體積比接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)24h后取出，4℃5000rpm/min離心10min，留取上清，棄去沉淀。
糞腸球菌CMS-H001菌株滅菌上清液制備按上法得到上清液后121℃高壓蒸氣滅菌20min。
糞腸球菌CMS-H001菌株上清液濾過液制備上清液用0.22微米孔徑的濾器過濾除菌，得到不含細菌的上清液。
(2)Hp菌液制備無菌接種環(huán)收集心腦浸液血平板上Hp，接種于0.2ml含50％胎牛血清的心腦浸液，比濁法判斷菌液濃度為1011CFU/ml。
(3)抑菌試驗吸100μl幽門螺桿菌菌懸液滴加到直徑為9cm的心腦浸液血平板，無菌L形玻棒涂布均勻。待菌液完全滲透血平板，用無菌200μlTip頭在平板上打孔，孔徑7mm，孔深5mm，每板4個孔，孔底用0.8％瓊脂液封底后，向孔內(nèi)分別加入糞腸球菌CMS-H001菌株上清液、滅菌上清液、濾過的上清液，加MRS液體培養(yǎng)基作為對照孔，液面盡量接近血平板表面，不得溢出，每孔加液120μl，一式三份，置于厭養(yǎng)箱中微需氧環(huán)境37℃恒溫培養(yǎng)72h。
72h后取出打孔平板測量抑菌圈直徑，高壓滅菌上清液、過濾除菌的上清液以及MRS液體培養(yǎng)基的對應孔內(nèi)壁和孔周無細菌生長，抑菌圈直徑為0；糞腸球菌CMS-H001菌株培養(yǎng)上清液各孔內(nèi)壁均有相應細菌生長，三個平板的抑菌圈直徑分別為18mm，18mm，11mm，平均為15.7mm。
實施例3糞腸球菌CMS-H001體外耐酸、耐膽汁試驗(1)耐酸試驗從-70℃冰箱中取出凍存的糞腸球菌CMS-H001菌株，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭養(yǎng)培養(yǎng)24h后，離心(4300×g，10min，4℃)，棄去上清，收集菌體沉淀，用無菌生理鹽水洗滌3次。然后以1％體積比接種到pH值為2.0(用鹽酸滴定)的MRS液體培養(yǎng)基中。同時接種到pH值為6.8的MRS液體培養(yǎng)基作為對照。
分別在接種后0min和120min取100μl菌液按10-1序列稀釋，各稀釋梯度取100μl接種到pH6.8的MRS平板，厭氧培養(yǎng)48h后行活菌計數(shù)。重復三次。
結(jié)果如表2所示，糞腸球菌CMS-H001菌株接種到pH為2.0的酸性環(huán)境中120min時，活菌計數(shù)與接種到pH6.8的近中性環(huán)境中的無顯著差異(P＞0.05)，均較接種前的細菌計數(shù)稍有增多趨勢，但無顯著性差異(P＞0.05)。表明糞腸球菌CMS-H001菌株對pH2.0的MRS液體培養(yǎng)基耐受良好。
表2.糞腸球菌CMS-H001接種前和接種于pH為6.8和2.0的MRS液體培養(yǎng)基后120min的活菌計數(shù)對數(shù)值

*P＜0.05 vs.對照組
(2)耐膽汁試驗從-70℃冰箱中取出糞腸球菌CMS-H001菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭養(yǎng)培養(yǎng)24h后，離心(4300×g，10min，4℃)，棄去上清，收集菌體沉淀，用無菌生理鹽水洗滌3次。然后以1％體積比接種到含0.3％膽汁鹽的MRS液體培養(yǎng)基中。同時接種到不含膽汁鹽的MRS液體培養(yǎng)基作為對照。
分別在接種后0min和120min取100μl菌液按10-1序列稀釋，各稀釋梯度取100μl接種到pH6.8不含膽汁鹽的MRS平板，厭養(yǎng)培養(yǎng)48h后行活菌計數(shù)。重復三次。
結(jié)果如表3所示，糞腸球菌CMS-H001菌株在含0.3％膽汁鹽的MRS液體培養(yǎng)基120min時，活菌計數(shù)與接種于不含膽汁鹽的MRS液體培養(yǎng)基相比無顯著性差異(P＞0.05)。
表3.糞腸球菌CMS-H001接種前和接種于含膽汁鹽和不含膽鹽的MRS后120min活菌計數(shù)對數(shù)值

●P＜0.05 vs.對照組。
實施例4糞腸球菌CMS-H001治療HP感染性胃炎的體內(nèi)有效性研究用抗生素破壞清潔級BalB/C小鼠胃內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，使胃內(nèi)細菌含量明顯減少的情況下，再感染HP成功地形成了HP感染性胃炎模型。經(jīng)模擬胃內(nèi)環(huán)境的耐酸耐膽汁試驗研究，證明糞腸球菌CMS-H001對酸和膽汁具有一定的抗性。該菌株胃內(nèi)定植發(fā)現(xiàn)其可在胃內(nèi)穩(wěn)定定植。證明糞腸球菌CMS-H001具有體內(nèi)治療HP的條件。以下對糞腸球菌CMS-H001體內(nèi)治療HP誘導的胃炎模型鼠進行有效性研究。
一、材料和方法1、HP臨床株分離和純化所需的材料1.1常用試劑和溶液的配制厭氧發(fā)生劑成分質(zhì)量(g)碳酸氫鈉0.8
硼氫化鉀 1.1檸檬酸1.08革蘭氏染液結(jié)晶紫染液 結(jié)晶紫1g95％乙醇 20ml1％草酸銨水溶液80ml將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。
盧戈氏碘染液 碘1g碘化鉀2g蒸餾水300ml95％酒精95ml乙醇，加5ml蒸餾水稀石炭酸復紅染液稱取堿性復紅10g，研細，加95％乙醇100ml，放置過夜，濾紙過濾。取該液10ml，加5％石炭酸水溶液90ml混合，即為石炭酸復紅液。再取此液10ml，加水90ml，即為稀石炭酸復紅液。
防凍液DMSO與甘油按1∶2的體積比混合。
2、HP鑒定材料2.1、快速尿素酶試劑盒(福建三強生物化工有限公司)；2.2、胃黏膜的病理組織學檢查由有經(jīng)驗的醫(yī)師進行石蠟切片、HE染色、雙盲閱片。
2.3、Giemsa染色和雙盲閱片評分。
2.4、HP細菌培養(yǎng)由本實驗室用心腦浸液制備培養(yǎng)基備用。
3、碾磨的組織液行Gram’s染色涂片4、動物實驗材料建立清潔級動物飼養(yǎng)房，實驗動物和籠具、飼料購自湖南農(nóng)業(yè)大學動物實驗中心由專人負責動物的飼養(yǎng)和管理；實驗動物已經(jīng)造模成功為慢性胃炎的普通級BALB/c小鼠24只，加上空白對照組8只，共32只，雌雄各半，體重±2g。
5、菌懸液、藥液的配制無菌接種環(huán)收集MRS培養(yǎng)平板上的糞腸球菌CMS-H001菌株，用無菌生理鹽水配成懸液，比濁法調(diào)整菌懸液終濃度為1×109CFU/ml。
藥物質(zhì)子泵抑制劑泮立蘇針劑(40mg/支)(杭州中美華東制藥有限公司，批號040805)；抗生素克拉霉素片劑(250mg/片)(江西匯仁藥業(yè)有限公司，批號0510019)，氨芐青霉素針劑(0.5g/支)(華北制藥股份有限公司，批號0404307)，慶大霉素(天津藥業(yè)焦作有限公司，批號05052802)，均購自中南大學湘雅二院藥劑科。
小鼠的藥物的劑量按人與各種動物之間的用藥劑量換算已知A種動物每kg體重用藥量，欲計算B種動物每kg體重用藥劑量時，可查表(參見孫敬方著《動物實驗方法學》，北京，人民衛(wèi)生出版社2001年，116至125頁)，找出折算系數(shù)(W)再按下式計算B種動物的劑量(mg/kg)＝W×A種動物的劑量(mg/kg)。由上述公式計算得出各種藥物的劑量如下泮立蘇針劑(40mg)用100ml無菌生理鹽水稀釋成濃度為0.4mg/ml的溶液，每只小鼠每天每次給0.25ml灌胃。
氨芐青霉素(0.5g)用25ml無菌生理鹽水稀釋成濃度為20mg/ml的溶液，每只小鼠每天每次給0.25ml灌胃。
克拉霉素(0.25g)用5ml無菌生理鹽水稀釋成濃度為50mg/ml的溶液，每只小鼠每天每次給0.1ml灌胃。
6、實驗動物分組及治療方法經(jīng)抗生素預處理、再給予PPI加HP灌胃，造模成功的24只Balb/c小鼠隨機分成3組，每組8只。第1組為PPI加抗生素處理組，第2組為糞腸球菌CMS-H001處理組；第3組為模型對照組；另外增加8只正常Balb/c小鼠作為空白對照組(第4組)。
第1組(PPI+抗生素三聯(lián)療法治療組)自第3-10天，每天先禁食12h，予PPI溶液0.25ml及氨芐青霉素0.25ml加克拉霉素0.1ml灌胃，灌完胃后再禁食3-4個小時，每天一次，連用7天。于最后一次灌胃后第4周全部處死小鼠。
第2組(糞腸球菌CMS-H001治療組)自第1-10天，每日先禁食12h，予CMS-H001新鮮菌懸液0.5ml/只灌胃，細菌數(shù)為109CFU，灌完胃后再禁食3-4個小時，每天一次，連用10天。于最后一次灌胃后底4周全部處死小鼠。
第3組(模型對照組)自第1～10天，每天予生理鹽水0.5ml/只灌胃，每天一次。連用10天，于最后一次灌胃后第4周處死全部小鼠。
第4組(空白對照組)自第1～10天，每天予生理鹽水0.5ml/只灌胃，每天一次。連用10天，于最后一次灌胃后第4周處死全部小鼠。
小鼠的處理用斷頸法處死小鼠后立即解剖，取出胃腔，去除前胃，沿大彎側(cè)剪開，取完整的胃組織(包括十二指腸、胃竇、胃體等)；一半胃粘膜用10％的福爾馬林液固定后行HE染色和Giemsa染色，另一半組織行快速尿素酶試驗(觀察時間5min)、涂片及細菌培養(yǎng)。
7.細菌檢測7.1HP檢測1)快速尿素酶試驗造模組小鼠處死后取胃粘膜置于液體尿素酶試劑中，室溫下觀察5min，指示劑變紅為陽性。
2)Hp培養(yǎng)胃及十二指腸組織標本用含10％胎牛血清的心腦浸液500ul研磨成勻漿，用前后差量法算得標本質(zhì)量，10-1系列適當稀釋，各梯度取100ul涂心腦浸液血平板，37℃微需氧培養(yǎng)3～7天，觀察菌落形態(tài)，取可疑菌落行革蘭氏染色鏡檢和快速尿素酶試驗。
3)Giemsa染色步驟如下①石蠟切片按同一方向裝入染色架，60℃烤片10分鐘，以上或用電吹風使切片上的石蠟溶化。
②入二甲苯中脫蠟2～5分鐘，重復1次，夏天脫蠟時間短一些，冬天則相反。
③100％，100％，95％，90％，80％，70％乙醇依次各1分鐘，入自來水，流水放置約3分鐘，至切片清晰。
④直接入2％Giemsa染液中染色30分鐘(染液可重復使用)。
⑤自來水洗去染液⑥直接入100％乙醇中脫水。
⑦常規(guī)脫水，透明，封片。
4)Gram’s染色步驟①結(jié)晶紫染色1min，流水沖洗；②盧戈氏碘媒染染色1min，流水沖洗；③酒精脫色95％酒精脫色，15～30秒，至無紫色脫下為止，流水沖洗；④稀石炭酸復紅復染，1min，流水沖洗。
集中檢測方法中，細菌培養(yǎng)陽性即診斷為HP陽性，快速尿素酶試驗、改良Giemsa染色及Gram’s染色兩項陽性診斷為Hp陽性。
8.病理學處死小鼠立即解剖后，取一半胃粘膜用10％的福爾馬林液固定后行HE染色小鼠胃組織用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色(蘇木素染色7分鐘——自來水沖洗多余的染液——1％鹽酸酒精分化5秒，使細胞核呈紫藍色——自來水成分洗滌——1％伊紅染色，3分鐘左右)。病理科醫(yī)生雙盲閱片。
9.判斷標準9.1Hp定植的判斷標準(International Agency for Research on CancerWorking Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans.Schistosomes，Liver Flukes，and Helicobacter pylori.LyonInternationalAgency for Research on Cancer，1994177-240.)(MalfertHeiner P，Megraud F，O’Morain C et al.Current concepts in the management of Helicobacter pyloriinfection-tHe Maastricht 2-2000 Consensus Report.Alimentary Pharmacologyand Therapeutics 2002；16167-180.)高倍鏡下觀察Giemsa染色切片10個視野，以Hp數(shù)量的多少進行計分來判斷其定植情況。標準如表4表4.Hp定植量的評分標準

9.2胃粘膜慢性炎癥的評分標準(MalfertHeiner P，Megraud F，O’Morain C et al.Current concepts in the management of Helicobacter pyloriinfection-tHe Maastricht 2-2000 Consensus Report.Alimentary Pharmacologyand Therapeutics 2002；16167-180.)觀察粘膜固有層慢性炎癥細胞(淋巴細胞、漿細胞及嗜酸性粒細胞)和中性粒細胞，分別對固有層慢性炎癥和活動性炎癥程度進行計分，標準如下表5。粘膜下層的炎癥評分標準同粘膜固有層。整個黏膜的炎癥評分為黏膜固有層和黏膜下層的平均值。
表5 胃粘膜病理組織學損傷評分標準

9.3療效判斷(1)Hp根除標準治療停止后一個月做細菌培養(yǎng)陰性或快速尿素酶試驗和組織學染色檢查2項均陰性為Hp根除。
(2)Hp感染好轉(zhuǎn)標準單位質(zhì)量組織Hp計數(shù)減少或組織學染色細菌量減少。
(3)病理學治愈標準大體觀轉(zhuǎn)為正常且病理組織學結(jié)果正常。
(4)病理學好轉(zhuǎn)標準大體觀充血水腫較前減輕，糜爛潰瘍灶較治療前縮小(游標卡測量病灶直徑)，或病理學未完全正常，但評分較治療前減少。
體內(nèi)有效性判斷標準治愈標準(1)加(3)，即Hp根除加上病理學結(jié)果正常。
好轉(zhuǎn)標準(1)加(4)，或(2)加(3)，或(2)加(4)。
有效率＝治愈率+好轉(zhuǎn)率10、統(tǒng)計方法運用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以均數(shù)±標準差(x±s)表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗和方差分析，P＜0.05視為顯著性差異。
二、結(jié)果1、一般情況在實驗過程中，觀察各組小鼠的飲食情況、活動量及毛發(fā)、體重的情況，每周稱體重，發(fā)現(xiàn)各組小鼠之間飲食及活動量無明顯變化，體重的變化無顯著性差異(P＜0.05)(見表6)。
表6小鼠體重變化表(x±s，n＝8)

2.大體觀察2.1從沿胃大彎縱行切開的胃黏膜面觀察，可以看到模型組Hp感染引起的充血水腫及部分胃竇黏膜糜爛，治療組大部分胃黏膜無明顯充血水腫，治療結(jié)束后大體觀可見胃黏膜炎癥與模型組比較明顯好轉(zhuǎn)。
2.2病理組織學損傷積分各組損傷積分參見表7以及圖6的直方圖，圖6的A和B分別代表胃竇、胃體的損傷積分。
總體上胃竇黏膜炎癥損傷積分稍高于胃體黏膜，4組間胃竇黏膜炎癥損傷積分比較有統(tǒng)計學差異，其中第1組(PPI+抗生素處理組)、第2組(糞腸球菌CMS-H001治療組)、第4組(空白對照組)的胃竇黏膜炎癥損傷的積分均低于第3組(模型對照組)，差異有顯著性(P＜0.05)，第1組、第2組、第4組兩兩比較差異無顯著性(P＞0.05)。
胃體炎癥損傷積分4組比較有統(tǒng)計學差異，其中第1組、第2組、第4組的胃體黏膜炎癥損傷的積分均低于第3組，差異有顯著性(P＜0.05)，第1組、第2組、第4組兩兩比較差異無顯著性(P＞0.05)。
表7Balb/c鼠處理各處理組胃黏膜慢性炎癥損傷積分(x±s，n＝8)

注與第3組比較，*P＜0.053、計算HP的根除率3.1 Hp的定植積分Giemsa染色可清楚地顯示Hp呈S形，多定植于胃小凹上部及胃腺腔內(nèi)。各組Hp的定植積分參見表8以及圖7的直方圖，圖7的A和B分別代表胃竇、胃體的Hp定植積分。
4組間胃竇黏膜Hp定植積分比較有統(tǒng)計學差異，其中第1組、第2組與第3組比較差異有顯著性(P＜0.05)，第1組、第2組兩兩比較差異無顯著性(P＞0.05)。
4組間胃體黏膜Hp定植積分比較有統(tǒng)計學差異，其中第1組、第2組與第3組比較差異有顯著性(P＜0.05)，第1組、第2組兩兩比較差異無顯著性(P＞0.05)。
表8各組Balb/c鼠Hp定植積分結(jié)果(x±s，n＝8)

注各組Hp定植積分與第3組比較，×P＜0.05圖8為各組胃粘膜改良Giemsa染色圖，可見空白對照組胃小凹內(nèi)未見明顯桿菌，模型組可見大量桿菌黏附，而PPI治療組和糞腸球菌CMS-H001治療組則僅可見少量桿菌黏附。
3.2 HP的快速尿素酶試驗和培養(yǎng)結(jié)果結(jié)果見表9。第1、2組胃竇和胃體部快速尿素酶試驗和細菌培養(yǎng)與第3組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。
表9快速尿素酶試驗和細菌培養(yǎng)結(jié)果

3.3各處理組不同部位HP的根除率比較結(jié)果見表10。
胃竇部第1組和第2組與第3組、第4組比較差異有顯著性(P＜0.05)，第1、2組之間比較差異無顯著性(P＞0.05)。
胃體部第1組、第2組與第3組、第4組比較差異有顯著性(P＜0.05)。
表10 不同處理組、不同部位HP的根除率比較

3.4培養(yǎng)的HP做Gram’s染色涂片觀察細菌形態(tài)模型組胃組織勻漿涂片和勻漿組織細菌培養(yǎng)的HE染色光鏡下形態(tài)，均可見Gram’s染色陰性細菌，呈彎曲桿菌或弧形，如圖9A、B所示。
以上結(jié)果表明，本發(fā)明的糞腸球菌CMS-H001能減輕HP感染引起的黏膜慢性炎癥損傷，減少淋巴細胞、漿細胞的浸染，與模型組比較有顯著性差異，與PPI治療組(常規(guī)治療方法)比較無明顯差異；并有抑制HP的作用，治療后HP細菌檢測明顯減少，對HP的根除率達到75％-87.5％，與PPI三聯(lián)療法比較差異無顯著性。
權(quán)利要求
1.一種糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CMS-H001，其保藏號為CCTCC No.M 206108。
2.幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)抑制劑，其特征在于所述抑制劑含有保藏號為CCTCC No.M 206108的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)CMS-H001。
3.權(quán)利要求1所述的糞腸球菌CMS-H001在制備用于治療幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)感染導致的疾病的藥物中的應用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于所述疾病為胃病。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于所述疾病為慢性胃炎。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于所述疾病為胃癌。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于所述疾病為胃黏膜相關(guān)性淋巴瘤。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于所述疾病為消化性潰瘍。
9.一種藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物含有保藏號為CCTCC No.M 206108的藥學有效劑量的糞腸球菌CMS-H001。
10.一種食品，其特征在于所述食品含有保藏號為CCTCC No.M206108的糞腸球菌CMS-H001。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的食品，其特征在于所述食品為飲料。
12.一種保健品，其特征在于所述保健品含有保藏號為CCTCC No.M 206108的糞腸球菌CMS-H001。
13.一種食品添加劑，其特征在于所述食品添加劑含有保藏號為CCTCC No.M 206108的糞腸球菌CMS-H001。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CMS－H001，其保藏號為CCTCC No.M 206108。本發(fā)明的糞腸球菌CMS－H001能有效治療幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)感染。
文檔編號A61P1/04GK101067120SQ200610157188
公開日2007年11月7日 申請日期2006年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月29日
發(fā)明者盧放根, 林剛 申請人:康哲醫(yī)藥研究(深圳)有限公司