專利名稱：一種屎腸球菌制劑及其生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種屎腸球菌制劑及其生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
飼料中添加抗生素對(duì)集約化畜牧業(yè)發(fā)展做出重大貢獻(xiàn)的同時(shí)，其產(chǎn)生的副作用如內(nèi)源性感染和二重感染、耐藥性的產(chǎn)生、腸道正常菌群的破壞和畜產(chǎn)品及環(huán)境中的殘留等對(duì)養(yǎng)殖業(yè)、動(dòng)物以及人類食品安全帶來嚴(yán)重威脅。益生素就是以活的微生物為主，動(dòng)物攝入一定量后，在胃腸道特定部位有一定數(shù)量的菌株能夠粘附、定植和生長(zhǎng)，主要通過調(diào)節(jié)腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)和平衡，對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)和健康起到有益作用的制劑，是一種良好的的替代抗生素的新型綠色安全添加劑。屎腸球菌(Enterococcus Faecium)廣泛存在于自然界和畜禽胃腸道內(nèi)，是一種有益微生物，普通的屎腸球菌因其耐酸、耐高溫等特性較差，未能在飼料添加劑中廣泛應(yīng)用。 因此，根據(jù)目前畜牧業(yè)的需求，篩選一株耐酸耐高溫具有益生特性的屎腸球菌具有廣闊的發(fā)展前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種屎腸球菌制劑。本發(fā)明提供的制劑，其活性成分為屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康80CGMCC No.5058。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備上述制劑的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟1)發(fā)酵屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康 80 CGMCC No. 5058，離心收集沉淀， 得到菌泥；2)將步驟1)得到的菌泥、麥芽糊精、海藻糖、阿拉伯樹膠、無菌水混勻乳化，即得到屎腸球菌制劑。在上述方法中，步驟1)中，所述發(fā)酵的溫度為所述發(fā)酵的溫度為15°C -45°c，所述發(fā)酵的時(shí)間為10小時(shí)-18小時(shí)，所述發(fā)酵所需的PH值為4. 5-8. 6，所述發(fā)酵的壓力為 0.OlMpa-O. 03Mpa ；上述發(fā)酵的溫度具體為15°C、37°C或45°C，所述發(fā)酵的時(shí)間為10小時(shí)、12小時(shí)或 18小時(shí)，所述發(fā)酵所需的pH值具體為6. 4-6. 6 ；上述發(fā)酵的攪拌速度為80rpm/min-120rpm/min，具體可為 80rpm/min、IOOrpm/ min 或 120rpm/min ；在上述方法中，步驟2)中，所述菌泥、麥芽糊精、海藻糖、阿拉伯樹膠、水的配比為 3X10ncfu-8X10ncfu 0. 5g_2. 5g 0. Ig-Ig 0. Ig-Ig IOg ；上述菌泥、麥芽糊精、海藻糖、阿拉伯樹膠、水的配比具體為3 X IO11Cfu, 5X IO11Cfu 或 8X IO11Cfu 0.58、18或2.58 0. lg、0.5g 或 Ig 0. lg、0.3g 或 Ig IOgo
在上述方法中，步驟1)中，所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基按照如下方法制備將蔗糖、蛋白胨、酵母粉、K2HPO4, KH2PO4 · 3H20、MnSO4, MgSO4 · 7H20和水混勻，得到培養(yǎng)基，所述蔗糖在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為35g/L-45g/L，所述蛋白胨在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/ L-15g/L，所述酵母粉在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為15g/L-25g/L，所述K2HPO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為lg/L-5g/L，所述KH2PO4 · 3H20在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 5g/ L-1. 5g/L，所述MnSO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 01g/L-0. 03g/L，所述MgSO4 ·7Η20在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. lg/L-0. 6g/L。在本發(fā)明的實(shí)施例中，上述蔗糖在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為35g/L、40g/L 或45g/L，所述蛋白胨在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為5g/L、10g/L或15g/L，所述酵母粉在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為15g/L、20g/L或25g/L，所述K2HPO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為lg/L、4g/L或5g/L，所述KH2PO4 · 3H20在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為 0. 5g/L、lg/L或1. 5g/L，所述MnSO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為0. 01g/L、0. 02g/L或 0. 03g/L，所述MgSO4 · 7H20在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為0. Ig/L、0. 4g/L或0. 6g/L ；上述方法中，所述離心力為1800g_2200g，所述離心力具體為1800g、2000g或 2200g ；所述離心的時(shí)間為5min-10min，所述離心的時(shí)間具體為5min、8min或IOmin ；在上述方法中，步驟2)中，所述乳化的溫度為25°C 48°C，所述乳化的時(shí)間為 25min_45min ；在上述方法中，所述乳化的溫度具體為251、271或觀1，所述乳化的時(shí)間為 25min、30min 或 45min。在上述方法中，在所述步驟2~)后，在所述乳化后還包括將乳化產(chǎn)物干燥得到屎腸球菌制劑的步驟，其中干燥采用低溫真空干燥箱在低溫溫度27-50°C，真空度-0. 096Mpa條件下進(jìn)行。由上述的方法制備的屎腸球菌制劑也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述的屎腸球菌制劑在作為動(dòng)物飼料添加物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述的屎腸球菌制劑在制備動(dòng)物飼料中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述的屎腸球菌制劑在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。在上述應(yīng)用中，所述促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)為如下1)或2)1)提高豬平均日增重、提高豬平均日采食量、提高豬皮毛指數(shù)、降低豬料肉比和/ 或降低豬腹瀉率；2)提高雞平均日增重和/或提高平均日采食量；在上述應(yīng)用中，所述動(dòng)物為豬或雞。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明通過分離、鑒定、篩選，得到屎腸球菌康80，其抗逆性強(qiáng)、抗雜菌能力強(qiáng)、具有益生特性，本發(fā)明將其進(jìn)行乳化制備得到屎腸球菌制劑，可以作為添加劑用于制備動(dòng)物飼料，其中的動(dòng)物包括但不限于豬、牛、羊、雞等各種動(dòng)物。該飼料具有與抗生素飼料類似的功能，但無抗生素飼料的副作用。本發(fā)明的屎腸球菌主要作為動(dòng)物飼料的添加劑，可替代現(xiàn)有動(dòng)物日糧中的抗生素，調(diào)節(jié)動(dòng)物腸內(nèi)微生態(tài)平衡，從而具有增強(qiáng)非特異性免疫功能來預(yù)防疾病的作用，同時(shí)還可以提供營(yíng)養(yǎng)因子、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物的消化吸收、降低腹瀉、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和提高飼料轉(zhuǎn)化率、提高斷奶仔豬以及生長(zhǎng)育肥豬的生產(chǎn)性能。本發(fā)明的屎腸球菌對(duì)防治動(dòng)物消化系統(tǒng)疾病起到保健作用，同時(shí)對(duì)幼年動(dòng)物可刺激其胃腸道發(fā)育，所以將之作為飼料添加劑應(yīng)用在飼料中能起到抗病促生長(zhǎng)的作用。同時(shí)， 本發(fā)明的屎腸球菌無耐藥性和藥物在動(dòng)物產(chǎn)品中殘留，不會(huì)對(duì)人類的健康產(chǎn)生潛在的危害，是一種有前途的綠色飼料添加劑。上述提到的菌株康80于2011年7月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 5058，其分類命名為屎腸球菌(Enterococcus Faecium)。


圖1為屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康80的生長(zhǎng)曲線圖2為飼料樣品中乳酸菌16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹圖3為屎腸球菌發(fā)酵生產(chǎn)流程圖
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基如無特殊說明配方如下1、MRS肉湯培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉粉5g，葡萄糖20g，吐溫80 1ml，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，檸檬酸三氨2g，七水硫酸鎂0. 2g，四水硫酸錳0. 05g,酵母粉4g，用蒸餾水定容至1L。2、MRS瓊脂培養(yǎng)基IL MRS肉湯培養(yǎng)基中加瓊脂15g。3、麥康凱培養(yǎng)基月示胨3g，豬膽鹽5g，中性紅0. 025g，蛋白胨17g，乳糖10g，結(jié)晶紫0. OOlg，氯化鈉5g，瓊脂15g，用蒸餾水定容至1L。4、Ml7 培養(yǎng)基大豆蛋白胨5. Og,酵母提取物5. Og,酪蛋白胨5g，抗壞血酸0. 5g，牛肉浸膏2. 5g， β -甘油磷酸二鈉19g，MgS04 · 7H20 0. 25g，瓊脂15g，用蒸餾水定容至IL0實(shí)施例1、屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康80的分離及鑒定本發(fā)明的屎腸球菌是從飼料樣品中提取、分離、篩選、純化得到的。(一 )屎腸球菌康80 (NFER-5)的分離與純化1. 1菌株的分離培養(yǎng)取Ig健康斷奶仔豬糞便于裝有9mL無菌生理鹽水的試管中，漩渦器震蕩混勻，即為1 10稀釋液，再取稀釋液進(jìn)行十倍遞增稀釋，然后選擇3個(gè)適宜梯度的稀釋液各ImL涂布于含有IOppm放線菌酮的MRS瓊脂培養(yǎng)基及M17瓊脂培養(yǎng)基，37°C厭氧培養(yǎng)48 72h，觀察并記錄菌落形態(tài)，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的特征單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行劃線分離純化。 觀察肉湯是否變渾濁，有渾濁的放置4°C冰箱貯藏備用。1.2革蘭氏染色用無菌注射器吸取少量MRS肉湯培養(yǎng)物，滴在載玻片上，在酒精燈火焰上輕輕烘
6干固定。滴加結(jié)晶紫染色液，染lmin，水洗；滴加革蘭氏碘液媒染，作用lmin，水洗；滴加丙酮乙醇混合液(丙酮95%乙醇=3 7)脫色30s，水洗；滴加沙黃染色液復(fù)染ImindK 洗，待干，在普通光學(xué)顯微鏡上觀察，菌體呈紅色為陰性，紫色的為陽性。呈革蘭氏陽性形態(tài)一致的桿菌，進(jìn)一步進(jìn)行接觸酶試驗(yàn)。1. 3接觸酶試驗(yàn)做MRS斜面培養(yǎng)基，取培養(yǎng)物約0. 2mL注入裝有MRS瓊脂培養(yǎng)基斜面，5 % C02培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)Mh，長(zhǎng)出菌落后，將3%過氧化氫溶液滴加到菌落上，若沒有氣泡產(chǎn)生說明是陰性，若有氣泡產(chǎn)生說明是陽性。通過MRS培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)的培養(yǎng)物經(jīng)革蘭氏染色陽性和接觸酶試驗(yàn)陰性可初步認(rèn)為是乳酸菌屬(Lactobacillus)。3份飼料樣品經(jīng)分離純化，結(jié)合革蘭氏染色和接觸酶試驗(yàn)，共分離出5株乳酸菌， 其中桿菌3株，球菌2株，并分別命名為NFER-1、NFER-2、NFER-3、NFER-4、NFER-5。( 二 )、抗逆性選育與生物學(xué)特性研究1. 1耐熱性能選育將上述篩選的5 株待測(cè)菌株 NFER-I、NFER-2、NFER-3、NFER-4、NFER-5 按 2 % (ν/ ν)的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，分別于60°C、70°C、80°C水浴鍋內(nèi)處理IOmin后測(cè)定其活菌數(shù)，37°C恒溫培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，比較其在各溫度下處理前與處理后的活菌數(shù)。存活率的計(jì)算公式為S 熱=Ii1Ai0;S熱為分別經(jīng)過60°C、70°C、8(rC處理后的屎腸球菌存活率；Iitl為加熱處理前每毫升活菌數(shù)；叫為加熱處理IOmin后每毫升活菌數(shù)。結(jié)果如表1所示，從表1中可以看出，NFER-2，NFER-4，NFER-5在70°C熱處理IOmin 后還有一定活菌數(shù)，且NFER-5濃度高達(dá)1. 72X 105,且NFER-5在80°C處理IOmin后仍有較高活菌數(shù)，濃度為1. OOX 104。而NFER-l，NFER-3在70°C處理IOmin之后無活菌，證明該兩株菌株不耐熱。一般仔豬飼料的制粒溫度為70°C 85°C之間，耐高溫之后存活率低也是乳酸菌作為飼料添加劑的主要限制性因素之一。從耐熱存活率看，本試驗(yàn)選育的發(fā)酵乳酸桿菌可以耐受制粒時(shí)的高溫，作為飼料添加劑將會(huì)有較好的前途。選取NFER-2，NFER-4，NFER-5 進(jìn)行下一步篩選。表1耐熱試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種屎腸球菌制劑，其活性成分為屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康80CGMCC No.5058。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的制劑的方法，包括如下步驟1)發(fā)酵屎腸球菌(EnterococcusFaecium)康80 CGMCC No. 5058，離心收集沉淀，得到菌泥；2)將步驟1)得到的菌泥、麥芽糊精、海藻糖、阿拉伯樹膠、水混勻乳化，即得到屎腸球菌制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述發(fā)酵的溫度為15°C _45°C，所述發(fā)酵的時(shí)間為10小時(shí)-18小時(shí)，所述發(fā)酵所需的PH值為4. 5-8. 6，所述發(fā)酵的壓力為0. OlMpa-O. 03Mpa ；所述發(fā)酵的溫度具體為15°C、37°C或45°C，所述發(fā)酵的時(shí)間為10小時(shí)、12小時(shí)或18小時(shí)，所述發(fā)酵所需的PH值具體為6. 4-6. 6 ；步驟2)中，所述菌泥、麥芽糊精、海藻糖、阿拉伯樹膠、水的配比為SxiO11Cfu-Sx IO11c fu 0. 5g-2. 5g 0. Ig-Ig 0. Ig-Ig IOg ；所述菌泥、麥芽糊精、海藻糖、阿拉伯樹膠、水的配比具體為SxiollCfiuSxio11Cfu或 8 X IO11Cfu 0. 5g、lg 或 2. 5g 0. lg、0. 5g 或 Ig 0. lg、0. 3g 或 Ig 10g。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基按照如下方法制備將蔗糖、蛋白胨、酵母粉、 K2HPO4^KH2PO4 -3H20,MnS04,MgSO4 ·7Η20和水混勻，得到培養(yǎng)基，所述蔗糖在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為35g/L-45g/L，所述蛋白胨在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/L-15g/L，所述酵母粉在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為15g/L-25g/L，所述K2HPO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為lg/L-5g/L，所述KH2PO4 ·3Η20在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 5g/L_l. 5g/L，所述MnSO4 在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 01g/L-0. 03g/L，所述MgSO4 · 7H20在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為 0. lg/L-0. 6g/L。所述蔗糖在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為35g/L、40g/L或45g/L，所述蛋白胨在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為5g/L、10g/L或15g/L，所述酵母粉在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為15g/L、20g/L或25g/L，所述K2HPO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為lg/L、4g/ L或5g/L，所述KH2PO4 ·3Η20在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為0. 5g/L、lg/L或1. 5g/L，所述MnSO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為0. 01g/L、0. 02g/L或0. 03g/L，所述MgSO4 ·7Η20 在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為0. Ig/L、0. 4g/L或0. 6g/L ；所述離心力為1800g-2200g，所述離心力具體為1800g、2000g或2200g ；所述離心的時(shí)間為5min-10min，所述離心的時(shí)間具體為5min、8min或IOmin ；步驟2)中，所述乳化的溫度為25°C 48°C，所述乳化的時(shí)間為25min-45min ； 所述乳化的溫度具體為25°C、27°C或^°C，所述乳化的時(shí)間為25min、30min或45min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于在所述步驟2、后，在所述乳化后還包括將乳化產(chǎn)物干燥得到屎腸球菌制劑的步驟。
6.由權(quán)利要求2-5中任一所述的方法制備的屎腸球菌制劑。
7.權(quán)利要求1屎腸球菌制劑或權(quán)利要求6所述的屎腸球菌制劑在作為動(dòng)物飼料添加物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1屎腸球菌制劑或權(quán)利要求6所述的屎腸球菌制劑在制備動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1屎腸球菌制劑或權(quán)利要求6所述的屎腸球菌制劑在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的應(yīng)用，其特征在于 所述動(dòng)物為豬或雞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種屎腸球菌制劑及其生產(chǎn)工藝。本發(fā)明提供的制劑，其活性成分為屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康80 CGMCC No.5058。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明通過分離、鑒定、篩選，得到屎腸球菌康80，其抗逆性強(qiáng)、抗雜菌能力強(qiáng)、具有益生特性，本發(fā)明將其進(jìn)行乳化制備得到屎腸球菌制劑，可以作為添加劑用于制備動(dòng)物飼料，其中的動(dòng)物包括但不限于豬、牛、羊、雞等各種動(dòng)物。
文檔編號(hào)A23K1/16GK102391962SQ20111034425
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者丁修良, 宋青龍, 王勁松, 譙仕彥 申請(qǐng)人:北京龍科方舟生物工程技術(shù)中心