一種靶向酵母線粒體的穿梭載體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種靶向酵母線粒體的穿梭載體，其是一種用于酵母線粒體復(fù)制子、啟動(dòng)子、蛋白表達(dá)等功能研究的線粒體穿梭載體，本發(fā)明基于密碼子優(yōu)化，構(gòu)建了一種線粒體穿梭載體，利用氯霉素篩選的方法，將線粒體復(fù)制子ori5構(gòu)建到該載體上，驗(yàn)證了其用于線粒體復(fù)制子篩選的功能；結(jié)果表明其能夠利用氯霉素篩選轉(zhuǎn)化到釀酒酵母線粒體中，并檢測(cè)到ori5的復(fù)制子功能，構(gòu)建的載體能夠用作靶向酵母線粒體的穿梭載體、線粒體復(fù)制子和啟動(dòng)子的誘捕載體、酵母線粒體復(fù)制子和啟動(dòng)子功能的研究工具。
【專利說明】
一種靶向酵母線粒體的穿梭載體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子克隆【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種靶向酵母線粒體的穿梭載體及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]線粒體是一種半自主細(xì)胞器，其中含有線粒體DNA (mtDNA)，能夠進(jìn)行自主復(fù)制。根據(jù)前人的研究，釀酒酵母線粒體DNA中有8個(gè)潛在的復(fù)制起始序列(Origin ofRecognit1n, ori)或復(fù)制子(replicon) (Tracy R L ei aL, Current genetics, 1995,28(3): 205-216)。1941年就有研究者使用氰化物處理酵母菌，第一次發(fā)現(xiàn)了釀酒酵母的呼吸突變現(xiàn)象，隨后發(fā)現(xiàn)了釀酒酵母小菌落突變型(petite mutant)，該突變表現(xiàn)為釀酒酵母在酵母浸出粉腺葡萄糖培養(yǎng)基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium ,YPD 或 YPED)上生長(zhǎng)產(chǎn)生的菌落較正常菌落小。而隨后的研究發(fā)現(xiàn)，該小菌落突變型往往表現(xiàn)為線粒體功能的下降甚至完全缺失，其中有些突變類型涉及到線粒體基因組突變，一般是線粒體基因組編碼基因的大量缺失突變，導(dǎo)致線粒體蛋白合成障礙，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體呼吸鏈破壞引起線粒體氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylat1n , 0XPH0S)水平下降。從而在平板上表現(xiàn)為菌落變小。
[0003]隨后的研究者從酵母小菌落突變型中擴(kuò)增獲得含有自主復(fù)制序列樣片段(autonomously replicating like sequence, ARS - like) (Delouya D et aL, Yeast,1991, 7(1): 51-60),研究者一般使用一種稱為超抑制小菌落(supersuppressivepetites)的技術(shù)，通過自發(fā)突變獲得的線粒體突變體，該突變體含有一種缺失突變線粒體，因?yàn)椴荒芎铣删€粒體所需的蛋白質(zhì)，但是可以正常完成突變的線粒體DNA的復(fù)制，因此含有復(fù)制起始序列。通過對(duì)該缺失突變DNA進(jìn)行分析，獲得預(yù)測(cè)的復(fù)制子序列，利用酵母菌雜交技術(shù)與含有正常線粒體的酵母株進(jìn)行雜交，在雜交后代中出現(xiàn)小菌落的數(shù)目和抑制程度，稱為抑制率。因此，如果缺失突變體中含有的復(fù)制子復(fù)制能力越強(qiáng)，那么我們可以推斷其抑制率越高。對(duì)誘變獲得的不同突變株進(jìn)行的研究最終獲得8種潛在復(fù)制子功能的序列。
[0004]該方法通過子代中缺失突變體和正常線粒體基因組復(fù)制競(jìng)爭(zhēng)，推斷突變體中共同含有的復(fù)制子序列，是一種有效研究復(fù)制子功能的方法。然而該方法屬于非直接的方法，這樣獲得的復(fù)制子僅屬于推斷，雖然之后的獲得復(fù)制子通過序列分析，發(fā)現(xiàn)有高度同源序列。然而并沒有直接的對(duì)線粒體復(fù)制子進(jìn)行功能研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了解決如何利用分子生物學(xué)手段對(duì)線粒體復(fù)制子進(jìn)行功能研究，提供了一種經(jīng)過密碼子優(yōu)化的靶向酵母線粒體的穿梭載體，該穿梭載體包括大腸桿菌的質(zhì)粒復(fù)制子、大腸桿菌抗性篩選基因、酵母線粒體啟動(dòng)子、酵母線粒體復(fù)制子、酵母的抗性篩選基因。
[0006]所述大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子是？]\^1、？154、？3(:101、&)把1或？1￥01。
[0007]所述大腸桿菌抗性篩選基因是氨芐青霉素基因、四環(huán)素基因、氯霉素基因、卡那霉素基因、新霉素基因或紅霉素基因。
[0008]所述酵母線粒體啟動(dòng)子是p75或Prail。
[0009]所述酵母線粒體復(fù)制子是oril、ori2> ori3> ori4> ori5> ori6> ori7 或 ori8。
[0010]所述酵母抗性篩選基因是新霉素基因、Zeocin基因、氯霉素基因、Neocin基因或G418基因。
[0011]所述靶向酵母線粒體的穿梭載體核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0012]本發(fā)明另一目的是將靶向酵母線粒體的穿梭載體應(yīng)用在酵母線粒體轉(zhuǎn)化中。
[0013](I)本發(fā)明提供了一種利用密碼子優(yōu)化技術(shù)對(duì)氯霉素抗性基因(CAT)進(jìn)行優(yōu)化方法，使得外源基因能夠在線粒體中特異性表達(dá)。
[0014](2)本發(fā)明通過上述方法進(jìn)行優(yōu)化后，提供了用于構(gòu)建線粒體穿梭載體方法。
[0015](3)基于構(gòu)建的線粒體穿梭載體,克隆線粒體復(fù)制子ori5并構(gòu)建到上述載體,驗(yàn)證了其具有線粒體復(fù)制子功能。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
1、本發(fā)明使用一種直接的方法驗(yàn)證了線粒體復(fù)制子功能；比超抑制小菌落技術(shù)，提供了更為直接的分子生物學(xué)手段驗(yàn)證線粒體復(fù)制子功能；
2、利用該載體可以根據(jù)本發(fā)明中提供的密碼子優(yōu)化方案對(duì)外源蛋白在線粒體中表達(dá)提供方法；
3、使用本發(fā)明提供的線粒體穿梭載體和方法，可用于線粒體復(fù)制子誘捕，發(fā)現(xiàn)新的線粒體復(fù)制子甚至增強(qiáng)子等基因元件。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明中P-CAT’-T-18T測(cè)序結(jié)果比對(duì)結(jié)果(上:預(yù)期序列；下:實(shí)際測(cè)得序列)；
圖 2 為 PCR 擴(kuò)增 pUC，圖中:1: DNA Marker DL5000 ；2:pUC 擴(kuò)增產(chǎn)物；
圖3為酶切鑒定pMT-D的結(jié)果，其中1: pMT-D的酶切產(chǎn)物；2:DNA Marker DL5000 ；圖4為pMT-D質(zhì)粒圖譜，Amp:氨芐青霉素抗性基因；MCS:多克隆位點(diǎn)；CoIE1:大腸桿菌復(fù)制子；P_CAT’ -T:線粒體篩選氯霉素抗性基因；
圖 5 為 PCR 擴(kuò)增 ori5，其中 1: DNA Marker DL2000 ；2: ori5 擴(kuò)增產(chǎn)物；
圖6為pMT I載體圖譜，Amp:氨芐青霉素抗性基因；MCS:多克隆位點(diǎn)；CoIE1:大腸桿菌復(fù)制子；P_CAT’ -T:線粒體篩選氯霉素抗性基因；mt or1:線粒體復(fù)制子；
圖7為PCR鑒定pMT I在線粒體中的復(fù)制，其中1: DNA Marker DL2000 ；2:陰性對(duì)照；3:陽性對(duì)照；4-10: pMT I的PCR產(chǎn)物;
圖8為驗(yàn)證pMT I在線粒體中的復(fù)制，其中A為陽性對(duì)照，B為陰性對(duì)照，C-D為pMT1/INVSc I 的 mtDNA ；
圖9為酶切驗(yàn)證來源于酵母線粒體中的pMT 1，其中Lane 1: DNA Marker DL5000 ；2:陽性對(duì)照；3-6: pMT I。

【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容；實(shí)施例中主要采用常規(guī)的分子生物學(xué)方法，特別是本發(fā)明提供的載體構(gòu)建和密碼子優(yōu)化方面，這些方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。按照以下實(shí)施例，不難根據(jù)具體情況略作修改和變換而成功實(shí)施本發(fā)明，這些修改和變換均落在本申請(qǐng)權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
[0019]實(shí)施例1:氯霉素抗性基因CAT的線粒體表達(dá)優(yōu)化
為構(gòu)建用于線粒體載體的穿梭載體，對(duì)抗性基因CAT進(jìn)行了密碼子優(yōu)化；利用在線工具 Codon Usage Database (http://www.kazusa.0r.jp/codon/)獲得釀酒酵母線粒體密碼子使用頻率，并據(jù)此優(yōu)化CAT基因，獲得線粒體密碼偏好基因CAT’，其序列如序列表SEQID NO:1所示，由上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行全基因合成。同時(shí)添加細(xì)胞色素氧化酶C(cytochrome c oxidase, COX)亞基 II 啟動(dòng)子 75 bp 序列(p75)(序列見 GenBank,登錄號(hào):V00706.1)，通過延伸PCR的方法將其融合表達(dá)于CAT’上游，C0X2終止子120 bp序列，通過延伸PCR的方法將其融合表達(dá)于CAT’下游，合成引物為pCOXTl’:5’ -TTTTAATAATTAAAAATATTAATAATAAGTAAATATTAATTACGCTCCACCTTGTCATT-3 ^ ；pC0XTl:5’- ATTTAAGAATATTATTATAATTATTATTATTATT
ATTATTTTTAATAATTAAAAATA -3 ^ ；pC0XT2:5’-TATAAGGTGATTGAATAGAATATAAATCTATATCTTTATTATATTTAAGAATATTATTA-3 ^ ;引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。使用PCR方法融合啟動(dòng)子、終止子及優(yōu)化后基因。將擴(kuò)增產(chǎn)物通過TA克隆到pMD18-T載體(購買于Takara公司，D101A)上，經(jīng)過測(cè)序公司(委托上海生工)測(cè)序結(jié)果顯示與預(yù)期序列一致(見圖1)。
[0020]實(shí)施例2:線粒體穿梭載體pMT-D的構(gòu)建
設(shè)計(jì)引物 pUl:5’_ GGAATTCGCGGCCGCCATTAATGAATCGGCCAAC -3 ^ ;pU2:5’-CCCAAGCTTGGCACTGGCCGTC -3 '，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。使用PCR擴(kuò)增的方法，以PUC18 (購買于Takara公司，3218)為模板，反應(yīng)體系:上、下游引物各0.25pm/ μ L,0.4mmol/μ L 的 dNTP, 2 ng/μ L 的質(zhì)粒模板，5 U/100 μ L pfu DNA 聚合酶，IXpfu buffer,總體積為25 μ L0按下面進(jìn)行反應(yīng):93°C，3min預(yù)變性；93°C,30s ；59°C,40s ;72°C，lmin反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10mi。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行電泳，EB染色，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致(見圖2)。膠回收后，與實(shí)施例1中所得片段分別酶切，體系:片段400ng，I (購買于Takara 公司，1040A)、M/e I (購買于 Takara 公司，1161A)各 5 U/100 μ L，I XH buffer，總體積為200yL。于37°C酶切3h?；厥蘸筮M(jìn)行連接，體系片段各lOOng，T4 DNA Ligase (購買于 Takara 公司，2011A)25U/10 μ L, 1XT4 DNA Ligase buffer，總體積為 10 μ L，16°C連接過夜，使用常規(guī)熱休克轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[0021]轉(zhuǎn)化后，對(duì)轉(zhuǎn)化子增菌，抽提質(zhì)粒，然后進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)期一致(圖3)。將構(gòu)建好的載體命名為PMT-D (圖4)，該載體序列如SEQ ID N0:2所示。
[0022]實(shí)施例3:線粒體DNA的提取
為擴(kuò)增線粒體復(fù)制子ori5序列，本發(fā)明以釀酒酵母線粒體基因組DNA (mtDNA)為模板擴(kuò)增ori5片段。
[0023]本發(fā)明以釀酒酵母INVSc I (購買于Invitrogen公司，K5050-01)為材料，28°C培養(yǎng)36h。取ImL菌液，9000g離心獲得細(xì)胞，用無菌水洗滌菌體。用lmol/L的山梨醇(購買于上海生工，SB0491)溶液懸起細(xì)胞，按照30mg每g酵母濕重添加蝸牛酶(購買于上海生工，SB0870)到菌懸液，37°C消化2h。9000g離心收集細(xì)胞，用Tr1n裂解緩沖液(I %Tr1n-XlOO, pH:7.2) 0.5mL小心懸起，上下顛倒混勻。室溫靜置10分鐘，5000g離心收集上清，加入等體積酹氯仿，震蕩混勻，12000r/min離心I分鐘，轉(zhuǎn)移上清，乙醇沉淀DNA,用60 μ L無菌水懸起。
[0024]實(shí)施例4:線粒體復(fù)制子ori5的擴(kuò)增及構(gòu)建
為了驗(yàn)證實(shí)施例2中構(gòu)建的線粒體穿梭載體能否用于線粒體復(fù)制子研究，本發(fā)明利用PCR擴(kuò)增的方法克隆獲得了線粒體復(fù)制子ori5序列，將其構(gòu)建到pMT-D載體。用于進(jìn)一步驗(yàn)證其功能。
[0025]設(shè)計(jì)引物p0RIl:5’- GCATGCAAATTCATATGATTATTAT -3 ^ ;p0RI2:5’-GTCGACTATAAATAAGTTAATATTTTAT _3入引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以實(shí)施例3中獲得的mtDNA為模板擴(kuò)增釀酒酵母線粒體復(fù)制子ori5。反應(yīng)體系:上、下游引物各0.25pm/y L，0.4mmol/y L 的 dNTP，2 ng/μ L 的 mtDNA 模板，5 U/100 μ L taq DNA 聚合酶(購買于Takara公司，DR001A)，I X taq buffer,總體積為25 μ L。按下面進(jìn)行反應(yīng):93°C，3min 預(yù)變性；93°C,30s ；43°C,40s ;72°C，Imin 反應(yīng) 30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 1min0 反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行電泳，EB染色。結(jié)果顯示，能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小條帶，后續(xù)測(cè)序顯示與預(yù)期序列一致(圖5)。
[0026]隨后將上述片段回收，利用限制性酶切對(duì)載體及片段進(jìn)行酶切，體系:片段AQQng,Sal I (購買于 Takara 公司，1080A)、5M I (購買于 Takara 公司，1246A)各 5 U/100UL,IXH buffer，總體積為200 μ L。于37°C酶切3h?；厥蘸筮M(jìn)行連接，體系片段各lOOng，T4 DNA Ligase (購買于 Takara 公司，201 lA)25u/10 μ L, 1XT4 DNA Ligase buffer，總體積為10 μ L，16°C連接過夜。
[0027]轉(zhuǎn)化后，對(duì)轉(zhuǎn)化子增菌，抽提質(zhì)粒，然后進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)期一致。將構(gòu)建好的載體命名為PMT I (圖6)。
[0028]實(shí)施例5:pMT I轉(zhuǎn)化釀酒酵母線粒體并PCR鑒定
為驗(yàn)證pMT-D用于線粒體復(fù)制子研究的功能，以實(shí)施例4中構(gòu)建的含有ori5的線粒體穿梭載體PMT 1，轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc I，篩選獲得轉(zhuǎn)化子并初步對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定。
[0029]將40yg質(zhì)粒pMT 1，與新制備的感受態(tài)細(xì)胞混合，通過電轉(zhuǎn)化(電擊參數(shù):1500V，200V，25 μ F)的方法轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中，在氯霉素濃度為0.lmg/mL的YPG培養(yǎng)基(Peptone2%, Yeast Extract I %、甘油3 %、Agar 2 %)上進(jìn)行篩選，獲得轉(zhuǎn)化子。PCR擴(kuò)增CAT’基因檢驗(yàn)pMT I是否轉(zhuǎn)化到線粒體中。反應(yīng)體系:上、下游引物0.25pm/yL，0.4mmol/yL的dNTP, 2 ng/μ L的線粒體總DNA模板，5 U/100 μ L taq DNA聚合酶，I X buffer，總體積為25 μ Lo 按下面進(jìn)行反應(yīng):93°C，3min 預(yù)變性；93°C，30s ；50°C, 40s ；60°C，2min 反應(yīng) 30 個(gè)循環(huán)，最后60°C延伸20min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行電泳，EB染色。
[0030]結(jié)果顯示，pMT I成功轉(zhuǎn)化入線粒體中(圖7)，能夠在酵母線粒體中自主復(fù)制，ori5具有復(fù)制子功能。
[0031]實(shí)施例6:進(jìn)一步驗(yàn)證pMT I在線粒體中的復(fù)制
以實(shí)施例5中獲得的線粒體總DNA，取10 μ L轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴20min，42°C熱激2min，冰上處理2min，涂布平板。能夠獲得轉(zhuǎn)化子(圖8)，將上述獲得的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，體系:質(zhì)粒200ng，I ,Sph I各5 U/100 μ L, I XHbuffer,總體積為 100 μ L。
[0032]結(jié)果顯示，酶切獲得片段與pMT I酶切片段大小一致(圖9)，表明該載體在線粒體中獲得復(fù)制，而且氯霉素抗性基因也在酵母線粒體中獲得了表達(dá)。因此，PMT-D載體可進(jìn)一步用作靶向酵母線粒體的穿梭載體、線粒體復(fù)制子和啟動(dòng)子的誘捕載體、酵母線粒體復(fù)制子和啟動(dòng)子功能的研究工具。
【權(quán)利要求】
1.一種靶向酵母線粒體的穿梭載體，其特征在于:包括大腸桿菌的質(zhì)粒復(fù)制子、大腸桿菌抗性篩選基因、酵母線粒體啟動(dòng)子、酵母線粒體復(fù)制子、酵母線粒體抗性篩選基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向酵母線粒體的穿梭載體，其特征在于:大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子是 pMBl、pl5A、pSC101、ColEl 或 pWVOl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的靶向酵母線粒體的穿梭載體，其特征在于:大腸桿菌抗性篩選基因是氨芐青霉素基因、四環(huán)素基因、氯霉素基因、卡那霉素基因、新霉素基因或紅霉素基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靶向酵母線粒體的穿梭載體，其特征在于:酵母線粒體啟動(dòng)子是p75或Poxil。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的靶向酵母線粒體的穿梭載體，其特征在于:酵母線粒體復(fù)制子是 oril、ori2、ori3、ori4、ori5、ori6、ori7 或 ori8。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的靶向酵母線粒體的穿梭載體，其特征在于:酵母抗性篩選基因是新霉素基因、Zeocin基因、氣霉素基因、Neocin基因或G418基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向酵母線粒體的穿梭載體，其特征是:靶向酵母線粒體的穿梭載體核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
8.權(quán)利要求1所述靶向酵母線粒體的穿梭載體在酵母線粒體轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK104450768SQ201410653603
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月18日
【發(fā)明者】井申榮, 馬貴興, 黃芬, 曾韋錕 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)