一種以氯霉素為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以氯霉素為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體，其是基于氯霉素的畢赤酵母篩選體系，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)氯霉素對(duì)畢赤酵母GS115有明顯的抑制作用，在含有氯霉素的YPG抗性固體培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一種利用氯霉素作為篩選抗生素的畢赤酵母篩選體系。利用含有氯霉素抗性基因CAT的載體，以及本發(fā)明中方法制備的畢赤酵母電轉(zhuǎn)感受態(tài)和氯霉素篩選固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，用EGFP作為報(bào)告基因，轉(zhuǎn)化畢赤酵母后在熒光顯微鏡下能夠觀察到綠色熒光，表明該載體及篩選體系能夠有效地進(jìn)行畢赤酵母轉(zhuǎn)化篩選及外源蛋白表達(dá)。
【專利說(shuō)明】一種以氯霉素為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酵母基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及以氯霉素為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表 達(dá)載體及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 畢赤酵母是一種甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母，可以利用甲醇作為唯一碳源，在20世紀(jì)80-90 年代發(fā)展起來(lái)作為一種蛋白表達(dá)系統(tǒng)。相比原核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母具有糖基化修飾的優(yōu) 勢(shì)，但沒有釀酒酵母常見的過(guò)糖基化問(wèn)題。同時(shí)相對(duì)于其他真核表達(dá)系統(tǒng)如昆蟲表達(dá)系統(tǒng)、 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO)表達(dá)系統(tǒng)具有可大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)。此外，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞 表達(dá)系統(tǒng)，外源基因不能持久表達(dá)，且成本、技術(shù)背景等問(wèn)題也制約了哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系 統(tǒng)的應(yīng)用。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)一定程度上可以克服上述問(wèn)題，因此具有較大的應(yīng)用潛力，是 一種值得關(guān)注和發(fā)展的真核表達(dá)系統(tǒng)。
[0003] 畢赤酵母最初來(lái)自一株野生甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母NRRL-Y11430,由Ogata K等人首 次發(fā)現(xiàn)（Ogata K ei aZ, Agric BiolChem, 1969，33: 1519-1520)。隨后的研究表明 其含有的甲醇誘導(dǎo)的醇氧化酶（alcohol oxidase, AOX) I型啟動(dòng)子對(duì)于誘導(dǎo)表達(dá)外源 蛋白具有巨大優(yōu)勢(shì)（Cregg J ei aZ, Molecular and cellular biology, 1989，9(3): 1316-1323)。首先是因?yàn)槠湓诩状颊T導(dǎo)性表達(dá)量高（Daly R ei aZ, Journal of Molecular Recognition, 2005，18(2): 119-138)，對(duì)于利用真核細(xì)胞對(duì)外源蛋白進(jìn)行表達(dá)提供了幫 助；其次蛋白表達(dá)嚴(yán)格受AOXl啟動(dòng)子的啟動(dòng)，有利于外源基因表達(dá)的調(diào)控；用于畢赤酵母 表達(dá)的質(zhì)粒往往為整合型，能夠整合在核基因組上，有利于遺傳性質(zhì)的穩(wěn)定性；畢赤酵母可 利用簡(jiǎn)單合成培養(yǎng)基即可進(jìn)行高密度發(fā)酵，有利于提高產(chǎn)量；此外，畢赤酵母可利用甲醇作 為唯一碳源，有利于降低發(fā)酵成本。
[0004] 通常畢赤酵母主要利用氨基酸缺陷型進(jìn)行篩選轉(zhuǎn)化子，但是有著必須使用基因缺 陷工程菌的缺陷，在非缺陷菌上的利用會(huì)受到限制。此外，近年發(fā)展有利用新霉素作為初始 篩選標(biāo)記的篩選系統(tǒng)，但是畢赤酵母的抗性篩選系統(tǒng)可用抗生素較少，對(duì)于某些新霉素不 敏感菌株可能會(huì)導(dǎo)致篩選失敗。本發(fā)明建立的基于氯霉素的畢赤酵母表達(dá)載體可以用于畢 赤酵母轉(zhuǎn)化子篩選。對(duì)于新霉素篩選失敗的菌株也可以嘗試使用氯霉素篩選。另外，利用 本發(fā)明中的載體除可用來(lái)在畢赤酵母中表達(dá)外源蛋白，還可以用于抗生素對(duì)真核細(xì)胞殺傷 作用等的機(jī)制研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于畢赤酵母在氯霉素抗性平板固體培養(yǎng)基下不能生長(zhǎng)，本發(fā)明的目的是為了解 決如何利用氯霉素抗性篩選畢赤酵母轉(zhuǎn)化子篩選的問(wèn)題；提供了一種新型畢赤酵母表達(dá)載 體，即以氯霉素為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體，如PPIC3. 5C、pPIC9C載體，該表達(dá)載體是 由氯霉素抗性基因 CAT替換了現(xiàn)有畢赤酵母表達(dá)載體上的真核細(xì)胞篩選基因，形成含有氯 霉素抗性基因 CAT的表達(dá)載體；該畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母后可以用氯霉素在YPG 培養(yǎng)基上篩選重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子。
[0006] 本發(fā)明是將畢赤酵母表達(dá)載體 pPIC9K、pPIC3. 5K、pPIC6 A、pPIC6B、pPIC6C、 pPIC6aA、pPIC6aB、pPIC6aC、pPICZ A、pPICZ B、pPICZ C、pPICZaA、pPICZaB、pPICZaC 等載體中的真核細(xì)胞篩選基因 Neomycin、Zeocin、Blasticidin或G418替換成氯霉素抗性 基因 CAT，形成新型表達(dá)載體，在畢赤酵母中表達(dá)成抗性蛋白，使得畢赤酵母在含有抗生素 的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
[0007] 所述氯霉素抗性基因 CAT序列如SEQ ID NO : 1所示。
[0008] 本發(fā)明另一目的是將以氯霉素為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體應(yīng)用在篩選重組 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子中，篩選時(shí)使用的培養(yǎng)基（YPG培養(yǎng)基)組成及配比為在IOOml的水中含有： 蛋白胨2g、酵母膏l(xiāng)g、甘油3g、氯霉素為200mg ;YPG固體培養(yǎng)基組成及配比為在IOOml的 水中含有：為蛋白胨2g、酵母膏l(xiāng)g、甘油3g、瓊脂2g、氯霉素為200mg。
[0009] 本發(fā)明所述以氯霉素為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母后可以用氯 霉素在上述培養(yǎng)基上篩選重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化的畢赤酵母為GS115、SM1168、KM71或 X33。
[0010] 基于以氯霉素為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體，如PPIC3. 5C、pPIC9C載體，本發(fā) 明提供了一種基于氯霉素或氨芐青霉素抗性篩選重組大腸桿菌的方法；同時(shí)提供了一種基 于氯霉素抗性篩選畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的方法。
[0011] 本發(fā)明提供了一種基于氯霉素篩選的畢赤酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備方法。本發(fā)明 還提供了用于鑒定氯霉素篩選載體PPIC3. 5C轉(zhuǎn)化效果的重組載體EGFP-pPIC3. 5C。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 1、本發(fā)明中提供的以氯霉素為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體，使用氯霉素進(jìn)行篩選。 氯霉素較為穩(wěn)定，且僅使用含有氯霉素的YPG培養(yǎng)基，便于抗性平板固體培養(yǎng)基的制備及 相關(guān)操作，避免了缺陷篩選中培養(yǎng)基配置繁瑣的的問(wèn)題。
[0013] 2、在現(xiàn)有的畢赤酵母篩選系統(tǒng)中常用的抗生素種類較少，僅有G418、Neomycin、 ZeociruBlasticidin等，且價(jià)格較貴。而本發(fā)明中使用的氯霉素價(jià)格便宜，易于獲得，且較 為穩(wěn)定，能夠明顯降低實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)成本。另外，如利用其它抗生素篩選畢赤酵母失敗，本發(fā) 明提供的篩選系統(tǒng)可以作為有效的補(bǔ)充。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為本發(fā)明以氯霉素為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體PPIC3. 5C圖譜示意圖； 圖2為本發(fā)明以氯霉素為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9C圖譜示意圖； 圖3為本發(fā)明畢赤酵母GSl 15在不同固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況；圖中A為無(wú)抗性YPG ;B 為含有2 %氯霉素 YPG; 圖4為本發(fā)明畢赤酵母GS115在不同濃度氯霉素抗性YPG下生長(zhǎng)情況； 圖5為本發(fā)明重組畢赤酵母GS115在氯霉素抗性YPG培養(yǎng)基下生長(zhǎng)情況；圖中3. 5K是 轉(zhuǎn)化有PPIC3. 5K的GS115畢赤酵母；CAT-3. 5K是轉(zhuǎn)化有CAT-3. 5K的GS115畢赤酵母； 圖6為本發(fā)明熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)的結(jié)果示意圖；圖中A為EGFP-3. 5C/GS115 在激發(fā)光下；B為EGFP-3. 5C/GS115在白光下；C為3. 5C/GS115在激發(fā)光下；D為3. 5C/ GS115在白光下； 圖7為本發(fā)明western blot檢測(cè)EGFP的表達(dá)結(jié)果示意圖；圖中：3. 5C為3. 5C/GS115 ; EGFP-3. 5C 為 EGFP-3. 5C/GS115 ;空白為 GS115 ;陽(yáng)性為 EGFP-3. 5/GS115K。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于 所述內(nèi)容；實(shí)施例中主要采用常規(guī)的基因工程分子生物學(xué)克隆方法，這些方法是本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員所熟知的，稍微更改載體骨架口？扣91(、？？扣3.51(、？？106 4，8，&(：、？？扣6〇八， B, &C、pPICZA, B, &C、pPICZa A, B, &C、pA0815 等載體或菌株改為 SM1168、KM71、 X33等畢赤酵母菌株。按照以下實(shí)施例，不難根據(jù)具體情況略作修改和變換而成功實(shí)施本發(fā) 明，這些修改和變換均落在本申請(qǐng)權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
[0016] 實(shí)施例1 :畢赤酵母GS115電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備 本發(fā)明需要配合專門的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)制備方法，本方法與經(jīng)典的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)制備方 法有一定的不同，主要區(qū)別在與使用的培養(yǎng)基及部分試劑，具體步驟如下： 1)在含5ml YPG培養(yǎng)基(蛋白胨2g/100ml、酵母膏I g/100ml、甘油3g/100ml)的50ml 三角瓶中培養(yǎng)畢赤酵母，30°C過(guò)夜； 2 )取l-5ml過(guò)夜培養(yǎng)物，接種于含500ml新鮮YPG培養(yǎng)基的2L搖瓶中，過(guò)夜生長(zhǎng)至0D_ 在1. 3-1. 5之間； 3) 4°C，1500g離心5min收集細(xì)胞，用500ml預(yù)冷的無(wú)菌水懸浮細(xì)胞； 4) 4°C，1500g離心5min收集細(xì)胞，用250ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞； 5) 4°C，1500g離心5min收集細(xì)胞，用20ml預(yù)冷的IM山梨醇懸浮細(xì)胞； 6) 4°C，1500g離心5min收集細(xì)胞，用Iml預(yù)冷的IM山梨醇懸浮細(xì)胞； 7) 按照電轉(zhuǎn)化要求分裝，備用。
[0017] 實(shí)施例2 :畢赤酵母對(duì)氯霉素的敏感性檢測(cè) 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)氯霉素對(duì)畢赤酵母具有抑制作用，在YPG固體培養(yǎng)基(蛋白胨2 g/100ml、酵母膏I g/100ml、甘油3g/100ml、Agar 2g/100ml)上，在添加了氯霉素(購(gòu)買于 生工生物公司，0692C503)的抗性平板固體培養(yǎng)基上畢赤酵母不能生長(zhǎng)，而在非抗性平板固 體培養(yǎng)基上則生長(zhǎng)正常（圖3)。本發(fā)明進(jìn)一步摸索了畢赤酵母GS115 (購(gòu)買于Novagen公 司，K1750-01)最佳抗性濃度，在YPG培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的氯霉素，發(fā)現(xiàn)氯霉素對(duì) GSl 15的抑制作用有著劑量依賴性（圖4)，并且在濃度為2mg/ml及以上時(shí)，畢赤酵母GSl 15 便基本上不能夠生長(zhǎng)。
[0018] 實(shí)施例3 :轉(zhuǎn)化氯霉素抗性基因并驗(yàn)證其對(duì)氯霉素抑制作用的解除 為了驗(yàn)證氯霉素對(duì)畢赤酵母的抑制作用能夠在氯霉素抗性基因（CAT)存在的情況下能 夠通過(guò)基因表達(dá)降解氯霉素而得到解除，本發(fā)明從PACYC184質(zhì)粒(購(gòu)買于New England

【權(quán)利要求】
1. 一種以氯霉素為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體，其特征在于：由氯霉素抗性基因 CAT替換了畢赤酵母表達(dá)載體上的真核細(xì)胞篩選基因，形成含有氯霉素抗性基因CAT的表 達(dá)載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以氯霉素為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體，其特征在于：畢赤酵母表達(dá)載體為 pPIC9K、pPIC3. 5K、pPIC6 A、pPIC6B、pPIC6C、pPIC6 a A、pPIC6 a B、 pPIC6aC、pPICZ A、pPICZ B、pPICZ (：、口？1〇2〇六、口？1〇2〇8、口？1〇2〇(：、口八0815中的一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以氯霉素為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體，其特征在于：氯 霉素抗性基因CAT序列如SEQ ID NO :1所示。
4. 權(quán)利要求1、2或3中所述的以氯霉素為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體在篩選重組畢 赤酵母轉(zhuǎn)化子中的應(yīng)用，其特征在于用于篩選的培養(yǎng)基的組成及配比為在l〇〇ml的水中含 有：蛋白胨2g、酵母膏l(xiāng)g、甘油3g、氯霉素為200mg。
【文檔編號(hào)】C12N15/65GK104388461SQ201410653593
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月18日
【發(fā)明者】井申榮, 馬貴興, 黃芬, 曾韋錕 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)