釀酒酵母基因組定點突變的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領域，特別涉及釀酒酵母基因組定點突變的方法。
【背景技術】
[0002] 作為真核生物的模式菌株，釀酒酵母在醫(yī)藥、食品等眾多領域被廣泛應用，釀酒酵 母基因或者染色體DNA序列的定點突變對于真核生物基因功能的研究提供了重大參考意 義。釀酒酵母基因組定點突變的引入一般是通過兩步法完成的：1.利用釀酒酵母的同源重 組在待引入突變的位置插入篩選標記;2.利用攜帶突變的DNA敲除引入的篩選標記，實現(xiàn)基 因組單位點突變。不過，該方法需要利用PCR構建攜帶篩選標記的表達盒，實驗周期，操作繁 瑣，而且一般每次只能對一個目標靶點進行定點突變。如果利用該方法同時向多個位點引 入定點突變的話，則需要構建多個的攜帶篩選標記的表達盒，操作更加繁瑣，效率低下。
[0003] CRISPR/CasCRISPR/CasCRISPR/Cas是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一 種適應性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNAXRISPR/Cas系統(tǒng)通過將入侵噬菌體 和質粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相應的CRISPR RNAs(crRNAs)來指導同源序列的 降解，從而提供免疫性。此系統(tǒng)的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基配對與 tracrRNA(trans-activating RNA)結合形成tracrRNA/crRNA復合物，此復合物引導核酸酶 Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈RNA。而通過人工設計這兩種RNA，可以改造 形成具有引導作用的sgRNA(short guide RNA)，足以引導Cas9對DNA的定點切割。
[0004] 基因敲除動物模型一直以來是在活體動物上開展基因功能研究、尋找合適藥物作 用靶標的重要工具。但是傳統(tǒng)的基因敲除方法需要通過復雜的打靶載體構建、ES細胞篩選、 嵌合體小鼠選育等一系列步驟，不僅流程繁瑣、對技術的要求很高，而且費用大，耗時較長， 成功率受到多方面因素的限制。即使對于技術比較成熟的實驗室，利用傳統(tǒng)技術構建基因 敲除大、小鼠一般也需要一年以上。CRISPR/Cas技術是繼鋅指核酸酶(ZFN)、ES細胞打靶和 TALEN等技術后可用于定點構建基因敲除大、小鼠動物的第四種方法，且有效率高、速度快、 生殖系轉移能力強及簡單經(jīng)濟的特點，在動物模型構建的應用前景將非常廣闊。

【發(fā)明內容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供了釀酒酵母基因組定點突變的方法。本發(fā)明將CRISPR/Cas9 技術和釀酒酵母共轉化技術相結合，提出全新的對釀酒酵母基因組進行定點突變的技術， 耗時短，操作簡單。
[0006] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種釀酒酵母基因組定點突變的方法，包括如下步驟：
[0008] 步驟1:選擇突變位點的靶位點；
[0009] 步驟2:酵母轉化，引入釀酒酵母基因組點突變；
[0010] 步驟3:對點突變進行驗證。
[0011] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述方法中步驟1選擇突變位點位于PAM序列 (NGG)中或者PAM序列前l(fā)lbp內的作為靶位點。
[0012]在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述方法中步驟2中所述酵母轉化為向釀酒酵 母細胞中轉化Cas9質粒、guide RNA質粒和攜帶突變后的DNA片段。
[0013]在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述方法中所述guide RNA引導Cas9蛋白在待 修復位點附近發(fā)揮作用，將釀酒酵母基因組進行切割處雙鏈切口，實現(xiàn)供體DNA的高效重 組。
[0014]在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述方法中所述點突變選自釀酒酵母V號染色 體上位點9、位點14或位點16。
[0015]在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述方法中步驟3所述驗證通過PCR和Sanger DNA測序驗證。
[0016] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述方法中所述點突變至少為1個。
[0017] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述方法中所述點突變?yōu)獒劸平湍竀號染色體 上位點14的A突變?yōu)镃。
[0018] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述方法中所述點突變?yōu)獒劸平湍竀號染色體 上位點16的A突變?yōu)镃。
[0019] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述方法中所述點突變?yōu)獒劸平湍竀號染色體 上位點16的C突變?yōu)镚。
[0020] 本發(fā)明還提供了所述的方法構建的釀酒酵母突變菌株。
[0021 ]本發(fā)明利用CRISPR/Ca9技術修復釀酒酵母基因組上待修復的單堿基突變位點。如 果該突變位點位于PAM序列(NGG)中或者PAM序列前l(fā)lbp內，則可利用guide RNA引導Cas9蛋 白在待修復位點附近發(fā)揮作用，將釀酒酵母基因組進行切割處雙鏈切口，從而實現(xiàn)供體DNA 的高效重組。
[0022]本發(fā)明對比已有成果具有以下有益效果：
[0023] 高效、快速實現(xiàn)釀酒酵母基因組位點的突變；
[0024] 無需向釀酒酵母基因組整合篩選標記。
【附圖說明】
[0025] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0026]圖1示本發(fā)明實施例1利用基于CRISPR/Cas9的共轉化方法誘導釀酒酵母染色體多 位點突變的示意圖；
[0027]圖2示實施例1中待突變基因組序列和測序結果；
[0028]圖3示本發(fā)明實施例2利用基于CRISPR/Cas9的共轉化方法誘導釀酒酵母染色體多 位點突變的示意圖；
[0029] 圖4示實施例2中待突變基因組序列和測序結果。
【具體實施方式】
[0030] 本發(fā)明公開了釀酒酵母基因組定點突變的方法，本領域技術人員可以借鑒本文內 容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員 來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施 例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內容】
、精神和范圍內對本文所述的方法和 應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。
[0031]本發(fā)明利用CRISPR/Cas9共轉化技術向釀酒酵母基因組上進入多個突變位點，本 發(fā)明的技術方案概述如下：
[0032] 1.選擇突變位點位于PAM序列(NGG)中或者PAM序列前11 bp內的作為靶位點，然后 向釀酒酵母細胞中轉化Cas9質粒、guide RNA質粒和攜帶突變后序列的DNA片段。guide RNA 引導Cas9蛋白在待修復位點附近發(fā)揮作用，將釀酒酵母基因組進行切割處雙鏈切口，從而 實現(xiàn)供體DNA的高效重組；
[0033] 2.在進行酵母轉化時，同時將突變其余位點的DNA同時轉化入酵母體內；
[0034] 利用PCR和Sanger DNA測序進行點突變的驗證。
[0035]本發(fā)明對比已有成果具有以下有益效果：
[0036] 高效、快速實現(xiàn)釀酒酵母基因組位點的突變；
[0037] 無需向釀酒酵母基因組整合篩選標記。
[0038] 本發(fā)明釀酒酵母基因組定點突變的方法中所用菌株及原料均可有市場購得。
[0039] 下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明：
[0040] 實施例1
[0041] 利用CRISPR/Cas9技術，向釀酒酵母V號染色體上位點14和16處引入單位點突變 (圖1)，包括以下步驟：
[0042] 1 ·位點 14處序列為"ctggagatgAaccaatgattTGG"（如SEQ ID No. 1 所示），其中TGG 為PAM序列，A為待突變位點；引入單位點突變后的序列為"ctggagatgCaccaatgattTGG"（如 SEQ ID心.2所示），其中丁66為？41序列，(：為突變后的位點。位點16處序列為 "ttagctagcaaAcccttagaac"（如SEQ ID Νο·3所示），其中A為帶突變位點，引入單位點突變 后的序列為"ttagctagcaaCcccttagaac"（如SEQIDNo·4所示），其中C為突變后的位點。選 擇位點14為Cas9切割靶點，位點16為共轉化突變位點。
[0043] 2.構建待修復位點14的guide-RNA質粒，其構建步驟如下：
[0044] a)選擇 protospacer 為ctggagatgAaccaatgatt;
[0045] b)合成引物
[0046] "GCAGTGAAAGATAAATGATCctggagatgAaccaatgattGTTTTAGAGCTAGAAATAGC"（如SEQ ID No.5所示）和
[0047] "GCTATTTCTAGCTCTAAAACaatcattggtTcatctccagGATCATTTATCTTTCACTGC"（如SEQ ID No.6所示）；
[0048] c)退火粘合兩個引物，得到雙鏈DNA;
[0049] d)利用限制性內切酶Notl和CIP消化質粒pRS426+SNR52p-gRNA，使之線性化；
[0050] e)利用Gibson組裝將線性化質粒和雙鏈DNA進行組裝；
[0051 ] f)將反應體系轉化如DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞中，涂布于LB+Carb平板上，37°C培 養(yǎng) 12h;
[0052] g)挑取5個單菌落接種于5mL LB+Carb液體培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)后，提取質粒， 進行Sanger測序；
[0053] h)測序正確的質粒命名為pRS426+SNR52P-gRNA. 14。
[0054] 3.釀酒酵母轉化，其步驟如下：
[0055] a)利用LiOAC法向釀酒酵母中轉化pRS415+Cas9質粒，涂平板與SC-Leu培養(yǎng)平板上 篩選單菌落；
[0056] b)挑取攜帶pRS415+Cas9質粒的釀酒酵母單菌落于5mL SC-Leu液體培養(yǎng)基中，30 °C過夜培養(yǎng)；
[0057] c)測量過夜培養(yǎng)的釀酒酵母培養(yǎng)液0D6QQ，接種過夜培養(yǎng)液到5mL YPD中 (0· 1250D6QQ/ml)，30°C、220rpm條件下培養(yǎng)至0D6QQ達到0·5(約需要3.5-4.5hrs);
[0058] d)吸取1.5mL釀酒酵母培養(yǎng)液至1.5mL EP管內，5000rpm離心lmin，收集細胞；用 lmL無菌水重懸細胞，同上離心，收集細胞；用lmL 0.1M LiOAc重懸細胞，同上離心，收集細 胞;用移液器吸除900yL上清，剩余的100yL LiOAc重懸細胞，置于冰上，得到感受態(tài)細胞。 [0059] e)準備轉化體系，其中DNA為pRS426+SNR52p-gRNA. 14，50ng;位點14點突變片段， 200ng;位點16點突變片段，200ng:
[0060]
[0061]
[0062] f)將100yL感受態(tài)細胞中加入至轉化體系中，吹吸均勻，最高速渦旋10s;30°C培養(yǎng) 箱中孵育30min;加入90yL DMS0，渦旋震蕩10s ; 42 °C熱激15min; 3600rpm離心30s，收集細 胞；吸出上請，加入400yL