5mM CaCl2，重懸細(xì)胞，靜置5min; 3600rpm離心30s，吸出上請(qǐng)，在 無(wú)菌水中重懸后涂SC-Leu-Ura篩選培養(yǎng)板篩選。
[0063] 4.待酵母在篩選培養(yǎng)板上生長(zhǎng)2天，挑取單菌落于SC-Leu-Ura平板上劃線分純。
[0064] 5 ·使用特異性驗(yàn)證位點(diǎn)1 4點(diǎn)突變的上游引物1 4 - t e s t - F "TTGTTTGGATTTCCAAATCATTGGTG"（如SEQ ID No · 7所示）和下游引物 14-test-R "CGTCGTCCTCTTCAGTAGTAGCC^'（如SEQIDNo.8所示），以及特異性驗(yàn)證位點(diǎn)16點(diǎn)突變的上游 引物 16-test-F "AATCCTCGTGCAAGCCATCA"（如SEQ ID No · 9所示）和下游引物6-test-R "TGATAGTTCAAGAGGTTCTAAGGGT"（如SEQ ID No. 10所示)對(duì)步驟4中的菌株進(jìn)行酵母菌落PCR 驗(yàn)證（Annaluru，N.，et al.Science(2014)，344,55-8)。使用1541^的卩0?反應(yīng)體系：6〇丁&9 6代611]\&18七6『]\^叉7.541^，上游引物（1(^]\〇0.141^，下游引物（1(^]\〇0.141^，(1(1!12〇6.341^，模 板DNA lyl^PCR反應(yīng)條件：98°C預(yù)變性5min;98°C變性30s;59°C退火30s;72°C延伸30s;30個(gè) 循環(huán);72°C延伸10min，4°C保存。
[0065] 6.挑選PCR驗(yàn)證出現(xiàn)條帶的菌株提取基因組作為模板，利用上游引物14-F "CCTATCCCTTATCCAGAACAACC"（如 SEQ ID No · 1 1 所示）和下游弓丨物 1 4-R "CTAACCTTTGGAGCACCACTGAC，，（如 SEQ ID No · 1 2所示）以及上游弓| 物 1 6_F "AGGAACTGGGACGCTCAAGACGC"（如 SEQ ID No · 1 3 所示）和下游弓丨物 1 6-R "TTTAGTCCACATCCACCAACCAC"（如SEQ ID No. 14所示）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用Phusion高保真DNA 聚合酶進(jìn)行PCR獲得DNA片段，并進(jìn)行瓊脂糖電泳回收。使用相同引物對(duì)DNA膠回收產(chǎn)物進(jìn)行 Sanger測(cè)序確認(rèn)單位點(diǎn)修復(fù)成功（圖2)。
[0066] 7.對(duì)點(diǎn)突變后的釀酒酵母菌株進(jìn)行質(zhì)粒丟失。
[0067] 實(shí)施例2
[0068]利用CRISPR/Cas9技術(shù)，對(duì)釀酒酵母合成型V號(hào)染色體位點(diǎn)9處（圖3)引入單位點(diǎn)突 變，包括以下步驟：
[0069] 1 ·待引入單位點(diǎn)突變處的序列為"aaatacgaagaacCattttgCGG"（如SEQ ID No. 15 所示），其中C G G為P A Μ序列，C為待修復(fù)位點(diǎn)；引入單位點(diǎn)突變后的序列為 "aaatacgaagaacGattttgCGG"（如SEQ ID No. 16所示），其中CGG為PAM序列，G為修復(fù)后的位 點(diǎn)。選擇位點(diǎn)9為Cas9切割靶點(diǎn)，位點(diǎn)15-2為共轉(zhuǎn)化突變位點(diǎn)。
[0070] 2.構(gòu)建待修復(fù)位點(diǎn)9的guide-RNA質(zhì)粒，其構(gòu)建步驟如下：
[0071 ] a)izfei$protospacer^aaatacgaagaacCattttg；
[0072] b)合成引物 "GCAGTGAAAGATAAATGATCaaatacgaagaacCattttgGTTTTAGAGCTAGAAATA GC"(如SEQ ID No. 17所示）和"GCTATTTCTAGCTCTAAAACcaaaatGgttcttcgtatttGATCATTTATC TTTCACTGC"(如SEQ ID 吣.18所示）；
[0073] c)退火粘合兩個(gè)引物，得到雙鏈DNA;
[0074] d)利用限制性內(nèi)切酶Notl和CIP消化質(zhì)粒pRS426+SNR52p-gRNA，使之線性化；
[0075] e)利用Gibson組裝將線性化質(zhì)粒和雙鏈DNA進(jìn)行組裝；
[0076] f)將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化如DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB+Carb平板上，37°C培 養(yǎng) 12h;
[0077] g)挑取5個(gè)單菌落接種于5mL LB+Carb液體培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒， 進(jìn)行Sanger測(cè)序；
[0078] h)測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pRS426-SNR52P+gRNA · 9。
[0079] 3.釀酒酵母轉(zhuǎn)化，其步驟如下：
[0080] a)利用LiOAC法向釀酒酵母中轉(zhuǎn)化pRS415+Cas9質(zhì)粒，涂平板與SC-Leu培養(yǎng)平板上 篩選單菌落；
[0081 ] b)挑取攜帶pRS415+Cas9質(zhì)粒的釀酒酵母單菌落于5mL SC-Leu液體培養(yǎng)基中，30 °C過(guò)夜培養(yǎng)；
[0082] c)測(cè)量過(guò)夜培養(yǎng)的釀酒酵母培養(yǎng)液0D6QQ，接種過(guò)夜培養(yǎng)液到5mL YPD中 (0· 1250D6QQ/ml)，30°C、220rpm條件下培養(yǎng)至0D6QQ達(dá)到0·5(約需要3.5-4.5hrs);
[0083] d)吸取1.5mL釀酒酵母培養(yǎng)液至1.5mL EP管內(nèi)，5000rpm離心lmin，收集細(xì)胞；用 lmL無(wú)菌水重懸細(xì)胞，同上離心，收集細(xì)胞；用lmL 0.1M LiOAc重懸細(xì)胞，同上離心，收集細(xì) 胞;用移液器吸除900yL上清，剩余的100yL LiOAc重懸細(xì)胞，置于冰上，得到感受態(tài)細(xì)胞。 [0084] e)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化體系，其中DNA為pRS426+SNR52p-gRNA · 9，50ng;位點(diǎn)9點(diǎn)突變片段， 200ng;位點(diǎn)15-2點(diǎn)突變片段，200ng:
[0085]
[0086] f)將100yL感受態(tài)細(xì)胞中加入至轉(zhuǎn)化體系中，吹吸均勻，最高速渦旋10s;30°C培養(yǎng) 箱中孵育30min;加入90yL DMS0，渦旋震蕩10s ; 42 °C熱激15min; 3600rpm離心30s，收集細(xì) 胞；吸出上請(qǐng)，加入400yL 5mM CaCl2，重懸細(xì)胞，靜置5min; 3600rpm離心30s，吸出上請(qǐng)，在 無(wú)菌水中重懸后涂SC-Leu-Ura篩選培養(yǎng)板篩選。
[0087] 4.待酵母在篩選培養(yǎng)板上生長(zhǎng)2天，挑取單菌落于SC-Leu-Ura平板上劃線分純。
[0088] 5.使用特異性驗(yàn)證位點(diǎn)9點(diǎn)突變的上游引物9-test-F"CTGGAGGGCCGCAAAATG"（如 SEQIDNo·19所示）和下游引物9-test-R"TGGCTTGCTAATTTCATCTTATCCT"（如SEQIDNo·20 所示），以及特異性驗(yàn)證位點(diǎn)15-2點(diǎn)突變的上游引物15-2-test-F"TTGAGCTGCGAGAGTGTGGG" (如SEQ ID Νο·23所示）和下游引物 15-2-test-R"GCGTAATTCCCTTCTGCTTACACT"（如SEQ ID No. 24所示)對(duì)步驟4中的菌株進(jìn)行酵母菌落PCR驗(yàn)證(Annaluru，N.，et al. Science(2014)， 344,55-8)。。使用15yL的PCR反應(yīng)體系：GoTaq Green Master Mix 7.5yL，上游引物（ΙΟμΜ) 0 · lyL，下游引物（1 ΟμΜ)0 · lyL，ddH20 6 · 3yL，模板DNA lyL。PCR反應(yīng)條件：98°C預(yù)變性5min; 98°C 變性 30s;59°C 退火 30s;72°C 延伸 3〇8;30個(gè)循環(huán)；72°(：延伸1〇1^11，4°(：保存。
[0089] 6.挑選PCR驗(yàn)證出現(xiàn)條帶的菌株提取基因組作為模板，利用上游引物9-F "AGTTCTTCCTGAGATTTAGCCTTTG"（如 SEQ ID No · 2 1 所示）和下游弓丨物 9-R "CGTCATCTTTCACTACCCTTTAC，，（如 SEQ ID No · 2 2 所示）以及上游弓| 物 1 5 _F "GCCTTCCCACCGCCTTGGTTGTT"（如 SEQ ID No · 2 5 所示）和下游弓丨物 1 5-R "AAACTTATCACAGCCGCTATTCA"（如SEQ ID吣.26所示）進(jìn)行?0財(cái)廣增。使用？11118丨〇11高保真0嫩 聚合酶進(jìn)行PCR獲得DNA片段，并進(jìn)行瓊脂糖電泳回收。使用相同引物對(duì)DNA膠回收產(chǎn)物進(jìn)行 Sanger測(cè)序確認(rèn)單位點(diǎn)修復(fù)成功（圖4)。
[0090] 7.對(duì)點(diǎn)突變后的釀酒酵母菌株進(jìn)行質(zhì)粒丟失。對(duì)位點(diǎn)9修復(fù)后的釀酒酵母菌株進(jìn) 行質(zhì)粒丟失。
[0091] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種釀酒酵母基因組定點(diǎn)突變的方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟1:選擇突變位點(diǎn)的祀位點(diǎn)； 步驟2:酵母轉(zhuǎn)化，引入釀酒酵母基因組點(diǎn)突變； 步驟3:對(duì)點(diǎn)突變進(jìn)行驗(yàn)證。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1選擇突變位點(diǎn)位于PAM序列(NGG)中 或者PAM序列前11 bp內(nèi)的作為靶位點(diǎn)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟2中所述酵母轉(zhuǎn)化為向釀酒酵母細(xì) 胞中轉(zhuǎn)化Cas9質(zhì)粒、guide RNA質(zhì)粒和攜帶突變點(diǎn)的DNA片段。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述guide RNA引導(dǎo)Cas9蛋白在待修復(fù)位 點(diǎn)附近發(fā)揮作用，將釀酒酵母基因組進(jìn)行切割處雙鏈切口，實(shí)現(xiàn)供體DNA的高效重組。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟1所述點(diǎn)突變選自釀酒酵母 V號(hào)染色體上位點(diǎn)9、位點(diǎn)14或位點(diǎn)16。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟3所述驗(yàn)證通過(guò)PCR和/或 Sanger DNA測(cè)序驗(yàn)證。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟1所述點(diǎn)突變至少為1個(gè)。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟1所述點(diǎn)突變?yōu)獒劸平湍竀 號(hào)染色體上位點(diǎn)14的A突變?yōu)镃。9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟1所述點(diǎn)突變?yōu)獒劸平湍竀 號(hào)染色體上位點(diǎn)16的A突變?yōu)镃。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟1所述點(diǎn)突變?yōu)獒劸平湍竀 號(hào)染色體上位點(diǎn)16的C突變?yōu)镚。11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的方法構(gòu)建的釀酒酵母突變菌株。
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別涉及釀酒酵母基因組定點(diǎn)突變的方法。本發(fā)明利用CRISPR/Cas9技術(shù)修復(fù)釀酒酵母基因組上待修復(fù)的單堿基突變位點(diǎn)。如果該突變位點(diǎn)位于PAM序列(NGG)中或者PAM序列前11bp內(nèi)，則可利用guide？RNA引導(dǎo)Cas9蛋白在待修復(fù)位點(diǎn)附近發(fā)揮作用，將釀酒酵母基因組進(jìn)行切割處雙鏈切口，從而實(shí)現(xiàn)供體DNA的高效重組。本發(fā)明對(duì)比已有成果具有以下有益效果：高效、快速實(shí)現(xiàn)釀酒酵母基因組位點(diǎn)的突變；無(wú)需向釀酒酵母基因組整合篩選標(biāo)記。
【IPC分類】C12N15/81, C12N1/19, C12R1/865
【公開(kāi)號(hào)】CN105624187
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610088284
【發(fā)明人】元英進(jìn), 謝澤雄, 李炳志
【申請(qǐng)人】天津大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年6月1日
【申請(qǐng)日】2016年2月17日