專利名稱：一種檢測基因多突變位點的方法及其專用試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測基因多突變位點的方法及其專用試劑盒。
背景技術：
堿基突變是人類基因組突變中很重要的一種類型，很多堿基突變都與疾病的發(fā) 生有密切的關系，因此檢測某些位點突變信息，對疾病的臨床診斷和指導臨床治療 有著重要的意義。
氨基糖甙類抗生素包括慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素等，因其對革 蘭氏染色陰性細菌的感染特別有效，同時對于某些革蘭氏陽性細菌也有協(xié)同抗菌作 用。因此被廣泛應用臨床治療。但是該類藥物有嚴重的耳毒性副作用，使用時可能 會造成聽力不可逆轉的損傷。
線粒體12SrRNA基因是氨基糖式類抗生素導致的非綜合征型聽力損失的一個突 變熱點區(qū)域。在這些突變位點中，位于12SrRNA基因高度保守的解碼區(qū)的同質性的 A1555G和C1494T突變與耳聾相關，這兩個突變導致很多患者的氨基糖甙類抗生素中 毒性耳聾。A1555G突變和C1494T突變會在12SrRNA基因的高度保守的A位形成新的 1494C—G1555或1494U—A1555堿基對。這些改變使得12SrRNA在二級結構上與細菌 的16srRNA的相應區(qū)域的二級結構更加相似。因此，由于C1494T和A1555G突變在 12SrRNA形成G—C和U—A配對使得氨基糖甙類抗生素的結合更加容易，這就是為何 攜帶這些突變的人在接觸了氨基糖甙類抗生素時會出現(xiàn)或加重耳聾的原因。因此對 這兩個點突變的檢測，對于預防氨基糖甙類抗生素中毒性耳聾有著重要的臨床意 義。
目前公開的只有檢測耳聾相關的單個突變位點的PCR技術，急需能同時檢測兩 個耳聾相關的突變位點的PCR檢測方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測基因多突變位點的方法及其專用試劑盒。
本發(fā)明所提供的檢測基因多突變位點的方法包括以下步驟 l)針對待檢測基因的兩個或兩個以上突變位點分別設計相應的突變型引物對， 使PCR擴增得到的目的片段滿足以下兩個條件a) 只包括一個突變位點；
b) PCR擴增得到的兩個或兩個以上的目的片段的Tm值均相差2°C以上； 所述突變型引物對的正向引物或反向引物的3'末端堿基與待擴增的突變位點
的突變型堿基完全匹配，與待檢測的突變位點的野生型堿基完全匹配；
2)用步驟l)的引物對進行PCR擴增，檢測PCR擴增產物的熔解曲線，根據(jù)熔 解峰的有無來判斷是否有突變的發(fā)生。
其中，所述PCR擴增為熒光定量PCR擴增或普通PCR擴增同時加入熒光染料或 普通PCR擴增后加入熒光染料；所述引物中還可引入人工突變堿基；所述方法中還 可包括一對內標引物。
當所述檢測基因多突變位點的方法為檢測線粒體12S rRNA基因的1555的A—G 和/或1494的C—T突變的方法時，所述步驟l)的引物為3條引物，引物序列分別 為序列表中序列1、序列2或序列3;所述步驟2)為用步驟1)的3條引物進行PCR 擴增，檢測PCR擴增產物的熔解曲線，如出現(xiàn)熔解溫度為79.4的熔解峰，則人線 粒體12S rRNA基因的1555位存在點突變，突變類型為A—G;如出現(xiàn)熔解溫度為 76. 6的熔解峰，則人線粒體12S rRNA基因的1494位存在點突變，突變類型為C—T。 其中，所述一對質控引物的序列分別為序列表中序列4和序列5。 本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測基因多突變位點的專用試劑盒。 當所述檢測基因多突變位點為檢測藥物性耳聾相關位點A1555G和C1494T突 變時，所述的專用試劑盒可包含有如下部分
(1) 提取血樣DNA的試劑；
(2) PCR反應試劑，包括dNTP、 IOXPCR緩沖液、Mg2+、三蒸水和7^酶；
(3) 引物；
(4) 陽性標本對照和陰性標本對照；
(5) 說明書。
所述引物包括如下3條引物，它們的序列分別是序列表中序列l(wèi)、序列2和序 列3。
其中，所述的專用試劑盒的引物中還可包含一對質控引物，該質控引物的序列 分別為序列表中的序列4和序列5。
本發(fā)明采用的方法是針對每個突變位點設計相應的引物，每個突變位點引物 3'端末端堿基與突變型堿基完全匹配，而與野生型堿基錯配，引物中還引入另外的突變堿基，以增加反應的特異性。體系中另設計一對內標引物，反應中每對引物
的PCR產物之間的Tm值均相差2'C以上，經熒光染料PCR擴增后，進行熔解曲線分 析，通過是否有熔解峰的出現(xiàn)來判斷是否有突變發(fā)生。本發(fā)明通過設計PCR產物Tm 值的差異來實現(xiàn)多位點突變的檢測，儀器要求簡單，費用低，操作簡單，無需酶切 或電泳，同時整個過程除加入模板外無需進行開蓋操作，有效避免污染的產生，能 夠簡單、快速、準確的實現(xiàn)兩個或兩個以上點突變的同時檢測或單獨檢測。


圖1為以12s RNA-1555G基因組和12s腦A-1494T基因組為模板的PCR檢測 圖2為以12s RNA-1555G基因組為模板的PCR檢測 圖3為以12s RNA-1494T基因組為模板的PCR檢測 圖4為以野生型基因組或無菌雙蒸水為模板的PCR檢測
具體實施例方式
下面以一種檢測人線粒體12S rRNA基因的1555的A—G和/或1494的C—T突 變的方法為例，闡明本發(fā)明的技術方案。該檢測人線粒體12SrRNA基因的1555的 A—G和/或1494的C—T突變的方法，是以人的基因組DNA為模板，用3條引物進 行PCR擴增，檢測PCR擴增產物的熔解曲線，如出現(xiàn)熔解溫度為79.4的熔解峰， 則人線粒體12SrRNA基因的1555位存在點突變，突變類型為A—G;如出現(xiàn)熔解溫 度為76. 6的熔解峰，則人線粒體12S rRNA基因的1494位存在點突變，突變類型 為C—T。
實施例l、人線粒體12S rRNA基因多突變位點的檢測 1、引物設計
采用primer 5. 0軟件針對1555和1494突變位點設計引物，突變點位于引物 的3'端，兩者共用一條下游引物。設計1555的擴增產物Tm值為77. rC， 1494 的擴增產物的Tm值為80. 1°C。
為增強反應的特異性，在1555和1494引物的3'端倒數(shù)第3個堿基引入人為
突變堿基。引物序列如下
1555位點引物5' CCCTACGCATTTATATAGAGG6GG 3'(序列1) 1494位點引物5' CACACCGCCCGTC 7CT 3'(序列2 ) 共同的下游引物5' GCACTTTCCAGTACACTTACCA 3'(序列3) 針對線粒體上的一段保守的核酸區(qū)段，設計內標引物，設計其擴增產物的Tra值為88.9°C。
內標引物F: 5' ACATTACAGTCAAATCCCTTCTC 3'(序列4)
內標引物R: 5' AGCTACCCCCAAGTGTTATG 3'(序列5)
PCR擴增所用模板為301醫(yī)院提供1555， 1494突變型及野生型基因組。
反應體系如下2XReal time EvaGreen buffer(博奧公司)10ul， Taq酶 0.2 ul， 1555位點引物(lOuM) 0.6ul， 1494位點引物(10uM) 0.4ul，共同的 下游引物(lOuM) 0.8ul，內標引物F (lOuM) 0.4ul，內標引物R (10uM) 0.4u 1， EvaGreen 0. 6卩1，模板2ul， H20 4. 6yl。
其中，各個PCR反應的模板濃度如下第一個PCR反應中，12s RNA-1555G、 12s RNA-1494T的模板濃度分別為0. lng、和0. lng;第二個PCR反應中，12s RNA-1555G的模板濃度為0. lng;第三個PCR反應中，12s RNA-1494T的模板濃度為 0. lng;第四個PCR反應中，12s RNA的濃度模板為lng。
反應在ABI 7700熒光PCR上一步進行。
反應程序如下
首先進行擴增過程，擴增過程如下94t: 15min;然后94t: 15sec，54。C 20sec， 72°C 20sec， 40個循環(huán)；然后進行熔解曲線分析，熔解曲線分析如下94°C 10sec， 72。C 10sec ，升溫速度為0. l°C/s， 94°C 10sec。
實驗結果表明，雖然軟件給出的理論Tm值與實際的Tm值有所差異，但PCR各 產物的Tm值之間的差異與預期相吻合(>2°C)，各熔解峰彼此間能很好的進行區(qū) 分。上述四個PCR反應均擴增出特異性的產物。第一個PCR反應中出現(xiàn)了熔解溫度 為79.4、 76. 6和85. 1的熔解峰，分別為1555位為G的擴增產物、1494位為T的 擴增產物和質控引物的擴增產物(圖l);第二個PCR反應中出現(xiàn)了熔解溫度為79.4 和85. l的熔解峰，為1555位為G的擴增產物和質控引物的擴增產物(圖2);第 三個PCR反應中出現(xiàn)了熔解溫度為76. 6和85. 1的熔解峰，為1494位為T的擴增 產物和質控引物的擴增產物(圖3);第四個PCR反應中只出現(xiàn)了熔解溫度為85. 1 的熔解峰，為質控引物的擴增產物，NTC為以無菌雙蒸水為模板，未出現(xiàn)任何熔解 峰。(圖4)。序列表
〈110〉博奧生物有限公司清華大學
<120> —種檢測基因多突變位點的方法及其專用試劑盒 <130〉 CGGNARW81372
<160〉 5
〈210> 1 〈211〉 24 <212> DNA <213>人工合成
〈220> <223> 〈400〉 1
ccctacgcat ttatatagag gcgg 24
<210〉 2 <211〉 16 〈212〉 DNA <213〉人工合成
〈220> 〈223〉 <400〉 2
cacaccgccc gtctct 16
<210〉 3 〈211〉 22〈212〉 DNA
<213>人工合成 〈220> 〈223> 〈400> 3
gcactttcca gtacacttac ca 22
<210> 4 <211> 23 〈212〉 DNA <213〉人工合成
〈220〉 〈223〉 <400〉 4
acattacagt caaatccctt etc 23
<210> 5 <211〉 20 <212> DNA 〈213〉人工合成
〈220> <223> <400〉 5
agctaccccc aagtgttatg 20
權利要求
1、一種檢測基因多突變位點的方法，其特征在于包括以下步驟1)針對待檢測基因的兩個或兩個以上突變位點分別設計相應的突變型引物對，使PCR擴增得到的目的片段滿足以下兩個條件a)只包括一個突變位點，b)PCR擴增得到的兩個或兩個以上的目的片段的Tm值均相差2℃以上；所述突變型引物對的正向引物或反向引物的3′末端堿基與待擴增的突變位點的突變型堿基完全匹配，與待檢測的突變位點的野生型堿基完全匹配；2)用步驟1)的引物對進行PCR擴增，檢測PCR擴增產物的熔解曲線，根據(jù)熔解峰的有無來判斷是否有突變的發(fā)生。
2、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR擴增為熒光定量PCR擴 增或普通PCR擴增同時加入熒光染料或普通PCR擴增后加入熒光染料。
3、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述突變型引物中還引入人工突 變堿基。
4、 根據(jù)權利要求l、 2或3所述的方法，其特征在于所述方法中還包括一對質 控引物。
5、 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于所述檢測基因多突變位點的方法為檢測線粒體12S rRNA基因的1555的A—G和/或1494的C—T突變的方法，所述步 驟l)的引物為3條引物，引物序列為序列表中序列1、序列2和序列3;所述步驟2) 為用步驟l)的3條引物進行PCR擴增，檢測PCR擴增產物的熔解曲線，如出現(xiàn)1555 位為G的熔解峰，則人線粒體12S rRNA基因的1555位存在點突變；如出現(xiàn)1494位 為T的熔解峰，則人線粒體12S rRNA基因的1494位存在點突變。
6、 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述一對質控引物的序列分別為 序列表中序列4和序列5。
7、 一種檢測藥物耳聾相關位點突變的試劑盒，該試劑盒包含有提取血樣DNA的 試劑、PCR反應試劑、引物、陽性標本對照和陰性標本對照及說明書，其特征在于 所述引物包括如下3條引物，它們的序列分別是序列表中序列1、序列2和序列3。
8、 根據(jù)權利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒的引物中還可包括 一對內標引物；所述內標引物的序列分別為序列表中的序列4和序列5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測基因多突變位點的方法及其專用試劑盒。所述檢測基因多突變位點的方法為檢測線粒體12S rRNA基因的1555的A→G和/或1494的C→T突變的方法，所用引物為3條，引物序列分別為序列表中序列1、序列2或序列3；用所述的3條引物進行PCR擴增，檢測PCR擴增產物的熔解曲線，如出現(xiàn)熔解溫度為79.4的熔解峰，則人線粒體12S rRNA基因的1555位存在點突變，突變類型為A→G；如出現(xiàn)熔解溫度為76.6的熔解峰，則人線粒體12S rRNA基因的1494位存在點突變，突變類型為C→T。本發(fā)明還同時公開了一種檢測基因多突變位點的專用試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK101597638SQ200810114398
公開日2009年12月9日 申請日期2008年6月4日 優(yōu)先權日2008年6月4日
發(fā)明者偉 侯, 王思賢, 京 程, 高華方 申請人:博奧生物有限公司;清華大學