專利名稱：：利用酵姆slc基因修飾植物脂類和種子油類的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用基因工程技術(shù)修飾植物脂類和種子油類。更具體地說，本發(fā)明涉及遺傳修飾油料種子植物以便生產(chǎn)商業(yè)價值提高的油料種子或完整植物。本發(fā)明還涉及被修飾的植物和種子，和用于生產(chǎn)這樣的植物和進(jìn)一步修飾植物的遺傳材料和載體。
背景技術(shù)：
：當(dāng)今存在的一個相當(dāng)大的需求是用分子遺傳手段修飾油類種子的種子油脂肪酸組成和含量，以便提供用作工業(yè)原料的超高芥子酸油菜子(SHEAR)油的可靠來源。在傳統(tǒng)油類種子作物(如，油菜子、亞麻、向日葵、大豆)中生產(chǎn)其它計劃上不食用的油類(如，羥基、環(huán)氧基短和中等鏈脂肪酸等等高的種子油類)也存在著同樣的需求。對于食用油類，存在的相當(dāng)大的需求是在油類種子作物如Canola和食用油類亞麻(Linola)、大豆和向日葵中改變脂肪酸組成(如，高級的油/低級的聚不飽和酯、低級的飽和酯、，高級的飽和酯)以及提高油含量。目前，還沒有資料證明轉(zhuǎn)基因途徑能增加油含量(產(chǎn)量)，雖然傳統(tǒng)的育種和連續(xù)篩選會增加產(chǎn)量，帶來產(chǎn)量提高。相反，通過在油類種子中導(dǎo)入各種作物脂肪酸生物合成和酰基轉(zhuǎn)移酶基因已經(jīng)獲得一些計劃的脂肪酸的比例的增加。下面是這樣的方法的一些例子1.在蕓苔科植物中表達(dá)來自加利福尼亞灣的中等鏈脂肪酰基-ACP硫酯酶以便提高月桂酸(12∶1)含量(Calgene；Voelkeretal.，1995；1996-參見“有關(guān)本發(fā)明的參考文獻(xiàn)”所附的參考文獻(xiàn)35和36)。2.在低芥子酸的Brassicanapus(Canola)品種中表達(dá)Jojobaβ-酮?；?CoA合成酶以便提高芥子酸的水平；高芥子酸品種表達(dá)后帶來的影響是不可忽視的(Calgene；Lassneretal.，1996-參見參考文獻(xiàn)20)。3.在蕓苔科植物中表達(dá)硬脂酰-ACPΔ9去飽和酶的反義結(jié)構(gòu)以便提高硬脂酸含量(Calgene；Knutzonetal.，1992-參見參考文獻(xiàn)16)。4.利用編碼植物微粒體FAD2(Δ12)去飽和酶通的有義結(jié)構(gòu)，過協(xié)同阻遏提高B.napus中油酸的比例(duPont/InterMountainCanola；Hitzetal.，1995-參見參考文獻(xiàn)12)。5.通過在油菜子中分別表達(dá)椰子或草地塑料溶血-磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPATs；E.C.2.3.1.51)，在三?；视?TAGs)的sn-2位提高12∶0或22∶1的比例(Calgene；Knutzonetal.，1995a和b；-參見參考文獻(xiàn)17和18；Lassneretal.，1995-參見參考文獻(xiàn)21)。雖然植物轉(zhuǎn)基因的利用導(dǎo)致分別在月桂酸Canola和高芥子酸油菜子中改變sn-2月桂酸和芥子酸的比例，但種子油的月桂酸和芥子酸的總比例并不增加，也沒有證據(jù)表明這些轉(zhuǎn)基因植物中，脂肪酸含量或油產(chǎn)量增加。因此需要新方法，通過利用基因工程技術(shù)增加油類種子植物中的油產(chǎn)量和改進(jìn)它們的油組成。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是遺傳修飾油類種子植物以便提高這樣的植物、這樣的植物的種子、和這樣的植物產(chǎn)生的油的商業(yè)價值。本發(fā)明的另一個目的是提供改變來源于油類種子植物的油的產(chǎn)量和組成的方法。本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)來自酵母(啤酒酵母)的sn-2?；视椭觉；D(zhuǎn)移酶基因(SLC1-1和它的等位基因，SLC1)可以用來改變植物種子和葉子脂類的油含量和油組成。所以，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了其基因組中摻入了可表達(dá)的酵母SLC1-1或SLC1基因的轉(zhuǎn)基因油類種子植物。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了其基因組中摻入了可表達(dá)的酵母SLC1-1或SLC1基因的轉(zhuǎn)基因油類種子植物的種子。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因油類種子植物的方法，該方法包括在所說植物的基因組中導(dǎo)入可表達(dá)的酵母SLC1-1或SLC1基因。本發(fā)明還涉及用于本發(fā)明的方法的各種質(zhì)粒和載體，和在經(jīng)修飾含有SLC1-1和SLC1基因的植物中共同導(dǎo)入其它基因。本發(fā)明的優(yōu)點包括可以利用酵母SLC1-1和SLC1基因，在各種油類種子植物如Arabidopsisthaliana、在Brassicanapus的高芥子酸和canola品種和在Brassicacarinata中提高油含量和改變總脂肪酸組成，以及改變包括sn-2位點的TAG的?；M成，和改變TAG種類的相對比例這樣的事實。另外，在高芥子酸的蕓苔科植物中可以利用酵母sn-2?；D(zhuǎn)移酶(SLC1-1和SLCl基因)增加油含量和生產(chǎn)極長鏈的脂肪酸(VLCFAs)和TAGs含量增加的種子油類，對于極長鏈的脂肪酸，其立體特異性組成改變了。所以，與前面利用植物轉(zhuǎn)基因(如上面提到)的結(jié)果相反，本發(fā)明利用酵母轉(zhuǎn)化基因完成了種子油含量、種子芥子酸含量和種子油類中芥子酸的總比例的聯(lián)合增加。在蕓苔科的食用油品種(Canola-優(yōu)質(zhì)品種)也可以利用酵母sn-2?；D(zhuǎn)移酶(SLC1-1和SLC1基因)，增加油含量和生產(chǎn)油酸、聚不飽和脂肪酸和極長鏈的飽和脂肪酸的比例改變了的種子油。以同樣的方法可以利用有關(guān)的酵母SLC1-1和SLC1等位基因。兩個等位基因編碼sn-2?；D(zhuǎn)移酶；SLC1與SLC1-1的區(qū)別僅在于位置44的氨基酸(谷氨酸，Q)，而SLC1-1的位置44的氨基酸是亮氨酸(L)?？梢岳肧LC1-1和SLC1轉(zhuǎn)基因植物作為寄主種質(zhì)，進(jìn)一步負(fù)調(diào)節(jié)內(nèi)源性的植物酰基轉(zhuǎn)移酶。為了完成TAG生物合成的直接組裝以便產(chǎn)生立體特異性地設(shè)計的TAGs，需要協(xié)調(diào)地表達(dá)許多生化反應(yīng)，包括LPAT介導(dǎo)的。使外源LPAT的轉(zhuǎn)基因表達(dá)最佳以便合成具有新?；M成的TAG(如，在sn-2位置增加極長鏈脂肪酸)的明顯的可能性之一是可能需要同時負(fù)調(diào)節(jié)已經(jīng)存在于轉(zhuǎn)基因寄主中的內(nèi)源性的LPAT(如，通常優(yōu)先在sn-2位置插入聚不飽和C18脂肪?；鶊F(tuán)的LPAT)。酵母sn-2?；D(zhuǎn)移酶和已公開的植物sn-2酰基轉(zhuǎn)移酶(LPATs)之間的總的同源性是低的，并大部分局限于蛋白質(zhì)的C-末端。相反，植物酰基轉(zhuǎn)移酶互相之間的總同源性大得多，同源區(qū)擴(kuò)展到整個序列。所以，利用酵母SLC基因獲得本文敘述的效果，是以用植物?；D(zhuǎn)移酶進(jìn)行最初的轉(zhuǎn)化時不可能的方式進(jìn)一步改進(jìn)這些特性的唯一機(jī)會。實際上，在植物和酵母的sn-2?；D(zhuǎn)移酶之間的有限的同源性相當(dāng)?shù)?，足以允許用沒有對酵母轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)或植物種子發(fā)育形成負(fù)影響的常規(guī)方法負(fù)調(diào)節(jié)寄主植物L(fēng)PAT(例如，反義RNA技術(shù)或共同阻遏現(xiàn)象；Moletal.，1990；VanBloklandetal.，1993；DeLangeetal.，1995)。所以，酵母轉(zhuǎn)基因計劃的明顯優(yōu)于點是在存在高同源性的、原有LPAT的寄主植物中導(dǎo)入另一個植物轉(zhuǎn)化基因的計劃。可以利用酵母sn-2?；D(zhuǎn)移酶(SLC1-1和SLC1基因)在包括琉璃苣(Boragospp.)、蓖麻(Ricinuscommunis)、可可豆(Theobromacacao)、玉米(Zeamays)、棉花(Gossypiumspp)、兩蘆薺、萼距花、亞麻(Linumspp.)、類斯克懶勒和池花、田芥屬(Tropaeolumspp.)、月見草、橄欖(木樨欖屬spp.)、棕櫚(Elaeisspp.)、花生(Arachisspp)、紅花(Carthamusspp.)、大豆(Glycine和Sojaspp.)、向日葵(Helianthusspp.)、煙草(煙草屬spp.)和斑鳩菊的所有其它油類種子中增加油含量和改變TAG的?；M成。酵母sn-2?；D(zhuǎn)移酶(SLC1-1和SLC1基因)油類種子轉(zhuǎn)化體可用所有其它加價的脂肪酸生物合成基因(如，來自蓖麻或類斯克懶勒屬spp.的羥化酶基因)第二次轉(zhuǎn)化，或與已經(jīng)含有這樣的加價基因的有關(guān)的油類種子轉(zhuǎn)化體雜交，以便生產(chǎn)加價脂肪酸的量增加(如，對于那些含有羥基脂肪酸的增加羥基脂肪酸含量和改變TAG組成)的種子油?？梢岳肧LC1-1基因和有關(guān)的SLC1等位基因修飾蔬菜組織中脂肪酸和脂類的分布，以便改進(jìn)對生命的和無生命的植物應(yīng)力的耐受性(如，增加根和葉組織中的膜的流動性以便改進(jìn)對冰凍的耐受性)。以前沒有公開或證明(缺乏實踐)在植物中利用酵母SLC1-1基因和SLC1等位基因帶來總脂類含量和組成改變，這可作為控制脂肪酸(如，極長鏈脂肪酸)的相對比例或量以及用于增加生產(chǎn)食用或工業(yè)油的作物的油含量的方法。以前，還沒有轉(zhuǎn)基因途徑引起油產(chǎn)量增加的證據(jù)。更具體地說，過去還沒有證據(jù)表明植物中已經(jīng)表達(dá)了酵母?；D(zhuǎn)移酶(負(fù)責(zé)合成三酰基甘油的酶)能改變油組成或含量。相反，在突變的Arabidopsisthaliana中，二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的下降導(dǎo)致油產(chǎn)量的下降和?；M成的改變(Katavicetal.，(1995)植物生理，108399-409-參見參考文獻(xiàn)15)。附圖的簡要說明圖1顯示了用于本發(fā)明的酵母SLC1-1基因的編碼區(qū)的核苷酸(SEQIDNO1)和推測的氨基酸序列(SEQIDNO2)，終止密碼子被標(biāo)定為“β”，在細(xì)菌和酵母sn-2酰基轉(zhuǎn)移酶之間高度保守的同源序列的底下劃線；圖2顯示了用于本發(fā)明的酵母SLC1基因的編碼區(qū)的核苷酸(SEQIDNO3)和推測的氨基酸序列(SEQIDNO4)，終止密碼子被標(biāo)定為“β”，底下劃線部分為細(xì)菌和酵母sn-2細(xì)菌轉(zhuǎn)移酶之間高度保守的同源序列；圖3顯示了在后面提供的實驗細(xì)節(jié)中解釋的構(gòu)建SLC1-1植物轉(zhuǎn)化載體的計劃，顯著的特征沒有按比例繪制；和圖4-7以及下面的表1-20，顯示了后面提供的實驗細(xì)節(jié)解釋的實驗結(jié)果。實施本發(fā)明的最好方式圖1和2分別顯示了SLC1-1基因(SEQIDNO1)和SLC1等位基因(SEQIDNO3)的序列和它們衍生的肽結(jié)構(gòu)(SEQIDNO2和4)。在兩個出版物中已經(jīng)如下鑒定了酵母SLC1基因(和相關(guān)的SLC1-1阻遏物等位基因)(它的公開內(nèi)容引入本文作為參考)1.Lester，R.L.，Wells，G.B.，Oxford，G.和Dickson，R.C.(1993)缺失鞘脂類的啤酒酵母突變菌株合成模擬鞘脂類結(jié)構(gòu)的新肌醇甘油酯。J.Biol.Chem.268845-856-參考文獻(xiàn)22；和2.Nagiec，M.M.，Wells，G.B.，Lester，R.L.，和Dickson，R.C.(1993)能使啤酒酵母不制造鞘脂類也生長的阻遏基因編碼類似于大腸桿菌脂肪酰基轉(zhuǎn)移酶的蛋白質(zhì)。J.Biol.Chem.26822156-22163-參考文獻(xiàn)25。SLC1-1基因的編碼區(qū)的DNA和氨基酸序列以登記號Ll3282保存于GenBank/EMBL(保存序列包括本申請未公開的5′非翻譯區(qū))。SLC1基因是最初從缺失制造鞘脂類能力的酵母突變體中克降的。SLC1的突變等位基因顯示出編碼阻遏鞘脂類長鏈堿基生物合成的遺傳缺陷的蛋白質(zhì)。SLC1的基因序列與大腸桿菌PLSC基因同源，已經(jīng)有人聲明它編碼溶血-磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(LPAT；使溶血-磷脂酸(LPA)的sn-2位置酰基化得到磷脂酸(PA)的?；D(zhuǎn)移酶)。SLC1基因能補(bǔ)償JC201(PLSC突變的大腸桿菌菌株)的生長缺陷。根據(jù)在缺少長鏈堿基時生長的SLC菌株能制造新的磷脂酰肌醇衍生物的發(fā)現(xiàn)(Lesteretal.，(1993)J.BiolChem.268845-856.)，本作者的可能的結(jié)論是SLC1編碼能夠?qū)⒑〈嫉母视王サ膕n-2位置?；牡鞍踪|(zhì)(即，可能是溶血-磷脂酰肌醇酰基轉(zhuǎn)移酶，LPIT)。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，有人報道SLC1編碼酵母sn-2?；D(zhuǎn)移酶。但是，該論文的作者(Dickson，Lesteretal.)未能在互補(bǔ)的大腸桿菌JC201突變體中檢到LPAT的活性。在Nagiec等人的論文中，作者也報道了命名為SLC1-1的阻遏等位基因的基因序列，其中核苷酸131是T而不是A，導(dǎo)致44位置的氨基酸從谷氨酸變?yōu)榱涟彼?。該工作的假設(shè)是SLC1-1阻遏物等位基因編碼改變了底物特異性的突變的酰基轉(zhuǎn)移酶，這樣的特性使該酶能利用極長鏈脂肪酸(26∶1)，將含肌醇的甘油酯的sn-2位置?；?。作者至今還沒有提供SLC1-1或SLC1編碼的活性的最后證據(jù)。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明人在改變蕓苔科植物的極長鏈脂肪酸(VLCFA)含量上的需要，本發(fā)明人從肯德基大學(xué)(Lexington，肯德基，USA)的Dr.Dickson處得到含有SLC1-1阻遏物等位基因的質(zhì)粒p411ΔB/C。本發(fā)明人還確信在植物中表達(dá)該外源基因帶來更多的SLC1-1和SLC1編碼的特征信息。本發(fā)明人進(jìn)行的工作首次利用典型油類種子Arabidopsisthaliana鑒定了種子油含量增加、含極長鏈脂肪酸(VLCFAs＝＞C18)的TAGs的比例增加的轉(zhuǎn)化體。另外，存在在TAGs的sn-2位置的VLCFAs的比例增加，并伴隨著在該位置酯化的聚不飽和脂肪酸的比例下降。B.napus品種Hero和B.carinata的SLC1-1轉(zhuǎn)化體(兩個高芥子酸品種)顯示了每增加mg種子干重(DW)的油含量和芥子酸含量/增加。B.napus品種Westar(Canola優(yōu)質(zhì)品種)SLC1-1轉(zhuǎn)化體顯示油酸(18∶1)的比例增加并且聚不飽和脂肪酸(18∶2和18∶3)的比例下降。利用常規(guī)基因工程技術(shù)可以將SLC1-1和SLC1基因?qū)胗皖惙N子植物的基因組并表達(dá)。例如，轉(zhuǎn)化可以包括利用以土壤桿菌Ti質(zhì)粒為中介的轉(zhuǎn)化(如，植物內(nèi)、真空滲透、子葉或下胚軸葉柄受傷感染、或粒子轟擊，等等)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，基本組成型的或組織特異性的啟動子可以驅(qū)動該構(gòu)建體。可以預(yù)期本發(fā)明可在各種油類種子植物廣泛應(yīng)用，因為在所有這些植物中的同樣的或密切相關(guān)的生化途徑之后是油的合成(參見參考文獻(xiàn)29、30、37、38、39和40)。參考下面提供特別說明的實驗細(xì)節(jié)，詳細(xì)敘述本發(fā)明，但是，應(yīng)該記住的是本發(fā)明不限于下面提供的詳細(xì)敘述。詳細(xì)實驗構(gòu)建用于SLC1-1轉(zhuǎn)化的載體根據(jù)附圖的圖3說明的克隆計劃，將分別根據(jù)SLC1基因(SEQIDNO3)的5′和3′末端序列設(shè)計的帶有5′BamHI限制位點的延伸區(qū)的OM087(AGAGAGAGGGATCCATGAGTGTGATAGGTAGG)(SEQIDNO5)和OM088(GAGGAAGAAGGATCCGGGTCTATATACTACTCT)(SEQIDNO6)作為引物，將含有SLC基因的阻遏物等位基因(SLC1-1)的質(zhì)粒p411ΔB/C(從肯德基大學(xué)，Lexington，肯德基，USA的Dr.Dickson處得到)作為模板用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，以便產(chǎn)生兩個末端都帶有BamHI位點的SLC1-1PCR片段。所以，(SLC1-1)PCR片段代表了SLC1基因的阻遏物等位基因，該基因131位置上核苷酸T代替了核苷酸A，導(dǎo)致44殘基的氨基酸從谷氨酸變成亮氨酸。用BamHI消化該片段并連接進(jìn)位于載體pBI524(從NRC植物生物技術(shù)研究所(110體育館場，Saskatoon，Saskatchewan，加拿大，S7NOW9)的Dr.RajuS.S.Datla處得到，由Datlaetal.公開，1993-參見參考文獻(xiàn)9)的串聯(lián)35S啟動子和NOS終止子之間的BamHI克隆位點，從而得到載體SLC1-1-pBI-524。BglII的限制消化證實了SLC1-1在載體SLC1-1-pBI-524中的方向，該酶從5′末端在nt377處切割SLC1-1并在緊接35S啟動子的下游切割載體pBI524。SLC1-1的翻譯起始密碼子保留了，所以該構(gòu)建體是轉(zhuǎn)錄融合體。將含有串聯(lián)35S啟動子、AMV增強(qiáng)子、SLC1-1編碼序列和NOS終止子的HindIII和EcoRI片段從SLC1-1-pBI-524中游離出來，克隆進(jìn)載體RD400(也是從Dr.R.Datla處得到；由Datla等公開，1992-參見參考文獻(xiàn)8)的EcoRI-HindIII位點。通過電穿孔將最后的載體pSLC1-1/pRD400(于1996年5月9日根據(jù)布達(dá)佩斯條約以保藏號ATCC97545保藏于美國類型培養(yǎng)物保藏中心，12301Parklawn大道，Rockville，MD.20852，美國)導(dǎo)入根癌上壤桿菌菌株GV3101(含有輔助質(zhì)粒pMP90；Koncz和Schell，1986)。分子生物學(xué)技術(shù)除非另有說明，所有分子生物學(xué)技術(shù)通過一般按Ausubel等(1995)預(yù)先給定的方法進(jìn)行。植物生長條件如Katavic等(1995)所述，在同一時間，在控制的生長室內(nèi)，在連續(xù)的熒光照明度(150-200μEm-2sec-1)下，在22℃讓所有A.thaliana對照和轉(zhuǎn)基因植物生長。所有其它蕓苔科(B.napus，B.carinata)對照和轉(zhuǎn)基因植物在同一時間內(nèi)，在用高壓鈉燈(HPS燈)提供的自然光光期為16小時(16小時光/8小時暗)的P.B.I.轉(zhuǎn)基因植物中心溫室中于22℃和25-30％的相對濕度下生長。植物轉(zhuǎn)化用植物內(nèi)轉(zhuǎn)化技術(shù)在A.thaliana、兩個高和低芥子酸B.napus品種和B.carinata(通過帶有含SLC1-1構(gòu)建體的根癌土壤桿菌的子葉葉柄和下胚軸外植體的共同培養(yǎng)轉(zhuǎn)化)中測驗了SLC1-1/RD400。在A.thaliana中測驗SLC1-1構(gòu)建體讓Columbia生態(tài)型的野生型(WT)A.thaliana植物在上壤中生長。通過含有輔助藍(lán)曙紅質(zhì)粒pMP90(具有以反式作用的完整的vir區(qū)域、慶大霉素和卡那霉素選擇標(biāo)記的去除保護(hù)的Ti質(zhì)粒；Koncz和Schell(1986))和雙元載體pSLC1-1/pRD400的根癌土壤桿菌菌株GV3101的細(xì)菌懸浮液傷口接種過夜(Katavicetal.1994)或真空侵染過夜(Bechtoldetal.1993)進(jìn)行植物內(nèi)的轉(zhuǎn)化。在接種和浸染后，讓植物生長產(chǎn)生種子(T1)。大量收獲干種子(T1)并在含有50mg/l卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選。在選擇培養(yǎng)基上選擇2-3星期后將幼苗轉(zhuǎn)移到土壤中。從抗卡那霉素T1植物上分離葉子DNA并用SLC1-1片段的PCR擴(kuò)增分析。將來自T1植物的正在發(fā)育的葉子以及來自SLC1-1轉(zhuǎn)基因系的T2成熟的種子用于脂類和生化分析。在分析種子脂類時，將來自未轉(zhuǎn)化的野生型(WT)Columbia植物和pBI121轉(zhuǎn)基因植物(雙元載體pBI121，只含有卡那霉素選擇標(biāo)記和GUS報告基因；Jeffersonetal.，1987)的正在發(fā)育的葉子和成熟的種子用作對照。根據(jù)這些分析，讓展示改變了的?；M成和/或脂類含量的品系的T2種子生長在選擇培養(yǎng)基上(為了消除純合的WT分離體)并且然后轉(zhuǎn)移到土壤中生產(chǎn)T3種子群。在Brassicanapus和Brassicacarinata中測試SLC1-1構(gòu)建體用含有SLC1-1/RD400構(gòu)建體的根癌土壤桿菌共同培養(yǎng)子葉葉柄和下胚軸外植體，對蕓苔屬napus品種Westar(Canola變種，低芥子酸)、蕓苔屬napus品種Hero、Reston和Argentine(都是高芥子酸變種)和蕓苔屬carinata(育種系C90-1163，一個高芥子酸系)進(jìn)行轉(zhuǎn)化實驗。改變Moloney等人(1989)和DeBlock等人(1989)的轉(zhuǎn)化方法使轉(zhuǎn)化條件最佳。子葉葉柄轉(zhuǎn)化方法(Moloney等人1989)的修改包括在共同培養(yǎng)后在含有激素苯甲基腺嘌呤(BA)和抗生素替卡西林鈉-克拉維酸鉀的MS培養(yǎng)基上引入7天的外植體恢復(fù)期以去除土壤桿菌。下胚軸外植體轉(zhuǎn)化方法(DeBlocketal.；1989)的修改包括(1)在含有激素2，4-二氯苯乙酸(2，4-D)和激動素(K)的用瓊脂固化的MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)外植體；(2)在含有與預(yù)培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在無菌濾紙上將下胚軸外植體與土壤桿菌共同培養(yǎng)；(3)共同培養(yǎng)后，在含有激素(2，4-D和K)、和替卡西林鈉-克拉維酸鉀的培養(yǎng)基上給予7天的外植體恢復(fù)期以去除土壤桿菌；(4)在含有激素苯甲基腺嘌呤(BA)和玉米素(Z)、乙烯抑制劑硝酸銀(AgNO3)和抗生素替卡西林鈉-克拉維酸鉀(為了去除土壤桿菌)和卡那霉素(為了轉(zhuǎn)化細(xì)胞/幼芽的篩選)的MS培養(yǎng)基上再生轉(zhuǎn)基因幼芽。使綠色幼芽長根并轉(zhuǎn)移到土壤中。從止在發(fā)育的葉子中分離基因組DNA并進(jìn)行PCR分析和Southern分析(Southern，1975)。收獲來自轉(zhuǎn)基因植物的種子(T1)并在土壤上生長來自每個轉(zhuǎn)基因系的各10株T1植株。收獲來自這些植物的突變種子(T2)并進(jìn)行脂類和生化分析。脂類分析和?；D(zhuǎn)移酶(LPAT)測定來自SLC1-1和WT/pBI121轉(zhuǎn)基因的和未轉(zhuǎn)化的WT植物的葉子和種子脂類的分析如前所述(Tayloretal.，1992；Katavicetal.，1995)，從成熟的種子和正在發(fā)育的葉子中分離脂類并用GC分析總脂肪酸含量和脂肪酸組成。如Katavicetal.，1995所述用高溫GC分析三酰基甘油的種類。如Tayloretal(1994，1995a和b)所述對完整種子脂類(主要是TAGs)進(jìn)行TAG的立體特異性分析。LPAT測定對于葉子測定，從對照和SLC1-1轉(zhuǎn)基因植物中選擇中度伸展的葉子，并用軟木鉆具從幾片葉子上取下葉子組織樣品。對于正在發(fā)育的種子的測定，在A.thaliana中從對照(未轉(zhuǎn)化的WT和pBI121轉(zhuǎn)化)和選定的SLC1-1轉(zhuǎn)基因植物上收獲中度發(fā)育的種子的25-30個長角果得到正在發(fā)育的T3種子樣品。從對照和選定的SLC1-1轉(zhuǎn)基因植物的3個長角果收獲中等子葉發(fā)育時期的蕓苔屬napus和蕓苔屬carinataT2胚。馬上在液氮中冰凍所有植物材料并儲存于-70℃直到勻漿化。如Tayloretal.，(1995b)所述制備植物葉子和正在發(fā)育的種子組織的勻漿和進(jìn)行LPAT測定。如Ausubeletal.(1995，13.1單元，酵母遺傳學(xué)的基本技術(shù))所述進(jìn)行有關(guān)酵母菌株的所有測定。以28℃，在270r.p.m.，在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)野生型啤酒酵母和粟酒裂殖糖酵母菌株，過夜。在對數(shù)生長中期，取細(xì)胞樣，在5000r.p.m.離心沉淀5分鐘，并重懸浮于100mMHepes-NaOH(pH7.4)中。如Ausubeletal.(1995，單元13.1，13.13.4部分)所述用酸洗玻璃珠制備細(xì)胞溶菌物。在pH7.4，以100r.p.m.搖動，在30℃水浴10-30分鐘進(jìn)行LPAT測定。測定混合物(最后體積為0.5ml)含有蛋白質(zhì)(10-200μg取決于組織/提取物)90mM的Hepe-NaOH、0.5mMATP、0.5mMCoASH、2mM亞精銨、45μM18∶1-LPA和作為?；w的18μM[1-14C]-18∶1-CoA、[1-14C]-20∶1-CoA，或[1-14C]-22∶1-CoA(每種的比活性為10nCi/nmol)。Tayloretal(1995b)詳細(xì)敘述了測量LPAT活性的所有其它條件。成熟種子的1H-NMR用BrukerAM寬徑分光計，在360MHz對對照和SLC1-1轉(zhuǎn)化蕓苔屬napus品種Hero以及蕓苔屬carinata的全部種子進(jìn)行相關(guān)的油產(chǎn)量(Alexanderetal.，1967；Rutar，1989)的1H-NMR分析。為了減少重折光線的擴(kuò)展，將種子(35/樣品)在與磁場方向為54.7°的鋯轉(zhuǎn)子中以1kHz旋轉(zhuǎn)(磁性角樣品轉(zhuǎn)子，MASS)。結(jié)果酵母(啤酒酵母；粟酒裂殖糖酵母)sn-2酰基轉(zhuǎn)移酶(LPAT)的?；?CoA特異性利用18∶1的LPA作為?；荏w和各種放射性標(biāo)記的?；?CoA測定來自啤酒酵母和粟酒裂殖糖酵母的酵母細(xì)胞溶菌物的相對sn-2?；钚?。體外酵母LPAT的酰基-CoA特異性十分廣泛，LPAT能將內(nèi)源的(16∶0、18∶1)和非內(nèi)源的(18∶2、18∶3、20∶1、22∶1和蓖麻油酰)酰基基團(tuán)插入18∶1的LPA的sn-2位置，如下面的表1所示表1利用45μM的18∶1-L1PA作為酰基受體，測定啤酒酵母和粟酒裂殖糖酵母酰基-CoALPAT查相對活性由于酵母LPAT(sn-2?；D(zhuǎn)移酶)相對具有廣泛的特異性，可以預(yù)測用酵母SLC1-1基因轉(zhuǎn)化的富含極長鏈脂肪酸的油類種子(A.thaliana，B.napus)將導(dǎo)致包括sn-2位置的VLCFA含量富集。另外，可以預(yù)測酵母SLC1和SLC1-1轉(zhuǎn)化體是用來自蓖麻(R.communis)和雷斯克懶勒的羥化酶基因轉(zhuǎn)化以便生產(chǎn)富含羥基脂肪酸的種子油的良好寄主。另一種可選的方法，羥化酶轉(zhuǎn)化體可以與SLC1-1或SLC1轉(zhuǎn)化體有性雜交。A.thalianaSLC1-1轉(zhuǎn)化體種子脂類分析來自A.thaliana轉(zhuǎn)化體的數(shù)據(jù)表明，該基因?qū)ΨN子總脂類含量和TAG的sn-2組成有顯著影響。許多SLC1-1T2轉(zhuǎn)基因系(48個中有21個)明顯顯示比未轉(zhuǎn)化的對照和pBI121(沒有SLC1-1插入)對照油產(chǎn)量增加顯著，如下面表2所示表2未轉(zhuǎn)化的野生型(u-WT)A.thaliana、pBI121(-SLC1-1)A.thaliana轉(zhuǎn)化體(對照)和選定的用酵母SLC1-1基因轉(zhuǎn)化的A.thaliana的T2轉(zhuǎn)基因系的種子脂肪酸含量品系16∶018∶018∶118∶1cl18∶218∶320∶020∶120∶222∶022∶124∶0+Totalc9124∶1u-WT28.212.250.55.7101.171.97.774.88.71.98.31.3372.5對照pBI12128.412.454.24.199.966.26.774.07.1tr*7.2tr*360.2對照328.812.357.45.7114.178.87.782.59.65.78.61.7412.3737.118.4102.95.9111.684.47.671.88.02.97.72.7461.01633.012.562.06.2131.795.09.096.412.61.711.02.0473.02036.316.187.77.6153.395.910.7118.811.62.512.43.3556.42132.114.662.56.2121.389.19.489.39.92.29.72.4449.52231.913.057.35.9113.986.78.685.810.21.79.62.0426.52335.415.772.57.5139.795.610.5106.912.52.311.72.6512.72632.614.567.26.4124.187.69.794.410.32.39.72.3461.12929.313.557.76.4114.081.69.489.510.61.911.02.0426.73932.213.772.86.3129.382.08.9100.29.72.310.32.1469.74224.411.758.65.2123.083.011.8103.611.82.617.43.3456.25233.415.178.36.5116.957.811.2110.09.02.512.63.0456.25433.014.073.16.8131.391.210.1119.511.53.011.61.3506.3tr*＝痕量＜0.2wt％在某些SLC1-1T2系中，含VLCFA的TAG的比例(如表3和4)、和由此產(chǎn)生的種子總VLCFA、特別是二十烷基酸和芥子酸含量急劇增加(表5)。在某些情況下，VLCFA的總比例也增加(表6)。選擇那些顯示油含量和含VLCFA的TAG比例增加的SLC1-1轉(zhuǎn)化T2系，并種植各個種子得到T3子代系。來自幾個獨立的SLC1-1轉(zhuǎn)基因T3系的TAG的脂類分析指出，與pBI121對照T3轉(zhuǎn)化體相比，與增加的TAG含量(nmolTAG/100個種子；表8)有關(guān)的總脂類含量(以μg脂肪酸/100個種子報告；表7)明顯增加。具體地說，在幾個SLC1-1轉(zhuǎn)化體中，VLCFA(μg/100個種子；表7)的量和含VLCFA的C58和C60TAG的水平(表8)比pBI121對照植物大大增強(qiáng)。對來自選定的獨立的T3SLC1-1轉(zhuǎn)基因植物的TAG的立體特異性分析表明，它含有的sn-2位置的VLCFA(如，二十烷基酸，20∶1)的比例增加。這一趨勢是相符的，不管數(shù)據(jù)是以二十烷基酸代表的所有sn-2位置脂肪酸之間的比例還是以sn-2位置發(fā)現(xiàn)的TAG中的二十烷基酸的總比例(表9)表示。另外在SLC1-1轉(zhuǎn)基因植物中，與pBI121對照植物相比，在TAG的sn-2位置的VLCFA(如，二十烷基酸)比例的增加與伴隨著的該位置聚不飽和脂肪酸的比例下降(圖4)有關(guān)。表3在未轉(zhuǎn)化的WT對照A.thaliana和SLC1-1轉(zhuǎn)化體#42的T2種子中積累的TAG的種類(nmol/50粒種子±SD)品系TAG#→C50C52C54C56C58C60總數(shù)WTnmol5.944.3115.3163.356.95.9391.6對照±SD0.33.210.316.37.31.437.3(n＝5)mol％1.511.329.541.714.515100.0±SD0.10.40.70.40.80.3mol％C56-C6057.542nmol3.532.7108.1194.395.616.6450.8(n＝2)±SD0.10.20.90.41.20.83.5mol％0.87.224.043.121.23.7100.0±SD0.010.010.0040.30.10.2mol％C56-C6068.0表4在未轉(zhuǎn)化的WT對照A.thaliana和SLC1-1轉(zhuǎn)化體#16的T2種子中積累的TAG的種類(nmol/50粒種子±SD)品系TAG#→C50C52C54C56C58C60總數(shù)WTnmol5.944.3115.3163.356.95.9391.6對照SD0.33.210.316.37.31.437.3(n＝5)mol％1.511.329.541.714.51.5100.0SD0.10.40.70.40.80.3mol％C56-C6057.716nmol6.551.3144.1214.982.710.6510.1(n＝2)SD0.10.31.42.92.00.67.1mol％1.310.128.342.116.22.1100.0SD0.040.10.10.020.20.1mol％C56-C6060.4表5在未轉(zhuǎn)化的WT對照A.thaliana、pB1121對照和SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系的T2種子中花生酸(20∶1)、芥子酸(22∶1)和總的極長鏈脂肪酸(VLCFA)含量(微克/50粒種子)品系20∶122∶1總VLCFAsWT對照74.88.3102.8SD(n＝5)6.40.710.0pB1121對照73.87.096.7SD(n＝2)2.30.33.41696.411.0132.620118.812.4159.223106.911.7146.442103.617.4150.352110.012.6148.254119.511.6156.8表6在未轉(zhuǎn)化的WT對照(u-WT)、pB1121對照和選定的A.thaliana的SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系的T2種子中花生酸(20∶1)、芥子酸(22∶1)和總VLCFAs的比例(在50粒種子樣品中wt％)品系20∶1所有VLCFAsu-WT對照20.027.6pB1121對照20.526.34222.733.05224.132.55423.631.0表7pB1121對照(pB1121Con)和選定的A.thaliana的SLC1-轉(zhuǎn)基因品系的成熟的T3種子的總脂類含量(總FA的微克/100粒種子)和VLCFA含量(微克/100粒種子)品系總脂類含量VLCFA含量pB1121Cona483.5119.7pB1121Conb568.5127.2pB1121Conc519.7125.1pB1121Cond511.3122.3pB1121Con平均值520.7123.6±SE(n＝4)15.31.442-11137.9315.542-4851.7218.642-5984.6268.023-81056.1287.752-21109.2307.552-5870.0253.352-61039.1281.616-51955.3227.0表8pB1121對照(pB1121Con)和選定的A.thaliana的SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系的成熟的T3種子的總TAG含量和C58和C60TAG含量(nmol/100粒種子樣品)TAGC#→C50C52C54C56C58C60總數(shù)pB1121Con8.555.3130.9145.330.9nd*371.0±SD(n＝2)0.42.67.89.02.721.616-512.488.2214.7251.670.55.6642.923-817.7130.8333.6409.0106.88.01005.924-411.490.7259.6366.4127.714.3870.052-615.2106.1252.1322.785.56.0787.0*nd＝未檢測表9在pB1121對照(pB1121Con)和選定的A.thaliana的SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系的成熟的T3種子中，在TAGs的sn-2位置20∶1的比例(sn-220∶1的wt％)和在TAGs的sn-2位置總的20∶1的比例(在sn-2位置總20∶1的wt％)(wt％/100粒種子的樣品)品系sn-220∶1的wt％在sn-2位置總20∶1的wt％*pB1121Cona1.73.6pB1121Conb0.61.1pB1121Conc0.50.9pB1121Cond1.63.016-54.216.342-15.18.542-47.912.842-55.38.723-87.512.052-26.210.052-55.89.752-67.512.0*在sn-2位置總20∶1的wt％＝([sn-2/[3×％總20∶1]]％×100)B.napus和B.carinataSLC1-1轉(zhuǎn)化體種子脂類分析幾個B.napus品種Hero、品種Reston和B.carinataSLC1-1T2轉(zhuǎn)化體種子品系顯示油含量提高(表10)和芥子酸含量增高，以微克/毫克DW、或以微克/種子表示(表11)。對于B.napus品種Hero、品種Reston，與非轉(zhuǎn)化對照植物中相應(yīng)水平相比，幾個SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系的種子顯示芥子酸比例增高(表12)。選定的平均轉(zhuǎn)化Hero植物(植物4)和具有預(yù)測高油產(chǎn)量和高芥子酸表現(xiàn)型的SLC1-1轉(zhuǎn)化品系(品系8，植物6)的單個種子分析表明，對于單個插入物，這些特性的分布在種子群體中按照典型的孟德爾方式分離(表13)++++。對于這三個(高油含量、芥子酸含量提高、芥子酸比例提高)特性，Hero品系8植物6的一些種子(例如8-6K和8-6H品系的種子)顯示可能純合的WT(例如，種子8-6I)或純合的SLC1-1表現(xiàn)型，而對于這三個特性，其它品系顯示具有中間值的雜合WT/SLC1-1分布(例如，種子8-6B)。表10在未轉(zhuǎn)化的對照和選定的B.napus品種Hero和Reston的SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系的T2種子中，和在B.carinata可育系C90-1163的T2種子中的油含量(％干重量)(+SE，如果需要)品系油含量(％DW)B.napus品種Hero對照40.1±+1.75-146.75-448.77-345.37-646.47-944.98-445.98-650.98-744.98-1045.1B.napus品種Reston對照33.4±2.21-741.91-840.52-842.12-942.2B.carinataC90-1163品系對照35.9±1.1B.car10-1-742.8B.car2-3-639.9表11在未轉(zhuǎn)化的對照和選定的B.napus品種Hero的SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系的成熟T2種子中，和在B.carinata可育系C90-1163的成熟T2種子中的芥子酸含量(以微克/毫克或微克/種子表示)(±SE，對于對照)品系22∶122∶1(微克/毫克DW)(微克/種子)B.carinata品系C90-1163對照156.4±5.610-1-7180.4B.napus品種Hero對照195.5+11.7596.7±40.65-1247.9900.65-4249.4818.87-3236.1-7-6244.89127-9229.2857.68-4235.7923.28-6270.91020.38-7238.5888.238-10232.7900.43-1---未測定表12在未轉(zhuǎn)化的對照和選定的B.napus品種Hero和Reston的SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系的成熟T2種子中芥子酸的比例(以wt％表示)(+SE，對于對照)品系wt％22∶1B.napus品種Hero對照48.6+0.65-153.15-4--7-352.17-652.87-9--8-451.48-653.38-751.88-1053.63-158.3B.napus品種Reston對照34.7±0.21-1036.41-735.81-837.42-336.62-741.1-未測定表13在未轉(zhuǎn)化的對照植株和B.napus品種Hero的SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系8植株6的成熟T2單個種子中脂類含量的變化(以微克總脂肪酸/種子表示)和芥子酸的含量的變化(以微克22∶1/種子或wt％22∶1表示)(平均值±SE，AVG)品系/種子微克FAs/種子微克22∶1/種子wt％22∶1AVGCon41076.4±61.5507.1±33.746.9±0.8AVG-61441.7±67.3735.4±36.551.0±0.686G1324.8710.54.186H1704.3877.152.586I1175.4557.347.486J1206.8629.452.286K1694.7911.153.886A1351.6658.648.786B1304.5670.651.486C1221.1639.152.386D1449.0714.349.386E1678.2844.650.386F1748.0876.850.2在Hero的幾個轉(zhuǎn)基因品系中，sn-2位置的花生酸的比例和總VLCFAs的比例有可檢測的增加(表14)。酵母轉(zhuǎn)基因?qū)μ岣連.napus的sn-2位置的花生酸含量的效果明顯低于改變A.thaliana中sn-2位置的花生酸含量的能力(參見.表9)。但是，基于啤酒酵母sn-2位置?；D(zhuǎn)移酶對花生酰vs芥子酸酰-CoA的相對特異性(c.f.表1)，這一點可能預(yù)料不到。表14在未轉(zhuǎn)化的對照和選定的B.napus品種Hero的SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系的成熟T2種子中sn-2芥子酸和VLCFA含量品系/種子sn-222∶1sn-2VLCFAsHero對照1.53Hero8-62.84.6Hero8-6G3.64.44(單個種子)Hero3-14.124.12*Hero8-102.223.7芥子酸(22∶1)是唯一的VLCFA缺失。由GC分析TAG種類的組成顯示，Hero的幾個SLC1-1轉(zhuǎn)化體品系的C52TAGs的比例提高，并且C54和C56TAGs降低到最小(表15)。在HeroSLC1-1轉(zhuǎn)基因品系中，含有2或多種C22脂肪酸的C62-C66的TAGs的比例迅速增加(表15)，主要消耗含有兩個(C56)或三個(C54)C18脂肪酸的TAG(數(shù)據(jù)未列出)。在一些B.napus品種RestonSLC1-1轉(zhuǎn)基因品系中觀察到C62TAG的比例增加(表15)。表15在未轉(zhuǎn)化的對照和選定的B.napus品種Hero和Reston的SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系的成熟的T2種子中C62、C64、C66TAGs的比例(mol％)(±SE，對于對照)品系C62C64C66總C62-C66對照36.72±1.421.32±0.020.10±0.0138.14±1.45Hero5-251.441.810.1253.37Hero5-448.921.950.2551.12Hero5-1056.481.460.0858.02Hero7-157.252.190.1459.58Hero7-555.611.980.0957.68Hero8-444.782.140.2547.16Hero8-653.352.220.2255.79Reston對照18.320.940.0619.321-823.881.060.0725.012-731.671.420.1133.20關(guān)于種子對種子的C62TAG的比例變異，典型對照和SLC1-1B.napus品種Hero轉(zhuǎn)基因品系的分析顯示，SLC1-1T2種子的群體發(fā)生分離，但是與未轉(zhuǎn)化的對照相比，許多單個種子具有相當(dāng)高比例的C62TAGs(表16)。表16在未轉(zhuǎn)化的對照和B.napus品種Hero的SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系的成熟T2種子中，分析單個種子測定C62TAGs的比例(mol％)(平均值+SE，AVG)品系/種子C62TAGsHero對照4d38.544e40.294b36.884f38.814g30.054i35.954h42.844l40.814k43.28Hero對照AVG38.6+1.35Hero8-68-6d36.368-6a47.638-6b54.068-6c54.818-6f44.48-6g56.278-6h53.118-6l42.198-6j51.448-6k58.4Hero8-6AVG51.35±1.82SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系相對于對照而言，油產(chǎn)量提高的評估與以“每克干重”或以“每粒種子”的表示直接相關(guān)，如由非破壞性的1H-NMR方法測定的相對油含量(表6)。的確，在SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系中NMR測定的相對油產(chǎn)量提高的結(jié)果也與種子重量的提高正相關(guān)(表7)，并且表明種子干重量的增加是和油產(chǎn)量提高直接相關(guān)的，種子水份可忽視(在CH2OCO-和CHOCH-化學(xué)變換之間沒有較寬的水共振)。來自對照種子樣品和B.napus品種Hero和B.carinata的“高油”SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系典型的1H-NMR應(yīng)答描述于表17。表17在未轉(zhuǎn)化的對照和選定的B.napus品種Hero和Reston的SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系的T2種子和在B.carinata可育系C90-1163的T2種子中，對Liquidlike油(由Rutar；1989)進(jìn)行的磁共振產(chǎn)生的1H-NMR摻入應(yīng)答(35粒種子樣品；相對于對照摻入的應(yīng)答，設(shè)定在1.000)品系NMR摻入應(yīng)答B(yǎng).napus品種Hero對照1.0000Hero5-11.5175Hero7-31.2721Hero7-61.3875Hero7-91.3245Hero8-41.5667Hero8-61.5297Hero8-71.4825Hero8-101.6302B.carinata品種C90-1163對照1.0000B.carinata10-1-71.5977B.carinata2-3-61.7548一些B.napus變種Westar(Canola)SLC1-1T2轉(zhuǎn)化種子品系顯示油酸的相對比例提高，聚不飽和脂肪酸(18∶2和18∶3)的相對比例相應(yīng)降低(表18)。這與在Kentucky大學(xué)的專利申請中記載的預(yù)測效果相反。由此，由于SLC1-1的表達(dá)，在食用油中單不飽和脂肪酸的比例提高。此外，在這些Canola品系中，極長鏈飽和脂肪酸的比例顯著提高(表18)。表18在未轉(zhuǎn)化的對照和選定的B.napus品種WESTAR的SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系(n＝2或3)中油酸、亞油酸和飽和VLCFA組合物(n＝2或3)品系油酸亞油酸亞油酸花生酸山榆酸二十四酸18∶1c918∶2c9，1218∶3c9，20∶022∶024∶012，15B.napus品種WESTAR對照61.0317.5511.070.550.310.27WS-1370.0314.803.410.760.490.56WS-1571.9212.333.710.780.530.48WS-1671.0612.293.870.970.590.56WS-15a72.719.693.090.940.650.68轉(zhuǎn)化體品系的LPAT分析與未轉(zhuǎn)化對照相比B.napus品種WESTAR和品種Argentine的SLC1-1的T1轉(zhuǎn)化體品系的樣品顯示在快速擴(kuò)展的葉片勻漿制劑中，18∶1-CoA∶LPAT活性提高(表19)。未轉(zhuǎn)化的對照和選定的B.napus品種Hero和B.carinata品種的SLC1-1的轉(zhuǎn)基因品系的發(fā)育種子LPAT活性顯示在SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系中18∶1-CoA∶LPAT和22∶1-CoA∶LPAT(表19)比活性急劇提高。未轉(zhuǎn)化的對照和A.thaliana的SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系中發(fā)育種子LPAT活性顯示在幾個SLC1-1轉(zhuǎn)基因品系中20∶1-CoA∶LPAT活性提高(表19)。因此，在我們的證明中，第一次提供了直接證據(jù)，酵母SLC1-1基因產(chǎn)物編碼具有sn-2酰基轉(zhuǎn)移酶活性的酶，并且體外可以顯示LPAT(EC2.3.1.51)活性。表19從未轉(zhuǎn)化的對照和選定的B.napus品種WESTAR、Argentine和Hero，B.carinata品種C90-1163和A.thaliana哥倫比亞變種的SLC1-1的轉(zhuǎn)基因品系的T1葉片和T2或T3發(fā)育種子制備的勻漿的相對LPAT活性。所有實驗按照實驗部分的描述進(jìn)行。品系分析的組織分析的LPAT活性摻入到PA的DPM14C?；?CoA/微克prB.napusT2葉片18∶1-CoA品種WESTAR對照307ws2-51008ws3-8617ws6-71428B.napusT2葉片18∶1-CoA品種Arg.對照350Arg2-8996Arg3-31557B.napusT2發(fā)育種子18∶1-CoA品種Hero對照580Hero3-13470Hero7-62035Hero8-61370B.carinataT2發(fā)育種子18∶1-CoA品種C90-1163對照720B.carinata10-1-71125B.napusT2發(fā)育種子22∶1-CoA表19續(xù)品系分析的組織分析的LPAT活性摻入到PA的DPM14C酰基-CoA/微克pr品種Hero對照6.4Hero3-168.3Hero7-653.4Hero8-620.2A.thalianaT2發(fā)育種子20∶1-CoAWTu-對照23842-127042-438042-5503SLC1-1轉(zhuǎn)化體的遺傳分析在表20中概括了在該沉積作用中記載的轉(zhuǎn)基因植物的PCR和Southern分析資料。表20SLC1-1T2轉(zhuǎn)基因植物品系的PCR和Southern數(shù)據(jù)的概述(nd＝未測定)</tables>按照A.thalianaSLC1-1轉(zhuǎn)化體T2子代的分離方式，將顯示油含量提高以及長(C18)和極長鏈脂肪酸(C20和C22)的量提高的轉(zhuǎn)基因品系(例如，品系16，20)的種子滅菌，在選擇性培養(yǎng)基(含50mg/l卡那霉素)上繁殖。兩種品系顯示相同的3∶1(卡那霉素抗性∶卡那霉素敏感)分離方式，它顯示標(biāo)記物作為一個孟德爾位點分離。Southern雜交分析(Southern，1975)證實每個基因組中存在單個的T-DNA插入物。對于品系23、42、52和54，Southern雜交分析暗示所有品系的各基因組都具有一個以上的T-DNA。從長角果的A.thaliana品系16、20、23、42、52和54分離的發(fā)育中期的種子的Northern雜交分析證實，在所有測試的品系中都表達(dá)SLC1-1基因，品系42表達(dá)量最高。從B.napus品種WESTAR轉(zhuǎn)基因品系(2、3、6、13、15、16)分離的基因組DNA的Southern分析顯示，只有品系13具有單個插入物。B.napus變種ArgentineSLC1-1轉(zhuǎn)基因品系(2、3)具有多個插入物。B.napus品種Hero轉(zhuǎn)基因品系(3、5、7、8)和B.carinata轉(zhuǎn)基因品系10各具有一個個插入物，而B.carinata品系2每個基因組具有多個T-DNA插入物。序列表(1)總的資料(i)申請人(A)名稱加拿大國家研究委員會(B)街道Montreal路，1200號(C)城市渥太華(D)州Ontario(E)國家加拿大(F)郵政編碼(ZIP)K1A0R6(A)名稱Zou，Jitao(B)街道#3E-1800大道(C)城市Saskatoon(D)州Saskatchewan(E)國家加拿大(F)郵政編碼(ZIP)S7H2Z6(A)名稱Taylor，DavidC.(B)街道622WollastonBay(C)城市Saskatoon(D)州Saskatchewan(E)國家加拿大(F)郵政編碼(ZIP)S7J4C3(A)名稱Katavic，Vesna(B)街道3011121CMcKercherDrive(C)城市Saskatoon(D)州Saskatchewan(E)國家加拿大(F)郵政編碼(ZIP)S7H5B8(A)名稱MacKenzie，SamuelL.(B)街道17CambridgeCrescent(C)城市Saskatoon(D)州Saskatchewan(E)國家加拿大(F)郵政編碼(ZIP)S7H3P9(A)名稱Keller，WilfredA(B)街道234Emmeline路(C)城市Saskatoon(D)州Saskatchewan(E)國家加拿大(F)郵政編碼(ZIP)S7J5B6(ii)發(fā)明名稱利用酵母SLC基因修飾植物脂類和種子油(iii)序列數(shù)6(iv)計算機(jī)可讀形式(A)媒體類型Floppy軟盤(B)計算機(jī)IBMPC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，版本#1.30(EPO)(2)SEQIDNO1的資料(i)序列特征(A)長度947堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來源(A)生物體啤酒酵母(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)定位1..909(xi)序列描述SEQIDNO1ATGAGTGTGATAGGTAGGTTCTTGTATTACTTGAGGTCCGTGTTGGTC48MetSerValIleGlyArgPheLeuTyrTyrLeuArgSerValLeuVal151015GTACTGGCGCTTGCAGGCTGTGGCTTTTACGGTGTAATCGCCTCTATC96ValLeuAlaLeuAlaGlyCysGlyPheTyrGlyValIleAlaSerIle202530CTTTGCACGTTAATCGGTAAGCAACATTTGGCTCTGTGGATTACTGCG144LeuCysThrLeuIleGlyLysGlnHisLeuAlaLeuTrpIleThrAla354045CGTTGTTTTTACCATGTCATGAAATTGATGCTTGGCCTTGACGTCAAG192ArgCysPheTyrHisValMetLysLeuMetLeuGlyLeuAspValLys505560GTCGTTGGCGAGGAGAATTTGGCCAAGAAGCCATATATTATGATTGCC240ValValGlyGluGluAsnLeuAlaLysLysProTyrIleMetIleAla65707580AATCACCAATCCACCTTGGATATCTTCATGTTAGGTAGGATTTTCCCC288AsnHisGlnSerThrLeuAspIlePheMetLeuGlyArgIlePhePro859095CCTGGTTGCACAGTTACTGCCAAGAAGTCTTTGAAATACGTCCCCTTT336ProGlyCysThrValThrAlaLysLysSerLeuLysTyrValProPhe100105110CTGGGTTGGTTCATGGCTTTGAGTGGTACATATTTCTTAGACAGATCT384LeuGlyTrpPheMetAlaLeuSerGlyThrTyrPheLeuAspArgSer115120125AAAAGGCAAGAAGCCATTGACACCTTGAATAAAGGTTTAGAAAATGTT432LysArgGlnGluAlaIleAspThrLeuAsnLysGlyLeuGluAsnVal130135140AAGAAAAACAAGCGTGCTCTATGGGTTTTTCCTGAGGGTACCAGGTCT480LysLysAsnLysArgAlaLeuTrpValPheProGluGlyThrArgSer145150155160TACACGAGTGAGCTGACAATGTTGCCTTTCAAGAAGGGTGCTTTCCAT528TyrThrSerGluLeuThrMetLeuProPheLysLysGlyAlaPheHis165170175TTGGCACAACAGGGTAAGATCCCCATTGTTCCAGTGGTTGTTTCCAAT576LeuAlaGlnGlnGlyLysIleProIleValProValValValSerAsn180185190ACCAGTACTTTAGTAAGTCCTAAATATGGGGTCTTCAACAGAGGCTGT624ThrSerThrLeuValSerProLysTyrGlyValPheAsnArgGlyCys195200205ATGATTGTTAGAATTTTAAAACCTATTTCAACCGAGAACTTAACAAAG672MetIleValArgIleLeuLysProIleSerThrGluAsnLeuThrLys210215220GACAAAATTGGTGAATTTGCTGAAAAAGTTAGAGATCAAATGGTTGAC720AspLysIleGlyGluPheAlaGluLysValArgAspGlnMerValAsp225230235240ACTTTGAAGGAGATTGGCTACTCTCCCGCCATCAACGATACAACCCTC768ThrLeuLysGluIleGlyTyrSerProAlaIleAsnAspThrThrLeu245250255CCACCACAAGCTATTGAGTATGCCGCTCTTCAACATGACAAGAAAGTG816ProProGlnAlaIleGluTyrAlaAlaLeuGlnHisAspLysLysVal260265270AACAAGAAAATCAAGAATGAGCCTGTGCCTTCTGTCAGCATTAGCAAC864AsnLysLysIleLysAsnGluProValProSerValSerIleSerAsn275280285GATGTCAATACCCATAACGAAGGTTCATCTGTAAAAAAGATGCAT909AspValAsnThrHisAsnGluGlySerSerValLysLysMetHis290295300TAAGCCACCACCACATTTTTAGAGTAGTATATAGACCC947(2)SEQIDNO2的資料(i)序列特征(A)長度303氨基酸(B)類型氨基酸(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO2MetSerValIleGlyArgPheLeuTyrTyrLeuArgSerValLeuVal151015ValLeuAlaLeuAlaGlyCysGlyPheTyrGlyValIleAlaSerIle202530LeuCysThrLeuIleGlyLysGlnHisLeuAlaLeuTrpIleThrAla354045ArgCysPheTyrHisValMetLysLeuMetLeuGlyLeuAspValLys505560ValValGlyGluGluAsnLeuAlaLysLysProTyrIleMetIleAla65707580AsnHisGlnSerThrLeuAspIlePheMetLeuGlyArgIlePhePro859095ProGlyCysThrValThrAlaLysLysSerLeuLysTyrValProPhe100105110LeuGlyTrpPheMetAlaLeuSerGlyThrTyrPheLeuAspArgSer115120125LysArgGlnGluAlaIleAspThrLeuAsnLysGlyLeuGluAsnVal130135140LysLysAsnLysArgAlaLeuTrpValPheProGluGlyThrArgSer145150155160TyrThrSerGluLeuThrMetLeuProPheLysLysGlyAlaPheHis165170175LeuAlaGlnGlnGlyLysIleProIleValProValValValSerAsn180185190ThrSerThrLeuValSerProLysTyrGlyValPheAsnArgGlyCys195200205MetIleValArgIleLeuLysProIleSerThrGluAsnLeuThrLys210215220AspLysIleGlyGluPheAlaGluLysValArgAspGlnMetValAsp225230235240ThrLeuLysGluIleGlyTyrSerProAlaIleAsnAspThrThrLeu245250255ProProGlnAlaIleGluTyrAlaAlaLeuGlnHisAspLysLysVal260265270AsnLysLysIleLysAsnGluProValProSerValSerIleSerAsn275280285AspValAsnThrHisAsnGluGlySerSerValLysLysMetHis290295300(2)SEQIDNO3的資料(i)序列特征(A)長度947堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)定位1..909(xi)序列描述SEQIDNO3ATGAGTGTGATAGGTAGGTTCTTGTATTACTTGAGGTCCGTGTTGGTC48MetSerValIleGlyArgPheLeuTyrTyrLeuArgSerValLeuVal151015GTACTGGCGCTTGCAGGCTGTGGCTTTTACGGTGTAATCGCCTCTATC96ValLeuAlaLeuAlaGlyCysGlyPheTyrGlyValIleAlaSerIle202530CTTTGCACGTTAATCGGTAAGCAACATTTGGCTCAGTGGATTACTGCG144LeuCysThrLeuIleGlyLysGlnHisLeuAlaGlnTrpIleThrAla354045CGTTGTTTTTACCATGTCATGAAATTGATGCTTGGCCTTGACGTCAAG192ArgCysPheTyrHisValMetLysLeuMetLeuGlyLeuAspValLys505560GTCGTTGGCGAGGAGAATTTGGCCAAGAAGCCATATATTATGATTGCC240ValValGlyGluGluAsnLeuAlaLysLysProTyrIleMerIleAla65707580AATCACCAATCCACCTTGGATATCTTCATGTTAGGTAGGATTTTCCCC288AsnHisGlnSerThrLeuAspIlePheMetLeuGlyArgIlePhePro859095CCTGGTTGCACAGTTACTGCCAAGAAGTCTTTGAAATACGTCCCCTTT336ProGlyCysThrValThrAlaLysLysSerLeuLysTyrValProPhe100105110CTGGGTTGGTTCATGGCTTTGAGTGGTACATATTTCTTAGACAGATCT384LeuGlyTrpPheMetAlaLeuSerGlyThrTyrPheLeuAspArgSer115120125AAAAGGCAAGAAGCCATTGACACCTTGAATAAAGGTTTAGAAAATGTT432LysArgGlnGluAlaIleAspThrLeuAsnLysGlyLeuGluAsnVal130135140AAGAAAAACAAGCGTGCTCTATGGGTTTTTCCTGAGGGTACCAGGTCT480LysLysAsnLysArgAlaLeuTrpValPheProGluGlyThrArgSer145150155160TACACGAGTGAGCTGACAATGTTGCCTTTCAAGAAGGGTGCTTTCCAT528TyrThrSerGluLeuThrMetLeuProPheLysLysGlyAlaPheHis165170175TTGGCACAACAGGGTAAGATCCCCATTGTTCCAGTGGTTGTTTCCAAT576LeuAlaGlnGlnGlyLysIleProIleValProValValValSerAsn180185190ACCAGTACTTTAGTAAGTCCTAAATATGGGGTCTTCAACAGAGGCTGT624ThrSerThrLeuValSerProLysTyrGlyValPheAsnArgGlyCys195200205ATGATTGTTAGAATTTTAAAACCTATTTCAACCGAGAACTTAACAAAG672MetIleValArgIleLeuLysProIleSerThrGluAsnLeuThrLys210215220GACAAAATTGGTGAATTTGCTGAAAAAGTTAGAGATCAAATGGTTGAC720AspLysIleGlyGluPheAlaGluLysValArgAspGlnMetValAsp225230235240ACTTTGAAGGAGATTGGCTACTCTCCCGCCATCAACGATACAACCCTC768ThrLeuLysGluIleGlyTyrSerProAlaIleAsnAspThrThrLeu245250255CCACCACAAGCTATTGAGTATGCCGCTCTTCAACATGACAAGAAAGTG816ProProGlnAlaIleGluTyrAlaAlaLeuGlnHisAspLysLysVal260265270AACAAGAAAATCAAGAATGAGCCTGTGCCTTCTGTCAGCATTAGCAAC864AsnLysLysIleLysAsnGluProValProSerValSerIleSerAsn275280285GATGTCAATACCCATAACGAAGGTTCATCTGTAAAAAAGATGCAT909AspValAsnThrHisAsnGluGlySerSerValLysLysMetHis290295300TAAGCCACCACCACATTTTTAGAGTAGTATATAGACCC967(2)SEQIDNO4的資料(i)序列特征(A)長度303氨基酸(B)類型氨基酸(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO4MetSerValIleGlyArgPheLeuTyrTyrLeuArgSerValLeuVal151015ValLeuAlaLeuAlaGlyCysGlyPheTyrGlyValIleAlaSerIle202530LeuCysThrLeuIleGlyLysGlnHisLeuAlaGlnTrpIleThrAla354045ArgCysPheTyrHisValMetLysLeuMetLeuGlyLeuAspValLys505560ValValGlyGluGluAsnLeuAlaLysLysProTyrIleMerIleAla65707580AsnHisGlnSerThrLeuAspIlePheMetLeuGlyArgIlePhePro859095ProGlyCysThrValThrAlaLysLysSerLeuLysTyrValProPhe100105110LeuGlyTrpPheMetAlaLeuSerGlyThrTyrPheLeuAspArgSer115120125LysArgGlnGluAlaIleAspThrLeuAsnLysGlyLeuGluAsnVal130135140LysLysAsnLysArgAlaLeuTrpValPheProGluGlyThrArgSer145150155160TyrThrSerGluLeuThrMetLeuProPheLysLysGlyAlaPheHis165170175LeuAlaGlnGlnGlyLysIleProIleValProValValValSerAsn180185190ThrSerThrLeuValSerProLysTyrGlyValPheAsnArgGlyCys195200205MetIleValArgIleLeuLysProIleSerThrGluAsnLeuThrLys210215220AspLysIleGlyGluPheAlaGluLysValArgAspGlnMetValAsp225230235240ThrLeuLysGluIleGlyTyrSerProAlaIleAsnAspThrThrLeu245250255ProProGlnAlaIleGluTyrAlaAlaLeuGlnHisAspLysLysVal260265270AsnLysLysIleLysAsnGluProValProSerValSerIleSerAsn275280285AspValAsnThrHisAsnGluGlySerSerValLysLysMetHis290295300(2)SEQIDNO5的資料(i)序列特征(A)長度32堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO5AGAGAGAGGGATCCATGAGTGTGATAGGTAGG(2)SEQIDNO6的資料(i)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO6GAGGAAGAAGGATCCGGGTCTATATACTACTCT本發(fā)明涉及的參考文獻(xiàn)1.Alexander，D.E.，Silvela，L.S.，Collins，F(xiàn).I.andRodgers，R.C.(1967)，采用寬線NMR分析玉米的油含量。J.Am.OilChem.Soc.44555-558。2.Ausubel，F(xiàn).M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.andStuhl，K.(1995)，現(xiàn)代分子生物學(xué)方案，第1、2、3卷。3.Bechtold，N.，Ellis，J.，andPelletier，G.(1993)，通過侵染成年的Arabidopsisthaliana植物完成植物的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。CRAcadSciParis，Sciencesdelavie/Lifesciences3161194-1199。4.Brown，A.P.，Coleman，J.，Tommey，A.M.，Watson，M.D.，andSlabas，A.R.(1994)，分離和鑒定玉米cDNA所述cDNA與大腸桿菌的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸?；泼杆嵬蛔凅w互補(bǔ)并且編碼類似于其他酰基轉(zhuǎn)移酶的蛋白質(zhì)。植物分子生物學(xué)26211-223。5.Brown，A.P.，Brough，C.L.，Kroon，J.T.M.andSlabas，A.R.，(1995)，來自Limnanthesdouglasii的編碼1-酰基-sn-甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶的cDNA的鑒定。植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