專利名稱：構建轉纖維素酶基因釀酒酵母的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及構建轉纖維素酶基因釀酒酵母的方法，屬于轉纖維素酶基因釀酒酵母的分子生物學技術方法。
背景技術：
傳統(tǒng)的釀酒技術是利用物料中的淀粉在酶的作用下轉化成單糖，再在釀酒酵母的作用下進一步發(fā)酵成酒精。因為原料的淀粉是被細胞壁包圍住的，不容易被利用，所以常要進行蒸料，使淀粉糊化，淀粉受熱吸水膨脹，使細胞破裂，其中一部分淀粉被溶解。這樣，淀粉粒就容易被液化酶和糖化酶作用而分解成單糖，進一步被釀酒酵母所利用發(fā)酵產生酒精，所以蒸料要蒸得熟透，否則就會造成液化和糖化困難。由此可見，傳統(tǒng)的釀酒技術由于需要對淀粉進行蒸料處理，明顯存在費事耗時，成本較高，而且效率較低的問題。
為提高酒精的發(fā)酵效率，所屬領域技術人員采用了不同方法進行了研究，如中國專利200510014727.6公開了“一種甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇產量的釀酒酵母菌株及構建方法”，采用基因工程技術缺失編碼鑲嵌在細胞膜上的甘油通道蛋白基……。但它是通過基因缺失來調控其代謝路線，而且基因缺失對釀酒酵母的生活力也存在一定的影響。

發(fā)明內容
針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵反應穩(wěn)定、周期短，酒精產出率高的構建轉纖維素酶基因釀酒酵母的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種構建轉纖維素酶基因釀酒酵母的方法，其特征在于該方法包括如下步驟--從動物中獲得纖維素酶基因；
--利用載體將此基因融合到釀酒酵母基因組中。
其具體步驟包括提取福壽螺的總mRNA；進行反轉錄合成cDNA；再通過PCR擴增出福壽螺纖維素酶基因；PCR產物的回收用Agarose Gel DNA Extraction Kit回收目標帶，該纖維素酶基因片斷命名為Hase；進行克隆和測序(1)連接反應，在PCR擴增的過程中，TaqDNA聚合酶具有在雙鏈DNA3末端加上一個非模板來源的核苷酸A的特性，使擴增產物具有A突出末端；將PCR產物與含有T末端的pMD18-T載體連接，完成PCR產物的克?。?2)感受態(tài)細胞的制備與轉化采用CaCL2法制備感受態(tài)細胞；(3)陽性克隆的篩選用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG對克隆進行初步篩選；(4)質粒提取從擴增到目的片段的陽性克隆中取一個單菌落接種于5mL LB培養(yǎng)基(氨芐青霉素，50ug/ml)，37℃，培養(yǎng)12-16小時；12000轉/min離心收集細胞；用堿法提取質粒，質粒經EcoRI、BamHI酶切消化，10μL體系質粒4μL，H2O4μL，BamHI緩沖液1μL，EcoRI、BamHI酶各0.5μL；再次驗證是否有外源片段插入；(5)測序重組質粒序列測序；再驗正分析其序列的正確性，得到的質粒命名為pMD18-Thase。
用BamHI和EcoRI酶對pMD18-THase和酵母表達質粒pYES2進行30℃酶切；表達質粒pYES2酶切后用磷酸酯酶(CIP)進行脫5’-P處理，再進行連接；構建重組pYES2-Hase質粒，用氯化鈣法轉化至JM109感受態(tài)細胞；宿主菌為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，將pYES2-Hase質粒轉化至釀酒酵母菌株，進行重組Sc-Hase工程菌株的構建與篩選；通過PCR、酶切和測序檢測正確的重組酵母菌Sc-Hase。
本發(fā)明對纖維素酶基因的序列設計引物，根據(jù)已經報道的福壽螺纖維素酶基因序列，按照一般引物設計原則，以編碼區(qū)為模板設計引物，引物兩端帶有本序列中沒有BamHI和EcoRI的酶切位點。先合成cDNA第一鏈，再以cDNA為模板用上游引物和下游引物將全長福壽螺纖維素酶基因編碼區(qū)序列擴增出來，克隆測序，再酶切與表達載體連接，再轉化到表達宿主中。
相比現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明從動物中通過RT-PCR獲得纖維素酶基因，再利用分子生物學技術和方法，用載體將此基因融合到釀酒酵母基因組中，使纖維素酶消解細胞壁纖維素并轉化為糖，也由于細胞壁的消解，可進一步充分利用細胞內的淀粉，提高酒精轉化率，可提高酒精產出率15-25％。本發(fā)明讓纖維素酶在釀酒酵母作用的同時，使細胞壁纖維素轉化為二糖或單糖，并使細胞內的淀粉不斷釋放到反應體系中，進一步糖化發(fā)酵產生酒精。它具有發(fā)酵反應穩(wěn)定，周期短，酒精產出率高的優(yōu)點；因而，可有效降低釀酒成本。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明不僅限于這些例子。
1、提取福壽螺的總mRNA，反轉錄。mRNA的提取，自螺中取出新鮮的胃組織樣品約600mg，在液氮中速凍，充分研磨后用Promega公司PolyATtractSystem 1000 with Magnetic Stand提取mRNA；2、進行反轉錄擴增cDNA。1.5μLmRNA、2μLOligodT和7.6μLH2O65℃10分鐘，再冰浴2分鐘，加入4μL5M-MLV-buffer、2.5μLdNTP和AMV反轉錄酶(Promega)2μL41℃60分鐘，再65℃滅酶的活性，-20℃保存待用。
3、再通過PCR擴增出福壽螺纖維素酶基因，反應體系18μLNuclease-Free Water、2.5μL 10XPCR Reaction buffer、1μL上游引物(10mM)、1μL下游引物(10mM)、0.5μLdNTP(10mM)、1.5μLMgCl2(25mM)、0.25μL Taq DNA Polymerase(保真酶5U/μL)、1μLcDNA(稀釋50倍)。
反應程序95℃5min，1個循環(huán)；94℃1min，58℃50S，72℃1min，35個循環(huán)；72℃10min，1個循環(huán)；4℃保存。
4、PCR產物的回收PCR產物在1倍TAE配制的2％瓊脂糖凝膠上電泳。待目標帶分離較好時，用刀片將目標帶所在的膠塊切下，盡量切去多余的膠，放在干凈的1.5ml eppendorf管中。用Agarose Gel DNA Extraction Kit回收目標帶，該纖維素酶基因片斷命名為H。
克隆和測序。1)連接反應，在PCR擴增的過程中，TaqDNA聚合酶具有在雙鏈DNA 3末端加上一個非模板來源的核苷酸A的特性，使擴增產物具有A突出末端。將PCR產物與含有T末端的pMD18-T載體連接，就可以完成PCR產物的克隆。10μL連接反應體系如下pMD 18-T載體(大連寶生物公司產)，2.5ng；外源片段DNA片斷H，10ng；ligation Solution(連接液)，5μL。16℃反應過夜。
2)感受態(tài)細胞的制備與轉化。感受態(tài)細胞的制備與轉化采用CaCL2法制備感受態(tài)細胞挑取單菌落于10mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250r/min培養(yǎng)過夜(12-16小時)；第二天取1mL該培養(yǎng)液接種于100mL LB中，37℃，250r/min培養(yǎng)至OD600＝0.375，約2h；置于冰上5-10min，1800r/min、8min離心，收集細胞；加10ml冰冷的CaCl2溶液重懸細胞，1800r/min、8min離心；加10mL冰冷的CaCl2溶液重懸細胞，冰上放置沉淀，去上液，定容2mL，置于冰上過夜；次日取100μL制備的感受態(tài)細胞到1.5mL離心管中，加入5μL連接好的質粒DNA，冰上放置30min；42℃，90s熱休克，立即放于冰上2min，加入0.5ml LB培養(yǎng)液于37℃，150r/min培養(yǎng)1h；取50-200μL菌液涂布LB(含有X-gal，IPTG，氨芐青霉素，50ug/ml)平板，37℃過夜培養(yǎng)。
3)陽性克隆的篩選用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG對克隆進行初步篩選。藍色菌落為陰性菌落，白色菌落雖大多數(shù)為陽性菌落，還需用PCR法進一步驗證挑取單個白色菌落，重懸于10μLTE中，以此菌液為模板，PCR法確認pMD18-T載體中插入片段的大小。
PCR體系如下重懸菌液TE1μL，H2O18μL，10X PCR緩沖液(ReactionBuffer)2.5μL，dNTP(10mM)0.5μL；上游引物(10mM)引物1μL，(下游引物(10mM)引物1μL，MgCL2(25mM)1.5μL，Taq DNA聚合酶(Ploymerase)(5U/μL)0.25μL。反應程序如前面(同步驟3))。瓊脂糖電泳顯示PCR結果，有PCR產物且產物DNA片段與用于克隆連接的外源DNA片段大小相同的為陽性克隆。
4)質粒提取。從擴增到目的片段的陽性克隆中挑取一個單菌落接種于5mL LB(氨芐青霉素，50ug/ml)，37℃，過夜培養(yǎng)。次日，12000g，10min離心，收集細胞。用堿法提取質粒，質粒經EcoRI、BamHI酶切消化，10μL體系質粒4μL，H2O4μL，BamHI緩沖液1μL，酶各0.5μL。再次驗證是否有外源片段插入。
5)測序。重組質粒序列由上海生工測定。再在www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)上比對，通過比對，驗正分析其序列的正確性，得到的質粒命名為pMD18-THase。
5、再用BamHI和EcoRI酶對pMD18-THase和酵母表達質粒pYES2(大連寶生物公司產)進行30℃(同4、第4)步)酶切，體系如前。表達質粒pYES2酶切后用磷酸酯酶(CIP)進行脫5’-P處理，再進行連接，體系方法如前(同克隆測序中1)。構建重組pYES2-Hase質粒，用CaCL2法轉化(同前4、第2)步)至JM109感受態(tài)細胞。通過PCR、酶切和測序驗正其連接的正確性。
宿主菌為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，將pYES2-Hase質粒轉化至釀酒酵母，進行重組Sc-Hase工程菌株的構建與篩選。用LiAc法轉化至釀酒酵母。方法如下接種釀酒酵母于10ml液體酵母蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基YPD(酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％)，再30℃進行振蕩培養(yǎng)過夜(12-16小時)，使?jié)舛冗_5×106細胞/mL，再接種到50ml液體YPD，30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至2×107細胞/mL，2500rpm離心5min，棄培養(yǎng)液，收集細胞懸浮于25mL無菌水中，離心收集細胞懸浮于0.5mL的100mmol/L的LiAc(醋酸鋰)中，取50μL到離心管中離心沉淀細胞去LiAc，加入轉化混合液(PEG聚乙二醇(50％W/V)240μL，1.0mol/L的LiAc36μL，變性鮭魚精DNA(2g/L)25μL，pYES2-Hase質粒DNA0.3μg，加水至50μL，振蕩反應管使細胞完全混勻，30℃保溫30min，42℃水浴熱激25min)，6000-8000rpm離心15s，用微量移液器除去上清液；吸取0.2-1.0ml無菌水加到每個反應管中，輕輕懸浮沉淀；用等份的200μL轉化混合液涂SC-U
平板。30℃培養(yǎng)，至轉化子出現(xiàn)。PCR法檢測尿嘧啶原養(yǎng)型轉化子，正確的重組酵母菌命名為Sc-Hase。
6、用纖維素酶DNS酶活力測定方法測定纖維素酶的活性，以及酒精發(fā)酵的對比實驗，以玉米粉為原料進行酒精發(fā)酵，Sc-Hase的酒精產出率高于沒有轉入纖維素酶基因的釀酒酵母的15-25％。
本發(fā)明從動物中通過RT-PCR獲得纖維素酶基因，再利用分子生物學技術和方法，用載體將此基因融合到釀酒酵母基因組中，使纖維素酶消解細胞壁纖維素轉化為糖，也由于細胞壁的消解，可進一步充分利用細胞內的淀粉糖化，提高酒精轉化率，可提高酒精產出率15-25％。
權利要求
1.一種構建轉纖維素酶基因釀酒酵母的方法，其特征在于該方法包括如下步驟--從動物中獲得纖維素酶基因；--利用載體將此基因融合到釀酒酵母基因組中。
2.根據(jù)權利要求1所述構建轉纖維素酶基因釀酒酵母的方法，其特征在于具體步驟包括--提取福壽螺的總mRNA；--進行反轉錄合成cDNA；--再通過PCR擴增出福壽螺纖維素酶基因；--PCR產物的回收用Agarose Gel DNA Extraction Kit回收目標帶，該纖維素酶基因片斷命名為Hase；--進行克隆和測序(1)連接反應，在PCR擴增的過程中，TaqDNA聚合酶具有在雙鏈DNA 3末端加上一個非模板來源的核苷酸A的特性，使擴增產物具有A突出末端；將PCR產物與含有T末端的pMD18-T載體連接，完成PCR產物的克??；(2)感受態(tài)細胞的制備與轉化采用CaCL2法制備感受態(tài)細胞；(3)陽性克隆的篩選用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG對克隆進行初步篩選；(4)質粒提取從陽性克隆中取一個單菌落接種于5mL LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素，50ug/ml)，37℃，培養(yǎng)12-16小時；12000r/min離心，收集細胞；用堿法提取質粒，質粒經EcoRI、BamHI酶切消化，10μL酶切體系質粒4μL，H2O 4μL，BamHI緩沖液1μL，酶EcoRI、BamHI各0.5μL；再次驗證是否有外源片段插入；(5)測序重組質粒序列經測序；再經過序列比對，驗正分析其序列的正確性，得到的質粒命名為pMD18-THase；--用BamHI和EcoRI酶對pMD18-THase和酵母表達質粒pYES2進行30℃酶切；--表達質粒pYES2酶切后用磷酸酯酶(CIP)進行脫5’-P處理，再進行連接；--構建重組pYES2-Hase質粒，用氯化鈣法轉化至JM109感受態(tài)細胞；--宿主菌為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，將pYES2-Hase質粒轉化至釀酒酵母菌株，進行重組Sc-Hase工程菌株的構建與篩選；通過PCR、酶切和測序檢測，正確的重組酵母菌命名為Sc-Hase。
全文摘要
本發(fā)明公開一種構建轉纖維素酶基因釀酒酵母的方法，該方法包括如下步驟從動物中獲得纖維素酶基因；利用載體將此基因融合到釀酒酵母基因組中。本發(fā)明對纖維素酶基因的序列設計引物，根據(jù)已經報道的福壽螺纖維素酶基因序列，按照一般引物設計原則，以編碼區(qū)為模板設計引物，引物兩端帶有本序列中沒有BamHI和EcoRI的酶切位點。先合成cDNA第一鏈，再以cDNA為模板用上游引物和下游引物將全長福壽螺纖維素酶基因編碼區(qū)序列擴增出來，克隆測序，再酶切與表達載體連接，再轉化到表達宿主釀酒酵母中。它具有發(fā)酵反應穩(wěn)定，周期短，酒精產出率高的優(yōu)點，可提高酒精產出率15－25％。因而，可有效降低釀酒成本。
文檔編號C12N15/56GK101058794SQ20071007837
公開日2007年10月24日 申請日期2007年4月9日 優(yōu)先權日2007年4月9日
發(fā)明者王萬能 申請人:重慶工學院