特異性結(jié)合dock8基因片段的探針、檢測dock8突變情況的試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因片段突變檢測領(lǐng)域，特別涉及特異性結(jié)合DOCK8基因片段的探針、檢測DOCK8突變情況的試劑盒及方法。該特異性結(jié)合DOCK8基因片段的探針的序列如SEQ?ID?NO：1所示。本發(fā)明提供的特異性結(jié)合DOCK8基因片段的探針能夠特異性結(jié)合DOCK8基因片段；本發(fā)明提供的檢測方法能夠準(zhǔn)確檢測DOCK8基因有無突變情況，并對突變進(jìn)行準(zhǔn)確定位。該方法不僅能篩查點突變，還能準(zhǔn)確檢測大片段缺失突變，操作簡單，耗時短，外顯子捕獲率可達(dá)100％。
【專利說明】特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探針、檢測D0CK8突變情況的 試劑盒及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因片段突變檢測領(lǐng)域，特別涉及特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探 針、檢測D0CK8突變情況的試劑盒及方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 高IgE綜合征（HIES ;或Job's綜合征）是一類以反復(fù)的皮膚和肺部感染、濕疹、 血清IgE水平顯著升高和嗜酸性粒細(xì)胞增多為特征的原發(fā)性聯(lián)合免疫缺陷病。根據(jù)遺傳 方式的不同，HIES分為兩類，包括常染色體顯性遺傳 HIES(AD-HIES)和常染色體隱性遺傳 HIES (AR-HIES)。
[0003] AD-HIES患者的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，但其臨床表現(xiàn)均有以下4個共性：①出生時或 生后不久即開始出現(xiàn)頑固性濕疹樣皮炎；②血清IgE水平顯著增高；③外周血嗜酸性粒細(xì) 胞增高；④反復(fù)發(fā)作的皮膚或肺膿腫。HIES的感染主要在皮膚和肺，皮膚膿腫因無通常所 見的紅、腫、痛，因而又稱之為"冷膿腫"，主要致病菌為金黃色葡萄球菌，也可為肺炎球菌、 流感嗜血桿菌及假單胞菌等。反復(fù)肺部感染可導(dǎo)致肺組織破壞而形成肺膨出、肺囊腫和支 氣管擴(kuò)張等病癥。肺實質(zhì)的損害導(dǎo)致患者易患慢性和機(jī)會性感染，包括曲霉菌屬、綠膿桿 菌、卡氏肺囊蟲以及非典型分枝桿菌感染等。曲霉菌屬與綠膿桿菌反復(fù)感染是HIES患者死 亡的主要病因，故應(yīng)引起足夠重視?；純阂话銦o其他過敏表現(xiàn)，如過敏性鼻炎、蕁麻疹、哮 喘。AD-HIES患者還可有免疫系統(tǒng)外的表現(xiàn)：特殊面容（前額突出、寬鼻梁、面部不對稱、眼 窩深陷及雙側(cè)外眥眼距增寬）、易骨折（微小創(chuàng)傷即可引起）、脊柱側(cè)彎、關(guān)節(jié)過伸、乳牙脫 落延遲及血小板增高等。目前研究認(rèn)為，AD-HIES多為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3 (signal transducers and activators of transcription, STAT3)基因突變所致。STAT3 是一種轉(zhuǎn)錄 因子，可被多種細(xì)胞因子和生長因子激活，包括IL-6、IL-10、IL-22、IL-23及巨噬細(xì)胞集落 刺激因子。AD-HIES中STAT3突變干擾以上細(xì)胞因子激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而導(dǎo)致免疫反 應(yīng)的改變。
[0004] AR-HIES患者可與AD-HIES患者有相似的表現(xiàn)，如嚴(yán)重的特應(yīng)性皮炎樣皮疹，特 應(yīng)性皮炎樣皮疹通常為首發(fā)表現(xiàn)，幾乎所有HIES患者在嬰幼兒時期均可發(fā)生；反復(fù)細(xì)菌感 染，如肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等；血嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)及血清IgE增高?；颊咄ǔ０橛?嚴(yán)重的過敏性疾病，如哮喘以及對食物和環(huán)境過敏原過敏等。由于AR-HIES可合并聯(lián)合免 疫缺陷，因此患者可反復(fù)發(fā)生頑固的病毒感染，并可能早期并發(fā)惡性腫瘤。嚴(yán)重慢性皮膚 病毒感染是AR-HIES的顯著特征，累及約90% AR-HIES患者。較常見的病毒為單純皰疹病 毒（herpes simplex virus，HSV)、人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV)、巨細(xì)胞病 毒（molluscum contagiosum virus, MCV)及水痘帶狀皰疫病毒（varicella-zostervirus, VZV)。此外，約半數(shù)的患者發(fā)生皮膚黏膜念珠菌感染；少數(shù)患者因感染或血管病變發(fā)生 嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，如偏癱、缺血性梗死等。此型HIES僅累及免疫系統(tǒng)，而不出現(xiàn) 骨骼、牙齒及結(jié)締組織病變。多數(shù)AR-HIES患者為胞質(zhì)分裂專一物8蛋白（dedicator of cytokinesis 8 protein，DOCKS)基因突變，AR-HIES患者中DOCKS缺失可引起T淋巴細(xì)胞 和Β淋巴細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷，從而導(dǎo)致患者對病毒感染的抵抗力大大減弱。
[0005] D0CK8 (Dedicator of cytokinesis 8)基因定位于 9ρ24· 3,信使 RNA(mRNA)有 3 種 異構(gòu)體，包括46-48個外顯子，超過250kb的基因序列，編碼1999-2099個氨基酸約239kDa 的D0CK8蛋白?？截悢?shù)變異（Copy Number Variations, CNV)在D0CK8基因中廣泛存在，研 究發(fā)現(xiàn)，D0CK8基因突變不僅有點突變，還有大片段缺失突變，且發(fā)生頻率較高，導(dǎo)致D0CK8 蛋白微量表達(dá)或不表達(dá)，從而罹患高IgE綜合征。另外，還有報道稱在D0CK8基因發(fā)生大片 段缺失時患者可能會出現(xiàn)精神發(fā)育遲滯及發(fā)育障礙。因此，對于D0CK8基因的檢測具有重 要的臨床意義。目前，檢測基因缺失突變的方法主要包括sanger測序法、高分辨率寡核苷 酸微矩陣比較基因組雜交法。
[0006] sanger測序法的檢測原理為：提取DNA或RNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物使用一代 測序儀進(jìn)行測序，得到峰圖進(jìn)行比對。具體步驟為：提取DNA后，利用一種DNA聚合酶來延 伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一 套四個單獨的反應(yīng)構(gòu)成，每個反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸（dNTP)，并混入限量的 一種不同的雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-0H基團(tuán)，使延長 的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一 種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn) 物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳 分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測。聚 合酶用模板作指導(dǎo)，不斷地將dNTP加到引物的3'-0H末端，使引物延伸，合成出新的互補(bǔ) DNA鏈。如果加入一種特殊核苷酸，雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP)，因它在脫氧核糖的3'位置 缺少一個羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵。如存在ddCTP、dCTP和三種其他的 dNTP (其中一種為α-32Ρ標(biāo)記）的情況下，將引物、模板和DNA聚合酶一起保溫，即可形成 一種全部具有相同的5' -引物端和以ddC殘基為3'端結(jié)尾的一系列長短不一片段的混合 物。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離制得的放射性自顯影區(qū)帶圖譜將為新合成的不同長度 的DNA鏈中C的分布提供準(zhǔn)確信息，從而將全部C的位置確定下來。類似的方法，在ddATP、 ddGTP和ddTTP存在的條件下，可同時制得分別以ddA、ddG和ddT殘基為3 '端結(jié)尾的三組 長短不一的片段。將制得的四組混合物平行地點加在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳板上進(jìn)行電 泳，每組制品中的各個組分將按其鏈長的不同得到分離，制得相應(yīng)的放射性自顯影圖譜。從 所得圖譜即可直接讀得DNA的堿基序列。但sanger測序法只能用于篩查點突變，無法檢測 大片段缺失突變，而且由于D0CK8基因序列較長，篩查點突變非常耗時，且不夠準(zhǔn)確。
[0007] 高分辨率寡核苷酸微矩陣比較基因組雜交法的檢測原理為：采用高分辨率全基因 組微陣列比較基因組雜交芯片進(jìn)行檢測后掃描分析雜交結(jié)果，對檢測出的基因組拷貝數(shù)變 化用FISH、定量PCR或MLPA進(jìn)行驗證；鑒定并記錄相關(guān)的基因組拷貝數(shù)變化。具體步驟為： 樣本制備：使用Rsal和Alul限制性內(nèi)切酶（Promega)處理基因組DNA(2-3y g)制備待檢 樣本DNA ;標(biāo)記：隨機(jī)運用cyanine-5-dUTP或青藍(lán)3-dUTP對處理過的DNA進(jìn)行標(biāo)記，再使 用安捷倫的標(biāo)簽設(shè)備設(shè)標(biāo)；純化：Vivaspin500進(jìn)行純化（Sartorius Stedim);雜交：使用 安捷倫aCGH雜交工具包。樣本于65°C渦旋40小時。在室溫用0. 5父33(：(20\33(：含3皿氯 化鈉，0· 3M 檸檬酸鈉的 pH 值 7. 0)和(λ 005% Triton x-102(Sigma-Aldrich)清洗 5 分鐘， 然后用0· 1XSSC和0.005% Triton X- 102于37°C清洗5分鐘；使用Agilent掃描，數(shù)據(jù)提 取和分析均使用Agilent軟件，即安捷倫的特有分析儀10. 1. 1. 1和DNA分析4. 0軟件包。 缺失采用基因組Variants Build36的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。雖然高分辨率寡核苷酸微矩陣比較 基因組雜交法可以檢測大片段缺失，但費用較高，耗時較長。
[0008] 由于采用Sanger測序法和高分辨率寡核苷酸微矩陣比較基因組雜交法檢測 D0CK8大片段缺失突變情況均存在一定的缺陷，因此提供一種可準(zhǔn)確檢測D0CK8大片段缺 失突變情況的方法，具有重要的現(xiàn)實意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 有鑒于此，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探針、檢測D0CK8突變情況 的試劑盒及方法。該檢測方法能夠準(zhǔn)備檢測D0CK8突變位置，操作簡單，耗時短，外顯子捕 猶率超過90 *%，最商可達(dá)100 。
[0010] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0011] 本發(fā)明提供了一種特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探針，探針的序列如SEQ ID N0 :1 所示。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種檢測D0CK8突變情況的試劑盒，包括特異性結(jié)合D0CK8基因 片段的探針和親和素標(biāo)記的磁珠；該特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探針的序列如SEQ ID NO :1所示。
[0013] 親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個亞單位組 成，對生物素有非常高的親和力。生物素很易與蛋白質(zhì)（如抗體等）以共價鍵結(jié)合。
[0014] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探針采用生物素標(biāo) 記。
[0015] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，親和素為鏈霉親和素。
[0016] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，本發(fā)明提供的試劑盒還包括D0CK8基因未突變的 血液。
[0017] 作為優(yōu)選，D0CK8基因未突變的血液為健康人的血液。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種非診斷目的檢測D0CK8突變情況的方法，包括如下步驟：
[0019] 取待測樣本，提取全基因組DNA，富集D0CK8基因片段；
[0020] 對D0CK8基因片段測序，形成BAM文件；
[0021] 對BAM文件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，排除SNP(單核苷酸多態(tài)性，single nucleotide polymorphism)，分析插入與缺失情況，檢測待測樣本的D0CK8突變情況；
[0022] 所述待測樣本的D0CK8基因大片段的測序深度減少至50%，所述待測樣本的 D0CK8突變情況為大片段雜合缺失；
[0023] 所述待測樣本的D0CK8基因大片段的測序深度減少至0 %?1 %，所述待測樣本的 D0CK8突變情況為大片段純合缺失；
[0024] 所述待測樣本的D0CK8單個堿基的測序深度減少至50%，所述待測樣本的D0CK8 突變情況為單個堿基雜合缺失；
[0025] 所述待測樣本的D0CK8單個堿基的測序深度減少至0%?1%，所述待測樣本的 D0CK8突變情況為單個堿基純合缺失；
[0026] 所述待測樣本的D0CK8單個堿基發(fā)生改變，該單個堿基的測序深度減少至50% (改變了的堿基測序深度達(dá)50% )，所述待測樣本的D0CK8突變情況為單個堿基雜合突變；
[0027] 所述待測樣本的D0CK8單個堿基發(fā)生改變，該單個堿基的測序深度減少至0%? 1% (改變了的堿基測序深度達(dá)99%?100% )，所述待測樣本的D0CK8突變情況為單個堿 基純合突變。
[0028] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，富集D0CK8基因片段具體為：取特異性結(jié)合D0CK8 基因片段的探針與全基因組DNA雜交，再與親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，經(jīng)洗提、擴(kuò)增；
[0029] 特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探針的序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0030] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，富集D0CK8基因片段過程具體為：
[0031] DNA與生物素化探針混合，進(jìn)行PCR，PCR程序為：95°C，7min，65°C，2min ;
[0032] 加入雜交緩沖液，60°C?70°C加熱20?24小時；
[0033] 作為優(yōu)選，65°C加熱22小時；
[0034] 1 X binding緩沖液清洗MyOne磁珠，將清洗后的磁珠加入到上述混合物混勻，孵 育10?15分鐘；
[0035] 使用磁鐵分離生物素化的DNA，WB1緩沖液室溫清洗15分鐘，WB3緩沖液在65°C清 洗三次，每次15分鐘，然后對洗脫下來的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。
[0036] 在富集D0CK8基因片段過程中，擴(kuò)增的程序具體為：①98°C預(yù)變性30s ;②98°C變 性25s，65°C退火30s，72°C延伸30s ;循環(huán)15次；③72°C延伸5min。
[0037] 本發(fā)明的檢測原理為：首先富集DOCKS基因片段，然后采用測序技術(shù)獲得BAM文 件，獲取生物學(xué)信息，排除SNP，分析插入與缺失情況，獲得D0CK8基因突變情況。
[0038] 其中，富集D0CK8基因片段具體為：特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探針與全基因組 DNA雜交，獲得目標(biāo)基因組DNA-探針雜交復(fù)合物，探針采用生物素標(biāo)記，通過生物素與親和 素之間的相互作用，目標(biāo)基因組DNA-生物素化探針雜交復(fù)合物再與親和素磁珠結(jié)合，獲得 目標(biāo)基因組DNA-生物素化探針-親和素磁珠復(fù)合物，經(jīng)洗提、擴(kuò)增，獲得D0CK8基因片段。
[0039] 排除SNP流程為：獲取原始短序列；去除測序數(shù)據(jù)中的接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)等；把短 序列定位到人類基因組數(shù)據(jù)相應(yīng)的位置上，統(tǒng)計測序結(jié)果信息，短序列數(shù)量、目標(biāo)區(qū)域覆蓋 大小、平均測序深度等；在目標(biāo)區(qū)域找出位點的基因型，過濾低質(zhì)量值（質(zhì)量值> =20)和 低覆蓋度（深度> =10)的SNP ;利用（XDS (-致序列）、人類基因組數(shù)據(jù)庫（NCBI36. 3)、 dbSNP(vl30)信息對SNP進(jìn)行注釋，確定突變位點發(fā)生的基因、坐標(biāo)、mRNA位點、氨基酸改 變、SNP功能、SIFT預(yù)測SNP影響蛋白功能預(yù)測等；根據(jù)疾病樣品和正常樣品信息，選出疾 病樣品所共有的而在正常組中不存在的SNP作為候選的SNPs，在候選的SNPs中去除掉在 dbSNP、HAPMAP、1000人類基因組、其他外顯子測序項目中出現(xiàn)的SNP。同時，過濾掉SIFT預(yù) 測對蛋白功能無影響的SNPs作為最后疾病相關(guān)的候選SNPs。
[0040] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，排除SNP具體為：獲取原始短序列；去除測序數(shù) 據(jù)中的接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)等；把短序列用SOAPaligner軟件定位到人類基因組數(shù)據(jù)相應(yīng) 的位置上，所用到參數(shù)：soap2. 20-a-b-t-v3-142-s63-ml00-x400,統(tǒng)計測序結(jié)果信息，短 序列數(shù)量、目標(biāo)區(qū)域覆蓋大小、平均測序深度等；SOAPsnp用于在目標(biāo)區(qū)域找出位點的基因 型，所用到參數(shù)：soapsnp-i_d-〇-r0· 00005-e0. 0001-M-t-u-L-s_2T，過濾低質(zhì)量值（質(zhì)量 值> =20)和低覆蓋度（深度> =10)的SNP ;利用CCDS、人類基因組數(shù)據(jù)庫（NCBI36. 3)、 dbSNP(vl30)信息對SNP進(jìn)行注釋，確定突變位點發(fā)生的基因、坐標(biāo)、mRNA位點、氨基酸改 變、SNP功能（錯義突變/無義突變/可變剪切位點）、SIFT預(yù)測SNP影響蛋白功能預(yù)測等； 根據(jù)疾病樣品和正常樣品信息，選出疾病樣品所共有的而在正常組中不存在的SNP作為候 選的SNPs，在候選的SNPs中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人類基因組、其他外顯子測序項 目中出現(xiàn)的SNP。同時，過濾掉SIFT預(yù)測對蛋白功能無影響的SNPs作為最后疾病相關(guān)的候 選 SNPs。
[0041] 分析插入與缺失情況流程為：把去除接頭序列和低質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)比對到人類基 因組上；找出序列中所含有的插入/缺失（InDel)的信息；利用(XDS、人類基因組數(shù)據(jù)庫 (NCBI36. 3)、dbSNP(vl30)信息對InDel進(jìn)行注釋，確定突變位點發(fā)生的基因、坐標(biāo)、mRNA位 點、編碼區(qū)域序列的改變、對氨基酸的影響、InDel功能。
[0042] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，分析插入與缺失情況分析流程具體為：把去除接 頭序列和低質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)用Burrows-Wheeler Aligner (BWA)比對到人類基因組上，所 用到參數(shù)：bwa aln-L-131-il〇-k2-t7-e40 ;用GATK軟件找出序列中所含有的插入/缺失 (InDel)的信息；利用CCDS、人類基因組數(shù)據(jù)庫（NCBI36. 3)、dbSNP(vl30)信息對InDel進(jìn) 行注釋，確定突變位點發(fā)生的基因、坐標(biāo)、mRNA位點、編碼區(qū)域序列的改變、對氨基酸的影 響、InDel功能（氨基酸插入/氨基酸缺失/移碼突變）。
[0043] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，雜交的溫度為60?70°C，所述雜交的時間為20? 24小時。
[0044] 作為優(yōu)選，雜交的溫度為65°C，雜交的時間為22小時。
[0045] 作為優(yōu)選，測序采用的方法為二代測序技術(shù)。
[0046] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探針采用生物素標(biāo) 記。
[0047] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，親和素為鏈霉親和素。
[0048] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，本發(fā)明提供的檢測方法還包括：取D0CK8基因未 突變的血液作為陽性對照，按照上述方法形成BAM文件，并對其進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
[0049] 取D0CK8基因未突變的血液作為陽性對照，按照上述方法形成BAM文件，并對其 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，具體為：取D0CK8基因未突變的血液，提取全基因組DNA，富集D0CK8基因片 段；對D0CK8基因片段測序，形成BAM文件；對BAM文件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，排除SNP。
[0050] 設(shè)置D0CK8基因未突變的血液作為陽性對照的目的為：（1)檢測血液樣本是否為 D0CK8基因突變血液；（2)檢測鑒定方法的準(zhǔn)確性；（3)檢測目標(biāo)區(qū)域捕獲的效率。
[0051] 本發(fā)明提供了特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探針、檢測D0CK8突變情況的試劑盒 及方法。該特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探針的序列如SEQ ID N0 :1所示。本發(fā)明提供的 探針能夠特異性結(jié)合D0CK8基因片段；本發(fā)明提供的檢測方法能夠準(zhǔn)確檢測D0CK8基因有 無突變情況，并對突變進(jìn)行準(zhǔn)確定位。該方法不僅能篩查點突變，還能準(zhǔn)確檢測大片段缺失 突變，操作簡單，耗時短，外顯子捕獲率超過90 %，最高可達(dá)100 %。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0052] 圖1示實施例1中D0CK8大片段缺失突變患者血液的分析結(jié)果圖；其中，橫坐標(biāo)表 示1至48個外顯子；縱坐標(biāo)表示測序深度；
[0053] 圖2示實施例2中健康者血液的分析結(jié)果圖；其中，橫坐標(biāo)表示1至48個外顯子； 縱坐標(biāo)表示測序深度。

【具體實施方式】
[0054] 本發(fā)明公開了特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探針、檢測D0CK8突變情況的試劑盒 及方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是， 所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā) 明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā) 明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng) 用本發(fā)明技術(shù)。
[0055] 說明書和權(quán)利要求書中所使用的縮寫具體含義如下：
[0056] 縮寫及英文 含義 CCDS 氨基酸數(shù)據(jù)庫 dbSNP SNP數(shù)據(jù)庫 HAPMAP 基因組單體型圖 AW1 A型洗滌劑1號 AW2 A型洗滌劑2號 WB1 洗滌劑1號 WB3 洗滌劑2號
[0057] 本發(fā)明提供的特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探針、檢測D0CK8突變情況的試劑 盒及方法中所用試劑、磁珠等均可由市場購得。其中，DNA提取試劑盒（QIAamp DNABlood Midi Kit)購自qiagen公司，貨號51185 ;液相捕獲試劑購自美國生命技術(shù)公司（Life Technologies),其中包括試劑：
[0058] Binding and washing (B&ff) Buffer (2 X) ： lOmM Tris-HCl (pH7. 5), ImM EDTA, 2M NaCl (結(jié)合劑和洗滌劑（B&W)緩沖液（2X) :10mM Tris-鹽酸（pH7. 5)，ImM乙二胺四乙酸， 2Mol/L氯化鈉）；
[0059] Solution A :DEPC-treated0. 1M NaOH，DEPC-treatedO. 05M NaCl (試劑 A :DEPC-含 〇· 1M氫氧化鈉，DEPC-含0· 05M氯化鈉）；
[0060] Solution B :DEPC-treated0. 1M NaCl (試劑 B :DEPC-含 0· 1M 氯化鈉）；
[0061] PBS buffer ρΗ7· 4 (PBS 緩沖液 ρΗ7· 4);
[0062] PBS/BSA(PBS，ρΗ7· 4containing0. 01% [w/v]BSA) (PBS/BSA(PBS，ρΗ7· 4 含 0· 01%
[w/v]牛血清白蛋白））；
[0063] PBST (PBS ρΗ7· 4containing0. 01 % [v/v] Tween-20 (PBST (PBS ρΗ7· 4 含 0· 01 % [v/ v] Tween-20)〇
[0064] 下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0065] 實施例1特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探針的制備
[0066] 采用常規(guī)方法合成特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探針，其序列如SEQ ID NO :1所 示，采用生物素進(jìn)行標(biāo)記。
[0067] 實施例2檢測D0CK8突變情況的試劑盒的制備
[0068] 取實施例1制得的特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探針，與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠 (MyOne磁珠）、購自美國生命技術(shù)公司的液相捕獲試劑組裝成檢測D0CK8突變情況的試劑 盒。
[0069] 實施例3檢測D0CK8突變情況的試劑盒的制備
[0070] 取實施例1制得的特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探針，與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠、 購自美國生命技術(shù)公司的液相捕獲試劑以及D0CK8基因未突變的血液（健康人的血液）組 裝成檢測D0CK8突變情況的試劑盒。
[0071] 實施例4 D0CK8突變情況的檢測
[0072] 采用高分辨率寡核苷酸微矩陣比較基因組雜交法檢測臨床血液樣本，篩選出 D0CK8大片段缺失突變患者的血液，該D0CK8大片段缺失突變患者的血液的檢測結(jié)果為：11 號外顯子純和缺失，12-33號外顯子雜合缺失。
[0073] 取上述篩選出的D0CK8大片段缺失突變患者的血液，使用DNA提取試劑盒提取 全基因組DNA，具體操作流程為：吸取200 μ L protease (蛋白酶）于15mL離心管內(nèi)；加入 l-2mL全血，混勻；加入2. 4mL Buffer AL，充分混勻；70°C水浴10分鐘；加入2mL無水乙醇， 混勻；將所得液體移入試劑盒提供的離心管離心柱中，3000rpm，3分鐘；棄濾液后加入2mL AW1，5000rpm，1分鐘；加入2mL AW2, 5000rpm，15min ;將離心柱移入干凈的15mL離心管中加 入300 μ L Buffer AE，室溫放5分鐘，5000rpm，2分鐘。將離心所得液體-20°C保存，即得全 基因組DNA文庫。
[0074] 根據(jù)核酸分子中的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)在λ = 260nm處有最大吸收值，采用紫外分光 光度法測定核酸的含量。1 μ g/mL的DNA溶液的A260nm吸收值為0. 020,1 μ g/mL的RNA溶 液的A260nm吸收值為0. 022,以此為標(biāo)準(zhǔn)，可測得溶液中的核酸含量。經(jīng)檢測，D0CK8大片段 缺失突變患者的血液和健康者的血液的全基因組DNA文庫的核酸含量均為為10?40 μ g。
[0075] 取上述制得的全基因組DNA文庫，采用實施例2制得的試劑盒捕獲DOCKS基因片 段，具體操作方法為：取上述制得的全基因組DNA文庫（DNA庫）與生物素化的探針（序列 如SEQ ID N0 :1所示）混合，進(jìn)行PCR，具體程序為：95°C，7min ;65°C，2min。加入雜交緩沖 液[Binding and washing(B&W)Buffer (2X)]，60 ?70°C加熱 20 ?24 小時。1 Xbinding 緩沖液清洗MyOne磁珠，將磁珠加入上述混合物混勻，進(jìn)行孵育10-15分鐘。使用磁鐵分離 生物素化的DNA，WB1緩沖液室溫清洗15分鐘，WB3緩沖液在65°C清洗三次，每次15分鐘， 然后將洗脫下來的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，具體程序為：①98°C預(yù)變性30s ;②98°C變性25s，65°C退 火30s，72°C延伸30s ;循環(huán)15次；③72°C延伸5min。即可獲得目標(biāo)基因片段D0CK8基因， 外顯子捕獲率為100%。
[0076] 采用二代測序技術(shù)對獲得的目標(biāo)基因片段D0CK8基因進(jìn)行測序，形成BAM文件，形 成生物學(xué)信息，排除SNP，分析插入與缺失（InDel)等突變情況，最終確定突變位點。SNP分 析流程和InDel分析流程具體如下：
[0077] SNP分析流程具體為：獲取原始短序列；去除測序數(shù)據(jù)中的接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)等； 把短序列用SOAPaligner軟件定位到人類基因組數(shù)據(jù)相應(yīng)的位置上，所用到參數(shù) ：S〇ap2. 20-a-b-t-v3-142-s63-ml00-x400,統(tǒng)計測序結(jié)果信息，短序列數(shù)量、目標(biāo)區(qū)域覆蓋大小、平 均測序深度等；SOAPsnp用于在目標(biāo)區(qū)域找出位點的基因型，所用到參數(shù)：S〇apsnp-i-d-〇-rO. 00005-e0. 0001-M-t-u-L-s-2T，過濾低質(zhì)量值（質(zhì)量值> =20)和低覆蓋度（深度> = 10)的SNP ;利用CCDS、人類基因組數(shù)據(jù)庫（NCBI36. 3)、dbSNP(vl30)信息對SNP進(jìn)行注釋， 確定突變位點發(fā)生的基因、坐標(biāo)、mRNA位點、氨基酸改變、SNP功能（錯義突變/無義突變/ 可變剪切位點）、SIFT預(yù)測SNP影響蛋白功能預(yù)測等；根據(jù)疾病樣品和正常樣品信息，選出 疾病樣品所共有的而在正常組中不存在的SNP作為候選的SNPs，在候選的SNPs中去除掉在 dbSNP、HAPMAP、1000人類基因組、其他外顯子測序項目中出現(xiàn)的SNP。同時，過濾掉SIFT預(yù) 測對蛋白功能無影響的SNPs作為最后疾病相關(guān)的候選SNPs。
[0078] InDel分析流程具體為：把去除接頭序列和低質(zhì)量的測序數(shù)據(jù) 用Burrows-Wheeler Aligner (BWA)比對到人類基因組上，所用到參數(shù)：bwa aln-L-131-il〇-k2-t7-e40 ;用GATK軟件找出序列中所含有的插入/缺失（InDel)的信息； 利用（XDS、人類基因組數(shù)據(jù)庫（NCBI36. 3)、dbSNP(vl30)信息對InDel進(jìn)行注釋，確定突變 位點發(fā)生的基因、坐標(biāo)、mRNA位點、編碼區(qū)域序列的改變、對氨基酸的影響、InDel功能（氨 基酸插入/氨基酸缺失/移碼突變）。
[0079] 試驗結(jié)果如圖1所示。
[0080] 由圖1可知，D0CK8大片段缺失突變患者的檢測結(jié)果顯示在11號外顯子處（在9 號染色體上位置：334225-334384)測序深度出現(xiàn)下降至0,為大片段純和缺失，12號至33 號外顯子處（在9號染色體上位置：336582-422135)測序深度出現(xiàn)下降，下降50%，為大片 段雜合缺失。另外，還檢測到1個可疑突變位點，見表1。此檢測結(jié)果與高分辨率寡核苷酸 微矩陣比較基因組雜交法的檢測結(jié)果一致。
[0081] 表1可疑突變位點信息
[0082]

【權(quán)利要求】
1. 一種特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探針，其特征在于，所述特異性結(jié)合D0CK8基因片 段的探針的序列如SEQ ID NO :1所示。
2. -種檢測DOCKS突變情況的試劑盒，其特征在于，包括親和素標(biāo)記的磁珠和如權(quán)利 要求1所述的特異性結(jié)合DOCKS基因片段的探針。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針，其特征在于，所述特異性結(jié)合DOCKS基因片段的探針采 用生物素標(biāo)記。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述親和素為鏈霉親和素。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包括DOCKS基因未突變的血液。
6. -種非診斷目的檢測DOCKS突變情況的方法，其特征在于，包括如下步驟： 取待測樣本，提取全基因組DNA，富集D0CK8基因片段； 對所述DOCKS基因片段測序，形成BAM文件； 對所述BAM文件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，排除SNP，分析插入與缺失情況，檢測所述待測樣本的 D0CK8突變情況； 所述待測樣本的D0CK8基因大片段的測序深度減少至50%，所述待測樣本的D0CK8突 變情況為大片段雜合缺失； 所述待測樣本的DOCKS基因大片段的測序深度減少至0%?1%，所述待測樣本的 D0CK8突變情況為大片段純合缺失； 所述待測樣本的D0CK8單個堿基的測序深度減少至50%，所述待測樣本的D0CK8突變 情況為單個堿基雜合缺失； 所述待測樣本的D0CK8單個堿基的測序深度減少至0%?1%，所述待測樣本的D0CK8 突變情況為單個堿基純合缺失； 所述待測樣本的D0CK8單個堿基發(fā)生改變，所述單個堿基的測序深度減少至50 %，所 述待測樣本的D0CK8突變情況為單個堿基雜合突變； 所述待測樣本的D0CK8單個堿基發(fā)生改變，所述單個堿基的測序深度減少至0 %? 1 %，所述待測樣本的D0CK8突變情況為單個堿基純合突變。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述富集DOCKS基因片段具體為：取特異 性結(jié)合DOCKS基因片段的探針與所述全基因組DNA雜交，再與親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，經(jīng)洗 提、擴(kuò)增； 所述特異性結(jié)合D0CK8基因片段的探針如SEQ ID NO :1所示。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述雜交的溫度為60?70°C，所述雜交 的時間為20?24小時。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述測序采用的方法為二代測序技術(shù)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述特異性結(jié)合DOCKS基因片段的探針 采用生物素標(biāo)記。
11. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述親和素為鏈霉親和素。
12. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：取DOCKS基因未突變 的血液作為陽性對照，按照權(quán)利要求6所述的方法形成BAM文件，并對所述BAM文件進(jìn)行數(shù) 據(jù)分析，排除SNP。
【文檔編號】C12N15/11GK104059993SQ201410336687
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】趙曉東, 秦濤 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院